Abstract
Fundo
H. pylori Metodologia /principais conclusões sequências de aminoácidos de H. pylori ICD de H. pylori Citation:. Hussain MA, Naveed SA, Sechi LA, Ranjan S, Alvi Um, Ahmed I, et al. (2008) Isocitrato Desidrogenase de Helicobacter pylori Editor do Academic: Keertan Dheda, University College London, Reino Unido Recebido: 29 de agosto de 2007; Aceito: 24 de dezembro de 2007; Publicado: January 23, 2008 | Direitos de autor: © 2008 Hussain et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados Financiamento:. O financiamento do CDFD Núcleo Grants (Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia) CONFLITO dE iNTERESSES:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes Introdução Helicobacter pylori Uma das características mais distintivas da H. pylori Uma vez adquirida, a infecção persiste durante anos e, elicia respostas imunitárias detectáveis em pessoas infectadas [4], [5] caracterizada por um aumento dos níveis de IgG e IgA específicas no soro e aumento da secreção de IgM e de IgA no estômago [6]. Por conseguinte, os testes serológicos não-invasivos foram recomendadas e desenvolvido para o diagnóstico de H. pylori Atualmente, existem não houve qualquer antígeno único "padrão ouro", que pode ser usado de forma inequívoca em todas as populações. Uma das razões importantes para isso poderia ser a extraordinária diversidade presente no H. pylori genes de limpeza de H. pylori As proteínas que são liberados a partir de bactérias durante a fase de crescimento logarítmica tardia, tais como superóxido dismutase e isocitrato desidrogenase (ICD), são descrito como marcadores autólise [22] - [24] e alguns deles têm sido provado ser excelentes antigénios de diagnóstico. Por exemplo, o CDI de M. tuberculose Este estudo demonstra a interação do sistema imune do hospedeiro com H. pylori Resultados Na modelagem silico, expressão e purificação da proteína H. pylori ICD sequência de proteína do ICD de H. pylori a sobre-expresso de N-terminal marcado com His foi purificada para CID >. homogeneidade de 95% sobre uma coluna de afinidade de níquel (Figura 2). A massa molecular do CID recombinante foi determinada como sendo de 47 kDa. purificação da proteína foi realizada sob condições nativas com um rendimento de 2,0 mg de proteína por 500 ml de cultura inicial. humorais dirigidas contra o H. pylori Identificação e caracterização de alta imunogenicidade H. proteínas O significado de muitos proteínas imunogênicas de H. pylori A nossa análise usando ICD recombinante da H. pylori H. pylori Tendo mostrado que H. pylori Apesar de considerar uma possível reactividade cruzada de outras bactérias invasivas, tais como C. jejuni Finalmente, os resultados promissores foram obtidos em termos de respostas humorais significativos para a H. pylori Materiais e Métodos Em antigenicidade silico do previsto H. pylori ICD (HP0023) sequência de nucleótidos de H. pylori CID Modelagem computacional da estrutura ICD Usando Modeller-6, um programa de modelagem molecular que implementa uma abordagem automatizada. a modelagem da estrutura de proteínas comparativa pela satisfação de restrições espaciais [28] foi utilizado para determinar o modelo tridimensional do H. pylori Produção de H. pylori recombinante ICD A ORF correspondente a H. pylori CID A população de estudo ( n ELISA para as respostas humoral ELISA foi realizado para verificar a resposta imune humoral em humanos contra ICD recombinante. Resumidamente, as placas de microtitulação de 96 poços foram revestidas com -500 ng de proteína recombinante CID. As placas revestidas foram incubadas durante a noite a 4 ° C, lavadas três vezes com PBS-T (0,05% de Tween 20 em PBS 1 ×) e duas vezes com PBS. As placas foram então bloqueadas com 100 uL de tampão de bloqueio (2% de BSA em 1 x PBS) a 37 ° C durante 2 horas. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem com PBS-T e duas vezes com PBS. O H. pylori THP-1 células (monócitos humanos, ATCC TIB 202) foram cultivadas e mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com soro fetal bovino a 10%, glutamina 2 mM e solução a 1% de anti-bacteriana e anti-micótica (Gibco). Para macrófagos como etapa, cerca de 1 × 10 -6 células /poço foram diferenciadas com 5 ng /mL de forbol 12-miristato 13-C acetato (PMA, Sigma). Após 24 horas, as células foram lavadas uma vez com meio RPMI 1640 e estimuladas com 10 ng /ml de CID recombinante. Uma proteína pró-inflamatória, HP940, de H. pylori Agradecemos a Seyed E. Hasnain e Sharmistha Banerjee para as discussões. Agradecemos aos nossos colaboradores CM Habibullah e Barik A Salih para obter ajuda sobre o material do paciente e informações. Graças também são devido a Francis Megraud para fornecer várias amostras de soro controle. NA é o companheiro correspondente do Grupo Europeu de Estudo Helicobacter (EHSG).
provoca gastrite e úlceras pépticas e é um fator de risco para o desenvolvimento de carcinoma gástrico. Muitas das proteínas, tais como urease, porinas, flagelinas e toxinas tais como lipo-polissacarídeos, foram identificados como potenciais factores de virulência que induzem reacção pró-inflamatória. Relatamos potenciais imunogênicas de isocitrato desidrogenase (CID), uma importante proteína house keeping de H. pylori
.
CID foram submetidos a in silico
análise para as regiões com altos índices previsivelmente antigênicas. Além disso, a modelagem computacional do H. pylori
ICD como justaposto ao E. coli
CID foi realizado para determinar os níveis de estrutura de semelhança e a disponibilidade de motivos expostos à superfície, se houver alguma. O icd
gene foi clonado, expresso e purificado a um nível muito elevado de homogeneidade. resposta humoral dirigida contra H. pylori
CID foi detectado através de um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) em 82 sujeitos humanos que compreende de 58 pacientes com H. pylori
associada gastrite ou doença ulcerosa e 24 controlos saudáveis e assintomáticos. O H. pylori
ICD provocou potencialmente elevada resposta imune humoral e revelou títulos elevados de anticorpos no soro correspondentes a endoscopia-confirmou gastrite e úlcera assuntos doença. No entanto, ureia no ar expirado-teste amostras de controlo saudável negativas e amostras de controlo assintomáticos não revelou quaisquer respostas imunitárias detectáveis. O ELISA para a citocina pró-inflamatória IL-8 não apresenta qualquer actividade pró-inflamatória significativa do ICD.
Conclusões /Significado
é um imunogene que interactua com o sistema imunitário do hospedeiro subsequente para uma possível libertação autolítico e, assim, significativamente elicia respostas humorais em indivíduos com invasivo H. pylori
infecção. No entanto, ICD não poderia estimular significativamente a indução IL8 em uma linha celular de macrófagos cultivados (THP1) e, portanto, não pode ser um agente pró-inflamatório notável
Potencialmente Induz Humoral resposta imune em indivíduos com úlcera péptica e gastrite. PLoS ONE 3 (1): e1481. doi: 10.1371 /journal.pone.0001481
é uma bactéria Gram negativa bactéria, curvo que estabelece infecções crônicas no estômago humano. É um importante agente patogénico que é pensado para ter co-evoluiu com seres humanos [1], [2]. É habita cerca de metade da população mundial e é considerado como um factor de risco potencial para o desenvolvimento de adenocarcinoma gástrico [3]. H. pylori
é uma causa conhecida de gastrite crónica, úlcera péptica, carcinoma gástrico, e linfoma do tecido linfóide associado à mucosa (MALT). Vários mecanismos têm sido propostos para explicar o seu papel na patogénese do intestino. Apesar de altas taxas de colonização apenas um pequeno subconjunto de pessoas infectadas sofrem H. pylori
doenças -associated [2]. Associações de H. pylori jogue com fatores específicos da doença permaneceram mais ou menos enigmática, embora as sequências do genoma foram decifrados há quase uma década [2].
é a diversidade genética entre isolados clínicos obtidos a partir de diferentes populações de pacientes [3]. A reformulação do genoma é a norma com esta bactéria, criando, assim, uma grande quantidade de variação alélica e de fase [3], que levanta dificuldades no desenvolvimento de vacinas e diagnósticos.
infecção. Entre estes, o ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) é um dos métodos mais amplamente utilizados, uma vez que é relativamente barato, rápido, simples de realizar, e pode ser facilmente adoptado para o rastreio de grande número de amostras de [7]. Explorando para anti H. pylori
é muitas vezes prescrita antes da endoscopia ou antes de iniciar o tratamento. Embora, devido à memória imunológica, diagnóstico sorológico não pode ser preferido para verificar o sucesso ou o resultado do tratamento de erradicação, continua a ser uma escolha como um método sensível, provavelmente devido à sua natureza não-invasiva [8].
[9] - [13] e também a sua adaptação específica em diferentes hospedeiros [12], [13]. Embora as proteínas tais como a catalase, gro de El, e flagelina são fortemente imunogénica, que dão reacção cruzada não específicos com outras bactérias Gram-negativas e, mais particularmente, Campylobacter jejuni
[14], [15]. Em contraste, os antigénios de virulência ligados, tais como CagA ou VacA, mostram um nível bastante elevado de variabilidade de sequências, como existem H. pylori
cepas, que são geneticamente diversificada e fenotipicamente variável para um ou ambos os antígenos [16] - [18]. Apesar disso, as associações satisfatórios entre anticorpos séricos e doença invasiva foram descritos [19].
foram utilizados recentemente para controlar a migração das populações e verificou-se ser estável no genoma através séculos [20]. proteínas de arrumação no entanto, não foram testadas de um modo geral para a sua utilização em diagnóstico ou vacinas. As enzimas metabólicas parecem ser um bom candidato para ser incluído em um kit de teste de imuno-diagnóstico, uma vez que muitas vezes não reagem de forma cruzada com soros de controles saudáveis [21]. Além disso, devido à sua função de limpeza, eles são altamente conservadas entre os diferentes H. pylori
estirpes, independentemente dos seus genótipos e, portanto, pode servir como candidatos ideais imuno-diagnóstico.
tem sido descrito como um antigénio potencial de discriminar pacientes com tuberculose pulmonar a partir de controlos saudáveis [24]. No entanto, as comparações anteriores dos padrões antigênicos de H. pylori
proteínas (incluindo algumas das proteínas de limpeza) reconhecidos por soros paciente revelou nenhuma associação de específico H. pylori
antígenos com casos de especial patologia gastroduodenal [21].
ICD na forma de respostas humoral significativas observadas em indivíduos de doenças. Além disso, descrevemos H. antígeno pylori
ICD para distinguir pacientes com doença da úlcera e gastrite de indivíduos saudáveis não infectadas.
foi analisado para prever a sua imunogenicidade com base no índice antigénico, hidrofilicidade e probabilidade de superfície. mostra a Figura 1A In silico
perfis antigênicos de ICD gerados usando software Metamorfose (DNAStar Inc. EUA). Resumidamente, foram identificados vários traços correspondentes a motivos de aminoácidos imunor reactivos com índices mais altos previsivelmente antigénicos (~3.4). O H. pylori
ICD, portanto, exibido principais trechos antigênicas (Figura 1A) levando-nos a olhar para ele como uma proteína supostamente imunogênica. Os índices de antigenicidade de CDI foram comparáveis aos descritos na literatura para um antigénio PPE Rv2430c de origem micobacteriana, o qual foi ainda provado ser um antigénio imunodominante [25]. O E. coli
CID também foi analisado de um modo semelhante e parecia ser putativamente imunogénico; houve uma clara diferença encontrada em relação ao H. pylori
CID, no que diz respeito à abundância e a posição dos resíduos antigénicos. Mais tarde, construímos um modelo de homologia da H. pylori
CID com base na estrutura de cristal de E. coli
CID (código PDB 1AI2) e foram capazes de retratar a organização espinha dorsal da H. Pylori
(26695) ICD juntamente com a de E.
coli. Os dois ICDs foram consideradas significativamente semelhante (RMS Desvio 0,45) mas diferiam no que se refere a regiões de ansa expostas 3 de superfície importantes que são susceptíveis de constituir as áreas de diferenças estruturais correspondentes aos epítopos antigénicos putativos, possivelmente transmitindo respostas de anticorpos diferencial (Figura 1B )
Interacção de H. pylori CID com o sistema imunológico humano
respostas imunitárias
ICD foram comparados entre pacientes com H. pylori
infecção (gastrite, NUD, DU e GC) e controles saudáveis (Figura 3). Os dados imunorreatividade foram analisados estatisticamente e comparados com relação a ambos os soros infectados e saudável. Estes dados demonstraram que os soros de todos os doentes infectados pertencentes a gastrite e úlcera duodenal (UD) Categorias realizada estatisticamente significativo ( P
< 0,0001), os níveis de anticorpos anti CID, em comparação com os dos controlos saudáveis. A proteína CID, que tem um papel metabólico aparentemente importante, foi, assim, verificou-se ser capaz de induzir uma forte resposta humoral em indivíduos com gastrite e DU. No entanto, em casos de dispepsia não-ulcerosa (NUD) e cancro gástrico (CG), redução da resposta humoral foi visto. Tendo em conta estas observações, é provável que a libertação de proteína CID está associado com activa, H. pylori
infecção. Em contraste com as respostas humorais observadas, o recombinante, H. pylori
CID não induziu quaisquer respostas imunitárias celular significativa tal como evidenciado pela falta de secreção de IL-8 a partir de macrófagos humanos induzidos com recombinante, H. pylori
ICD in vitro
(Figura 4). Nós, portanto, sugerem que o CDI excita apenas o compartimento humoral e pode não contribuir para a patologia gástrica ou citocinas mudanças induzidas na fisiologia gástrica.
Discussão
pylori é um requisito obrigatório para o desenvolvimento de testes serológicos baseados em antigénios recombinantes purificadas. Combinado com o teste respiratório da ureia, a sorologia é uma abordagem não-invasivo para detectar H. pylori
infecção, e vários kits de testes serológicos com base em muitos diferentes H. pylori
antigénios estão comercialmente disponíveis. Embora a resposta imunitária humoral a H. pylori
parece ser bastante variável, combinações de antigénios frequentemente reconhecidos poderia revelar-se útil para fins de diagnóstico [21]. As enzimas metabólicas, tais como ICD parecem ser bons candidatos para ser aproveitada para o desenvolvimento kit de teste sorológico, principalmente porque eles não reagem de forma cruzada com soros de indivíduos saudáveis não infectadas ou [24].
incluindo algumas enzimas metabólicas não foi apreciado tanto em amostras clínicas de um estudo baseado proteómica anteriores [21]. Nosso estudo foi, porém, direcionada para avaliar purificada, recombinante, H. pylori
ICD por suas propriedades imunológicas em diferentes classes de H. pylori
infectado pacientes com doença péptica ácida. Buscou-se analisar sistematicamente a presença e utilidade das respostas imunes induzidas pela proteína CDI em H. pylori
pacientes infectados.
revelou significativamente elevados títulos de anticorpos entre os doentes com doenças de úlceras pépticas e gastrite, quando comparado com pacientes de cancro e NUD (Figura 3). Especula-se que a resposta imune visto em casos de gastrite e úlcera péptica poderia talvez ser devido a elevadas cargas de bactérias associadas com a patologia invasivo e, assim, um maior número de agentes patogénicos ou agentes patogénicos autolisadas apresentando CID na superfície. Possivelmente isso pode explicar a resposta comparativamente elevado de anticorpos em pacientes categoria invasivos.
antígenos são descritos para ser lançado para o espaço extracelular através de vários mecanismos, tais como caminhos específicos de secreção, autólise e formação de vesículas de membrana [23] e as propriedades da superfície de H. pylori
têm sido sugeridos para ser única para permitir a localização de adsorção /superfície de tais proteínas [26]. ICDs são tradicionalmente conhecidos como marcadores de autólise [22], [24], [27], lançado durante a fase logarítmica tardia. A liberação extracelular de proteínas poderia ser potencialmente ocorrendo apenas durante in vitro
crescimento de H. pylori
. No entanto, in vivo
existência de tais mecanismos, se demonstrado, pode ser capaz de explicar o papel de várias proteínas secretadas em patologia molecular da doença ulcerosa. A entrada de H. pylori
proteínas no espaço da submucosa gástrica pode ter consequências funcionais importantes, como a promoção de pró-inflamatória e respostas quimiotáticas através da liberação de citocinas de macrófagos ativados. Além disso, a liberação extracelular e ou adsorção ou superfície de localização [26] de proteínas potencialmente imunogénicas pode apoiar uma estratégia bacteriana para desviar uma resposta imune local eficaz [23]. Mantendo estes múltiplos mecanismos em mente, fizemos potenciais pró-inflamatórias de ICD com a ajuda de um ensaio ELISA IL-8. Em nossa observação, ICD não induziu significativamente IL-8 secreção em diferenciados, macrófagos cultivados. No entanto, uma vez que não analisar o papel da ICD no que se refere à indução de outras citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α e IL1-β, será prematuro governar com justiça a seu envolvimento na inflamação gástrica.
CID induz uma resposta humoral, investigou-se a base da especificidade imunológica da proteína tal como reflectido por modelação baseada na estrutura. Nossa sequência análises e modelagem molecular de H. pylori Comprar e E. coli
ICDs não revelou sobreposições estruturais completas entre os dois (Figura 1); várias regiões de diferenças estruturais foram discernido o que possivelmente correspondem aos epítopos antigênicos putativos em H. pylori
ICD. Além das questões ligadas à conservação estrutural ou diversidade, a hipótese de que a maior reatividade do H. pylori
ICD, em comparação com ICD de (comensais) E. coli
com o sistema imune do hospedeiro in vivo
poderia ser associado a 1) diferente de invasão de H. pylori Comprar e E. coli Página 2) diferentes magnitudes de carga bacteriana, volume de negócios e autólise 3) diferente repertório de células apresentadoras de antígenos (macrófagos contra células dendríticas) envolvidos e sua abundância relativa 4) disponibilidade de epitopos expostos superfície em H. pylori
CID (como aqueles destacados na Figura 1B), e 5) a presença de lesões activas de inflamação crónica, lesão da mucosa e os efeitos quimiotácticos do outro H. pylori
proteínas no milieu
.
, testamos H. pylori
ICD contra 8 amostras de C. jejuni
soros enterite paciente e descobriu que ele fez não reagem de forma cruzada significativamente (dados não mostrados). O H. pylori
condição de liberdade de nosso C. jejuni
pacientes positivos foi determinada com base na ausência de sintomas de indigestão, dor de estômago e azia etc. No entanto, desde que usamos apenas amostras de soro limitados de C. jejuni
pacientes, não estamos inclinados a marca H. pylori
CID como um antigénio de diagnóstico independente. No entanto, C. jejuni
nem sempre compreendem um fundo muito competitiva, a menos C. jejuni
próprios pacientes são clinicamente colonizada por H. pylori
ou vice-versa.
CDI não pode ser interpretada como aplicável de imediato para o diagnóstico nível de campo. No entanto, é possível que nossos resultados fornecem uma base sólida para o desenvolvimento de um teste de sero-diagnóstico para H. pylori
associada patologias gastroduodenais. Sugerimos que o potencial deste antigénio e seus péptidos específicos epítopo pode ainda ser analisada utilizando uma grande bateria de amostras de soro que representam diferentes sujeitos com Doença. Da mesma forma, o estado e o significado de anticorpos de reacção cruzada nos soros correspondendo a doenças causadas por bactérias tais como Salmonella spp., Shigella spp. e outros enteropatógenos invasivos pode também ser determinada. Será que vale a pena explorar em profundidade o envolvimento do CDI em atividades sinalização no espaço submucosa, especialmente a sua interacção com os macrófagos e linfócitos activados. Além disso, dado o seu papel importante no ciclo do ácido tricarboxílico e a ausência de glioxilato shunt em H. pylori
[27], a avaliação da CID como um possível alvo de intervenção apresenta uma proposta emocionante.
(ORF HP0023) e a correspondente sequência de aminoácidos foi obtida a partir do banco de dados Pylorigene (http://genolist.pasteur.fr) e foi submetido a análise por pacote DNAStar (DNAStar Inc. Madison, EUA). Sequência de aminoácidos de ICD foi submetido ao escrutínio por quaisquer determinantes antigênicos usando programa Metamorfose dentro do pacote DNAStar. Parâmetros tais como a hidrofilicidade, probabilidade superficial e índice antigénico foram calculadas para toda a proteína utilizando este software. índices antigênicas que mostram mais de 2 picos em > 3,0 escalas foram considerados significativamente mais antigênico
ICD. O modelo ICD de H. pylori
foi gerado com base no E. coli
ICD modelo 1A12 que partilha identidade de sequência global de 68% com o H. pylori
ICD.
(HP0023, 1,275 kb) foi amplificado por PCR a partir do ADN genómico de um H. pylori
paciente isolar MS8. A proteína recombinante ICD foi mais expressa em E.
e purificada até à homogeneidade coli (Figura 2) de acordo com os métodos previamente descritos por Banerjee
et al [24]. A colheita da proteína purificada foi normalizada até 2,0 mg de proteína purificada por 500 ml de cultura a partir do recombinante
coli. A proteína recombinante purificada foi dialisada contra Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, com NaCl 100 mM e 3% de glicerol. Além disso, a proteína purificada foi tratada com polimixina B para excluir efeitos de qualquer contaminação por LPS. O ICD recombinante purificado foi liofilizado e imediatamente congeladas para uso a jusante no diagnóstico clínico.
Pacientes e amostras de soro humano
= 82) composta por 58 H. pylori
infectados amostras de pacientes (para detalhes sobre o número de casos analisados em cada categoria, por favor veja a Figura 3) obtidos de casos de relatórios, principalmente, à Deccan Faculdade de Ciências Médicas e aliadas Hospitais, (DCMS), Hyderabad, e 24 clinicamente saudáveis doadores. O grupo de controle saudável foi composta por 18 comprovada H. pylori
casos negativos testado com uréia respiração Assay (UBA) e 6 indivíduos assintomáticos que foram confirmados H. pylori
negativo como testado pelo kit ELISA comercialmente disponível (Pyloriset EIA-GIII, Orion, Espoo, Finlândia). Em todos os grupos de pacientes, o diagnóstico da úlcera ou gastrite foi confirmada ou descartada por endoscopia pelo gastroenterologista presentes. A presença de H. pylori
em indivíduos doentes incluídos neste estudo foi previamente confirmada através da coloração de Gram, um teste rápido da urease (RUT), 16S rRNA e cag
Um gene PCRs ea cultura [29] baseia. A população do estudo não tinha predileção por sexo ou idade. consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os pacientes e controles saudáveis em seus respectivos centros.
ensaio
soro humano infectado pertencentes a diferentes grupos clínicos foram diluídos em série (1:50, 1:100, 1:200 e 1:400) em tampão (1% de BSA em PBS) de bloqueio, para se obter títulos óptimos. Os soros diluídos [50 ul de soros diluídos 1:200] foram adicionados a poços revestidos com antigénio e incubados durante 1 h a 37 ° C. As placas foram lavadas três vezes com PBS-T e duas vezes com PBS e adicionalmente incubadas com anti-IgG humana-peroxidase de rábano (Sigma) a 37 ° C durante 1 h. A actividade da peroxidase de rábano foi detectada utilizando uma substância cromogénica, o-fenilenodiamina
tetrahidrocloreto (Sigma) em tampão de citrato-fosfato (pH 5,4) e H 2O 2 como 1 ul /ml. As reacções foram paradas usando H H 0,5 2SO 4, e os valores de absorvância foram medidas a 492 nm num leitor de ELISA (Bio-Rad). Cada ELISA foi repetida pelo menos duas vezes com todos os isolados clínicos de soro. Student t
teste foi realizado para calcular valores p
com base nas médias dos títulos de anticorpos no soro correspondentes a classes saudáveis e infectadas utilizando a calculadora científica on-line da GraphPad (www.graphpad.com_quickcalcs_ttest1 .cfm). P
valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
ELISA para a citocina pró-inflamatória IL-8
[30], purificado sob condições semelhantes foi usada como um controlo positivo (1 ug /ml). As células foram incubadas durante 24 horas numa atmosfera humidificada a 37 ° C. Células sem tratamento proteína (células não estimuladas) serviram como controle negativo. O sobrenadante da cultura colhido após 24 horas foi utilizado para a dosagem de IL-8 utilizando o kit disponível comercialmente optEIA ELISA (BD Biosciences). O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante e os níveis de citocinas foram calculados usando o padrão recombinante fornecido com o kit. Sensibilidade de IL-8 foi de 3,1 pg /ml. Os valores foram expressos em média ± SD.
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