Tumörsuppressor MIR-24 hindrar magcancer progression genom nedreglering RegIV

tumörsuppressor MIR-24 hindrar magcancer progression genom nedreglering RegIV Bild Sammanfattning
Bakgrund
mikroRNA är små icke-kodande RNA som modulerar en mängd olika cellulära processer genom att reglera flera mål, som kan främja eller hämma utvecklingen av maligna beteenden. Ackumulerande bevis antyder MIR-24 spelar en viktig roll i mänsklig cancer. Men dess exakta biologiska roll är i stort sett svårfångade. Denna studie undersökte rollen av MIR-24 i magcancer (GC).
Metoder
uttrycket av MIR-24 i GC vävnader jämfört med matchade icke-tumörvävnad och GC-celler påvisades med QRT-PCR. Syntetiska korta enkel- eller dubbelsträngade RNA-oligonukleotider och lentivirala vektorer användes för att reglera miR-24-uttryck i GC-celler för att undersöka dess funktion in vitro
och in vivo
.
Resultat
miR-24 var signifikant nedregleras i GC vävnader jämfört med matchade icke-tumörvävnad och förknippades med tumördifferentiering. Ektopiskt uttryck av MIR-24 i SGC-7901 GC-celler undertryckte celltillväxt, migration och invasion in vitro
samt tumörbildning in vivo
genom att inducera cellcykelstopp i G0 /G1-fasen och främja cell apoptos. Dessutom identifierade vi RegIV som ett mål för MIR-24 och visade att MIR-24 regleras RegIV uttryck via bindning sin 3 'otranslaterad region.
Slutsatser
MIR-24 fungerar som en ny tumörsuppressor i GC och anti -oncogenic aktivitet kan innebära dess hämning av målgenen RegIV. Dessa resultat tyder på möjligheten för MIR-24 som ett terapeutiskt mål i GC.
Nyckelord
miR-24 RegIV Magcancer Proliferation Invasion Metastasis Bakgrund
Magcancer (GC) är en av de mest vanliga humana cancerformer. Även om förekomsten och dödligheten har minskat över hela världen under de senaste 20 åren, GC fortfarande rankas som den fjärde vanligaste och den näst mest dödliga cancer i världen [1]. Även om forskningen i GC har gjort stora framsteg, de molekylära mekanismerna bakom GC har fortfarande inte helt klarlagd.
MicroRNAs (miRNA) är små icke-kodande, dubbelsträngade RNA-molekyler som kan modulera uttrycket av målgener genom att påverka Post- transkriptions processer som reglerar genuttryck. miRNA känner igen mål-mRNA: n baserat på fullständig eller ofullständig sekvenskomplementaritet och förhindra produktion av protein genom att binda till den 3 'otranslaterade regionen (UTR), eller den öppna läsramen (ORF) av mål-mRNA [2, 3]. miRNA har visats fungera i cellulär proliferation och differentieringsprocesser, inklusive epitel-mesenkymala övergång [4] och endodermalt differentiering av stamceller från mänskliga embryon [5]. Utöver allmänna cellulära funktioner miRNA, dessa molekyler spelar också viktiga roller i ett flertal humana sjukdomar. Flera studier har visat att felaktig reglering av miRNA förbinds med cancer [6, 7], i vilken de fungerar som antingen onkogener eller tumörsuppressorer. miRNA har rapporterats vara inblandad i akut myeloisk leukemi, bröstcancer, icke-småcellig lungcancer, levercancer, tjocktarmscancer, GC och andra cancerformer [8-13]. Överuttryck eller nedreglering av miRNA leder till en diversifiering av proteinuttryck, och därigenom bidra till tumörbildning genom att modulera proliferation, angiogenes och invasion. Forskarna fann att miRNA uttryck profiler kan användas för att klassificera humana cancerformer, och detta resultat var före användning av budbärar-RNA-profiler för klassificering av dåligt differentierade tumörer [14, 15].
Aberrant expression av specifika miRNA i GC har varit tidigare rapporterats och korrelerad med progression och prognos av GC [16-18]. Vi fann tidigare att MIR-24, som kan fungera som en tumörsuppressor genom en målplats polymorfism [19], var en betydligt nedregleras miRNA i GC-celler och vävnader jämfört med icke-tumörvävnad. I denna studie analyserade vi MIR-24 expressionsnivåer i GC vävnader jämfört med matchade icke-tumörvävnader, och bedömde korrelationer mellan MIR-24 nivå och clinicopathologic parametrar. Vi utvärderade påverkan av överuttryck av MIR-24 på tillväxten och apoptos av SGC-7901 GC celler både in vitro Mössor och in vivo
. Vi bestämde också den biologiska effekten av nedreglering av MIR-24 uttryck på GC-celler. Dessutom identifierade vi RegIV (regenererande ö-härlett familj, medlem 4) som en av de målgener av MIR-24. Vår hypotes är att MIR-24 kan reglera invasion och metastas av GC-celler genom direkt inriktning på RegIV genen.
Resultat
Uttryck av MIR-24 hämmar GC cellförökning
att undersöka uttrycket av MIR-24 i GC, kvantitativ realtids-RT-PCR (QRT-PCR) utfördes. Expression av MIR-24 var allmänt nedregleras i nio GC cellinjer jämfört med de immortaliserade normala gastriska mukosala epitelceller GES-1 (Figur 1A). Expression av MIR-24 undersöktes vidare med QRT-PCR i tumörvävnad och matchas icke-tumörvävnad från 63 GC patienter (Figur 1B). Den genomsnittliga expressionsnivån av MIR-24 signifikant nedregleras i tumörvävnad jämfört med matchade icke-tumörvävnader (Figur 1C). Tillsammans utgör dessa resultat visade tydligt att MIR-24 signifikant nedregleras i GC. Figur 1 MIR-24 är betydligt nedregleras i GC och hämmade SGC-7901 celltillväxt. (A) Relativ uttryck av MIR-24 i nio GC cellinjer jämfört med GES-1 bestäms av QRT-PCR av tre oberoende försök (** P < 0,01, *** P < 0,001). (B) Relativ uttryck av MIR-24 i kirurgiska exemplar av 63 GC bestäms av QRT-PCR. Alla experiment utfördes i triplikat. Data visas som -ΔΔCT värden, S.D. inte visad. (C) Den genomsnittliga och standardavvikelsen för MIR-24 expressionsnivåer i kirurgiska exemplar av 63 GC vävnader och matchade icke-tumörvävnader visas. Data presenteras som två-ΔCT värden (** P < 0,05). U6 snRNA användes för normalisering. (D) miR-24 hämmade tillväxten av SGC-7901-celler såsom detekteras av WST, medan anti-MIR-24 ökad celltillväxt (* P < 0,05). Data visas som medelvärde ± S.D. av tre oberoende experiment.
Vi undersökte nästa korrelationerna mellan expressionsnivån av MIR-24 och clinicopathologic faktorer i mänsklig GC. De kliniska och patologiska egenskaperna hos 63 GC patienter ges i Tabell 1. Baserat på relativa uttrycksförhållanden av MIR-24 /U6 = 1, var de fall delas in i två grupper: Mir-24 med hög uttrycksgrupp (n = 29) och miR-24 låg uttrycksgruppen (n = 34). Mir-24 låg uttryck gruppen uppvisade signifikant lägre tumördifferentiering (P = 0,021). Men Mir-24 expressionsnivå inte någon relation med ålder, kön, tumörstället, djup lokal invasion, lymfkörtel metastas, eller TNM stage.Table en Förhållande mellan MIR-24 expressionsnivån och clinicopathologic variabler i 63 GC patienter
clinicopathologic parametrar
mIR-24 uttryck
P-värde
Hög (n = 29)
Låg (n = 34)
vid Kön
Man
17
21
0,799
Kvinna
12
13
Ålder (år)
< 60
15
18
0,923
≥60
14
16
tumörlokalisation
Distal tredje
8
8
0,310
USA tredje
6
13
Proximal tredje
15
13
WHO klassificering
adenokarcinom
25
28
0,155
Klack-ring cell carcinoma 1
5
mucinous adenokarcinom
3 1
Differentiering
Tja, måttligt
15
8
0,021
Dåligt
14
26
Borrmann klassificering
I /II
11
12
0,828
III /IV
18
22
lokal invasion
T1 /T2 1
7
0,098
T3 /T4
28
27
Lymfkörtel metastaser
Ingen
6 4
0,535
Ja
23
30
fjärrmetastaser
Ingen
28
31
0,724
Ja 1
3
TNM stadium
I /II
7
8
0,955
III /IV
22
26
att undersöka den biologiska funktionen av mIR-24 i utveckling och progression av GC, transfekterade vi SGC-7901 celler med mIR-24 härmar (SGC-7901 /mIR-24) eller mIR-24 inhibitor (SGC-7901 /anti-mIR-24). Som visas i kompletterande fil 1: Figur S1A och S1B, valde vi 100 nM som lämplig koncentration i efterföljande experiment. Ektopiskt uttryck av MIR-24 i SGC-7901 celler bekräftades genom QRT-PCR. Därefter undersökte vi cellförökning av WST-analys. Överuttryck av MIR-24 hämmade tillväxten av SGC-7901 celler jämfört med MIR-kontroll transfekterade celler (P < 0,05), medan anti-MIR-24 ökade celltillväxt aktiviteter (P < 0,05, figur 1D).
Uttryck av mIR-24 inhiberar migration och invasion av GC celler
Nästa vi utvärderade effekten av mIR-24 på cellmigration och invasion i GC. Cellmigration och invasionsanalyser visade att överuttryck av MIR-24 undertryckte cellmigration (SGC-7901 /MIR-24 grupp, 63,0 ± 3,6 celler per fält, kontrollgruppen, 126,3 ± 7,0 celler per fält; p < 0,05) och invasion ( SGC-7901 /mIR-24 grupp, 34,7 ± 2,1 celler per fält, kontrollgruppen, 63,7 ± 3,5 celler per fält, P < 0,05) (Figur 2A, B). I motsats, knockdown av MIR-24 signifikant ökad migration cell (SGC-7901 /anti-MIR-24 grupp, 182.3 ± 5,0 celler per fält, kontrollgruppen, 105,3 ± 3,8 celler per fält; p < 0,01) och invasion (SGC -7901 /anti-mIR-24 grupp, 124,3 ± 3,8 celler per fält, kontrollgruppen, 62,7 ± 2,5 per fält, P < 0,01) (Figur 2A, C). Figur 2 MIR-24 inhiberade migration och invasion av SGC-7901-celler. (A) Representativa områden SGC-7901 celler i Transwell-analyser. (B, C) Representativa områden SGC-7901 celler i migration och invasionsanalyser, respektive. Genomsnittligt antal migration och invasion celler per fält från tre oberoende försök (* P < 0,05, ** P < 0,01). Uttryck av MIR-24
främjar apoptos av GC-celler och inducerar cellcykelstopp i G0 /G1-fasen
Eftersom observerade cellulär tillväxt kan påverkas av hastigheterna för apoptos och cellcykelprogression, undersökte vi effekterna av mIR-24 på apoptos och cellcykel in vivo
genom flödescytometri. Vi fann att ungefär 12-15% av SGC-7901 /MIR-24 celler uppvisade morfologiska egenskaper som är typiska för apoptos, inklusive kondenserad kromatin och nukleär fragmentation av Hoechst33342 färgning för DNA-innehåll. I motsats, efter beaktande av den sällsynta spontana apoptos i SGC-7901 celler, SGC-7901 /anti-MIR-24 gruppen visade inga signifikanta förändringar av Hoechst33342 färgning (figur 3A). Flödescytometri visade att den apoptotiska var väsentligt ökat i SGC-7901 /MIR-24 celler jämfört med kontrollceller (13,62% ± 1,25% jämfört med 6,15% ± 0,95%, respektive; P < 0,01), och minskade kraftigt i SGC -7901 /anti-mIR-24 jämfört med kontroller (3,92% ± 0,52% mot 6,35% ± 0,83%, respektive; P < 0,05). (Figur 3B, D)
för att ytterligare klarlägga mekanismen för mIR 24-förmedlad tillväxtinhibering av GC-celler, var cellcykelanalys utförs (figur 3C, E). Vid uppreglering av MIR-24, procentandelen av celler i G0 /G1-fasen ökade från 40,51% ± 3,15% i kontrollerna till 72,24% ± 3,65% (P < 0,01), medan knockdown miR-24 reducerade den procentuella andelen av celler i G0 /G1 fas från 42,35% ± 2,78% i kontroller till 30,25% ± 1,25% (P < 0,05). Figur 3 MIR-24 inducerad cell apoptos och G0 /G1 cellcykelstopp. (A) Representativa histogram som visar kärnmorfologi av SGC-7901 celler transfekterades med 100 Nm MIR-24 efterliknar eller inhibitor och deras respektive kontroller (Hoechst33342 färgning, ursprunglig förstoring 400 x). (B) Representativa histogram som visar apoptos av SGC-7901-celler transient transfekterade med 100 Nm MIR-24 efterliknar eller hämmare och deras respektive kontroller. (C) Representativa histogram som visar cellcykeln av SGC-7901 celler transfekterades med 100 Nm MIR-24 efterliknar eller inhibitor och deras respektive kontroller. (D, E) Procentandelen apoptotiska och G0 /G1-fasceller av tre oberoende experiment, medelvärde ± S.D. (* P < 0,05, ** P < 0,01).
RegIV är en målgen av MIR-24
att närmare undersöka mekanismerna för MIR-24 i GC, vi sökte efter kandidat målgener genom bioinformatik. TargetScan, miRBase Tatget och Starbase tillämpades för att söka efter potentiella mål för MIR-24. Bland de förutspådda mål var RegIV identifierats som ett av de mål gener av MIR-24, och vi identifierat en potential MIR-24 bindningsställe inom dess 3'UTR (Figur 4A). Därefter undersökte vi uttrycket av RegIV i nio GC-celler och GES-1. Vi fann att RegIV överuttrycktes i nio GC-celler jämfört med GES-1, och uppvisade ett omvänt uttrycksmönster jämfört med MIR-24 (Ytterligare fil 2: Figur S2A och S2B). För att undersöka huruvida 3'UTR av RegIV mRNA var en funktionell mål på MIR-24, var luciferasreportergen analyser utförs. Vi utvärderade först aktiviteten hos MIR-24 (eller MIR-kontroll) samtransfekterades i SGC-7901 celler med Luc-RegIV plasmid eller Luc-RegIV-mut plasmid (där den förmodade MIR-24 bindningsställe muterades) tillsammans med pRL-TK-plasmid innehållande Renilla luciferasgenen som en intern kontroll (Figur 4B). Celler co-transfekterade med MIR-24 visade en signifikant minskning av luciferasaktivitet jämfört med MIR-kontrollgruppen (P < 0,05). Men MIR-24 samtransfekteras med Luc-RegIV-mut plasmid visade ingen signifikant skillnad i reporteraktivitet jämfört med celler samtransfekterade med MIR-kontroll. Likaså ökade anti-MIR-24 luciferasaktiviteten av vild-typ Luc-RegIV, men hade ingen effekt på Luc-RegIV-mut plasmid (Figur 4C, P < 0,05). Vi utförde också luciferasreportergenen analyser i SNU-16 för att minimera inverkan av endogent miR-24. Till en början var ektopisk expression av MIR-24 i SNU-16 celler bekräftades genom QRT-PCR. Expression av MIR-24 transfekterade med MIR-24 härmar var ungefär 50 gånger högre än för MIR-kontrollgruppen i SNU-16 (P < 0,01), medan ingen statistisk skillnad med transfektion av anti-MIR-24 (Ytterligare fil 3: Figur S3A). Celler co-transfekterade med MIR-24 visade en signifikant minskning av luciferasaktivitet jämfört med MIR-kontrollgruppen (P < 0,001), medan ingen statistisk skillnad med anti-MIR-24 transfektion (Ytterligare fil 3: Figur S3B och S3C) . Dessa resultat starkt antydde att 3'UTR av RegIV innehåller direkta bindningsställen för MIR-24. Figur 4 MIR-24 riktade 3'UTR av RegIV genen och immunfärgning av RegIV i mag vävnader. (A) Schematisk diagram över de förmodade bindningsställen av MIR-24 i RegIV 3'UTR. RegIV-mut indikerar RegIV-3'UTR med mutation i MIR-24-bindningsställen. (B) miR-24 härmar nedregleras aktiviteten hos en luciferas reporter innehållande vildtyp RegIV 3'UTR (* P &0,05), men inte reportern med mutant RegIV 3'UTR. (C) Anti-miR-24 ökade luciferasaktiviteten av vildtyp Luc-RegIV (* P < 0,05), men hade ingen effekt på den mutanta. (D) Fyrtioåtta timmar efter MIR-24 härma och kontroll transfektion av SGC-7901 celler, proteinnivån RegIV var signifikant minskade jämfört med MIR-kontroll som bestämdes genom ELISA. Anti-MIR-24 ökade uttrycket av RegIV jämfört med anti-MIR-kontroll (* P < 0,05, ** P < 0,01). (E) Tjugofyra timmar efter miR-24 härmare eller inhibitor och respektive styr transfektion i SGC-7901-celler, fanns det ingen skillnad i mRNA-nivån av RegIV jämfört med MIR-kontroll enligt bestämning med QRT-PCR (P > 0,05). Data visas som medelvärde ± S.D. av tre oberoende experiment. (F) nr uttryck av RegIV detekterades i normal magslemhinna. (G) RegIV uttrycktes i intestinal metaplasi av magen. (H) starkt uttryck av RegIV observerades i gastric signet-ring cell carcinoma.
Nästa vi undersökte MIR-24 reglering av RegIV mRNA och proteinnivåer i transfekterade SGC-7901 celler. ELISA-analys visade att RegIV proteinnivåer kraftigt undertrycktes i SGC-7901 /MIR-24 celler, medan RegIV proteinnivåer var uppreglerad i SGC-7901 /anti-MIR-24-celler (Figur 4D, * P < 0,05, ** P < 0,01). QRT-PCR-analys indikerade ingen skillnad i nivån av RegIV mRNA i alla transfekterade grupper cell (Figur 4E; P > 0,05). Under tiden, detekterade vi uttrycket av c-MYC i GC-celler som positiv kontroll transfekterades med MIR-24 [20]. Vi fann att MIR-24 nedreglerade RegIV och c-MYC (Ytterligare fil 4: Figur S4A och s4b).
Tidigare studier har visat att RegIV förknippades med proliferation och metastas av GC. Vi använde nästa immunhistokemisk analys för att utvärdera uttrycket av RegIV i GC. Våra resultat bekräftade överuttryck av RegIV i GC. Proteinnivån RegIV i normal magslemhinna var lägre än intestinal metaplasi av magen och gastric klackring cellscancer (Figur 4F-H). För att bedöma den kliniska relevansen av dessa fynd har vi granskat sambandet mellan uttryck för RegIV och MIR-24 i GC vävnader. Vi fann att RegIV och miR-24 uppvisade en invers uttrycksmönster i GC vävnader (tabell 2). Dessa resultat stöder uppfattningen att nedreglering av MIR-24 resulterade i ökade proteinnivåer RegIV i GC.Table 2 RegIV och MIR-24 uppvisar omvända uttrycksmönstret i GC
MIR-24 uttryck
P-värde
Låg
Hög
Reg IV (IHC) Review Negativ
9
16
0,038 *
Positiv
25
13
* P Hotel < 0,05 ansågs statistiskt signifikant
Uttryck av mIR-24 hämmar tumörbildning in vivo
med tanke på att mIR-24 förbättrade. spridning av GC-celler in vitro
undersökte vi om mIR-24 kan påverka tumörbildning in vivo
. Retrovirus-medierad SGC-7901 /miR-24 och SGC-7901 /miR-styr stabila cellinjer erhölls såsom beskrivits i avsnittet Metoder. SGC-7901 /RV-miR-24 och SGC-7901 /RV-miR-kontrollceller injicerades subkutant i fyra veckor gamla manliga nakna möss, och tumörbildning övervakades. Tumörer växte långsammare i SGC-7901 /RV-MIR-24 gruppen än i SGC-7901 /RV-MIR-kontrollgruppen (figur 5A). Den genomsnittliga tumörvolymen i möss ympade med SGC-7901 /RV-MIR-24 celler vid dag 28 var betydligt mindre jämfört med möss ympade med SGC-7901 /RV-MIR-kontrollceller (397.45 ± 93,07 mm 3 vs. 1083.56 ± 101,56 mm 3, respektive) (Figur 5B och C; p < 0,05). Figur 5 MIR-24 hämmade tumörbildning och spridning in vivo. (A) Fotografi av tumörer härledda från RV-miR-24 eller RV-miR-kontrollceller i nakna möss. (B) Tillväxt kinetiken för tumörer i nakna möss. Tumördiametrar mättes var 7 dagar. Volymen av de nakna mössen som indikeras av barer, S.D. (* P < 0,05). (C) Den genomsnittliga vikten av tumörer i nakna möss. Data visas som medelvärden ± S.D. (* P < 0,05). (D) Representativa fotografier av immunohistokemisk analys av Ki-67-antigen i tumörer i nakna möss (ursprunglig förstoring, 200 ×). (E) Representant proliferativ index av tumörer i RV-MIR-24 och RV-MIR-kontroll nakna möss. Data visas som medelvärden ± S.D. (** P < 0,05). (F) Expressionsnivåer av RegIV i tumörvävnader av nakna möss. Data visas som medelvärden ± S.D. (* P < 0,05). (G) Expression nivåer av RegIV mRNA i tumörvävnader av nakna möss (P > 0,05). Data visas som medelvärde ± S.D. av tre oberoende experiment.
att bedöma om tumörtillväxthämning i SGC-7901 /RV-MIR-24 celler var delvis på grund av undertryckande av proliferation, analyser av tumörvävnader immunhistokemiska utfördes. Som visas med Ki-67-antigen färgning, kan den minskade tumörtillväxt i möss injicerade med SGC-7901 /RV-MIR-24 celler vara delvis på grund av lägre spridning som orsakas av överuttryck av MIR-24. Den procentuella andelen av Ki-67-antigen-positiva celler var lägre i tumören härrör från SGC-7901 /RV-MIR-24-celler än tumören härledd från SGC-7901 /RV-miR-kontrollceller (37,1% ± 3,6% vs . 79,5% ± 5,2%, respektive) (fig 5D och E; P < 0,01). Uttrycksnivån för RegIV bestämd med ELISA var lägre i tumören härrör från celler som överuttrycker miR-24 än tumören härleds från kontrollceller (1,77 ± 0,15 ng /ml i SGC-7901 /RV-miR-24 vs. 3,13 ± 0,25 ng /ml i SGC-7901 /RV-mIR-kontroll) (figur 5F; P < 0,05). Det fanns emellertid ingen statistisk skillnad i den relativa expressionen av RegIV mRNA (figur 5G). Därför tumorogenicitet av SGC-7901 /RV-MIR-24 celler reducerades signifikant in vivo
.
Diskussion
Ackumulerande bevis har stött viktiga roller för miRNA, som fungerar antingen som tumörsuppressorer eller onkogener, i GC [21-23]. Dessutom har många miRNA visats uppvisa terapeutiska potential. På grund av deras funktion som master-regulatorer av genomet och ny verkningsmekanism, är miRNA anses vara en lovande teknik för terapeutisk utveckling [24]. MIR-26a har antitumorigenic egenskaper och potentiell terapeutisk användbarhet för levercancer i och in vivo
vitro
, och förknippades med snabb och ihållande hämning av cancercelltillväxt och mycket specifik induktion av tumör celldöd [25]. Den specifika mekanism av rollerna av oreglerad miRNA i gastric cancer förblir svårfångade.
I denna studie har vi visat de hämmande effekterna av MIR-24 på tumörmetastaser vid kliniska, cellulär och molekylär nivå och i en experimentell djurmodell. Vi gav detaljerad mekanistisk experimentella bevis för rollen som MIR-24 i GC genom att undertrycka uttrycket av RegIV. Studier visade att MIR-24 kan fungera som onkogen i maligna utgjutningar [26], oral cancer [27, 28], prostatacancer [3] och lungcancer [29, 30], men kan fungera som en tumörsuppressor i tjocktarmscancer [ ,,,0],19] och retinoblastom tumörer [31]. Lal A et al. fann att miR-24 hämmade cellproliferation och cellcykelprogression genom att undertrycka expressionen av E2F2, MYC och andra cellcykelreglerande gener genom att binda till "utan frö" 3'UTR miRNA igenkänningselement [20]. Wu J et al. rapporterade att transfektion av MIR-24 in i GC-celler reducerade uttrycket av AE1-proteinet, vilket resulterade i att hämma cellproliferation [32]. De kompletta underliggande mekanismerna för MIR-24 i GC är fortfarande oklart.
Vår rapport identifieras MIR-24 som en kandidat tumörsuppressorgen i GC. Vi hittade nedreglering av MIR-24 uttryck både i GC vävnader och cellinjer. Överuttryck av MIR-24 i SGC-7901 GC-celler minskas avsevärt proliferation och invasion både in vitro Mössor och in vivo
, avslöjar den potentiella terapeutiska effekten av MIR-24 i GC. Motsatt resultat erhölls när uttrycket av MIR-24 inhiberades av anti-MIR-24. Tillsammans antyder dessa resultat att MIR-24 kan fungera som en tumörsuppressor i mänsklig GC.
MiRNAs binder till perfekt eller ofullkomliga kompletterande "frö" sekvenser i mål-mRNA, vilket leder till klyvning av mål-mRNA eller hämning av deras översättning [33] . I denna studie identifierade vi RegIV som en målgen av MIR-24. MIR-24 bunden med ofullständig komplement till RegIV mRNA, vilket resulterar i direkt translationell hämning av RegIV mRNA men utan effekt på den totala mRNA-stabilitet. Eftersom de olika handlingssätt miRNA, gjorde MIR-24 inte påverka mRNA-nivån av RegIV men translationshämning. RegIV är en medlem av den humana Reg-genfamiljen, som delar sekvenslikhet med den kolhydratbindande domänen av C-typ lektiner, och isolerades först och karakteriserades i human inflammatorisk tarmsjukdom [34]. RegIV är en typ av utsöndrade proteiner, och spelar en biologisk roll beroende på de extracellulära utsöndrade proteiner, så att vi tog ELISA såsom en föredragen detektionsmetod. Western blöt utfördes också för att validera proteinnivå av RegIV, och vi erhållit liknande resultat. Tidigare studier har rapporterat att de RegIV genen ofta överuttrycktes i GC och potentiellt involverade i invasionen, metastaser, och cancer i GC. RegIV uttryck snävt begränsad i noncancerous vävnader [35, 36]. RegIV uttryck var markant högre hos patienter med peritoneal metastas jämfört med dem utan peritoneal metastas. RegIV kan accelerera peritoneal metastas i GC och nivåer i sköljvätska kan tjäna som en bra markör för peritoneal metastas [37-39]. RegIV kan fungera som en serum biomarker för GC-patienter och hämmar 5-FU-inducerad apoptos genom induktion av Bcl-2 och dihydropyrimidindehydrogenas [40].
I den aktuella studien, identifierade vi miR-24 som en potentiell uppströms regulator av RegIV. Först överuttryck av MIR-24 minskade aktiviteten hos en luciferas reportergen innehållande 3'UTR av RegIV, medan mutation av "såddregionen" platser i 3'UTR av RegIV avskaffade reglerande effekt av MIR-24. Motsatt resultat erhölls när vi använde anti-MIR-24. För det andra, mänskliga GC vävnader uttryckte betydligt lägre nivåer av MIR-24 än icke-tumörvävnad, medan GC vävnader innehåller betydligt högre halter av RegIV protein än icke-tumörvävnader. För det tredje, överuttryck av MIR-24 nedreglerade RegIV på proteinnivå, medan nedreglering av MIR-24 ökade RegIV proteinnivå. För det fjärde överuttryck av MIR-24 var signifikant relaterade till spridning och metastaser, vilket tyder på en funktionell överlappning med RegIV. Alla dessa resultat indikerar att RegIV kan vara en direkt målgen av MIR-24 i GC.
Karcinogenicitet är en serie av sekventiella händelser, inklusive avskildhet, migration, lokal invasion, angiogenes, intravasering, överlevnad i cirkulationssystemet, extravasering och återväxt i olika organ [41, 42]. Här visade vi att MIR-24 kan reglera karcinogenes GC genom att modulera proliferation, migration och lokal invasion. Vidare föreslår vår bevis möjligheten för MIR-24 som ett terapeutiskt mål i GC. Ytterligare studier behövs för att helt förstå de detaljerade mekanismerna för MIR-24 i GC cancer och som ett potentiellt terapeutiskt tillvägagångssätt.
Metoder
Etiska riktlinjer
Skriftligt informerat samtycke samlades från alla deltagare, och studieprotokoll godkändes av den etiska kommittén i Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Alla mus experiment har godkänts av Animal Care (Permit.120.810) och användning kommittén och genomförs i enlighet med de officiella rekommendationerna från Care och använda försöksdjur i Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine.
Cellinjer
De humana GC cellinjerna SNU-1, SNU-16, NCI-N87, och KATO III köptes från American Type Culture Collection (ATCC). Cellinjerna SGC-7901, MKN-28, BGC-823, MKN-45, och AGS köptes från Shanghai institut för Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. Den odödliggjorda normala gastrointestinala epitelceller linje (GES-1) var en gåva från professor Feng Bi (Huaxi Medical University, Chengdu i Sichuanprovinsen, Kina). Den embryonala njurcellinjen 293 T bevarades i vårt laboratorium och hölls i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° C i en fuktad atmosfär med 5% CO 2. Alla GC-celler odlades i RPMI 1640 kompletterat med 10% FBS i en fuktad inkubator med 5% CO 2 vid 37 ° C.
Vävnadsprov
Primära cancervävnader och parade intilliggande icke-tumörvävnader samlades in från patienter med GC genomgick radikal gastrektomi vid institutionen för kirurgi, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. De intilliggande normala vävnader erhölls över 5 cm från den primära cancern. Vävnadsprover omedelbart snabbfrystes i flytande kväve och förvarades i ett kylskåp vid -80 ° C. Vävnader för immunhistokemi fixerades i 4% paraformaldehyd och paraffininbäddade. Kliniskt patologiska data granskas, och TNM stadieindelning klassificeringen baserades på kriterierna i amerikanska kommittén för cancer (AJCC, 6: e utgåvan). Samtliga prover verifierades genom patologisk undersökning.
RNA-isolering och QRT-PCR
Totalt RNA isolerades från vävnadsprover och cellinjer med hjälp av Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens anvisningar. De expressionsnivåer av miRNA utvärderades med användning av Hairpin-itTM miRNA qPCR Kvantifiering Kit (GenePharma, Shanghai, PR China) genom att följa tillverkarens protokoll. U6 snrna (RNU6B, GenePharma) användes för normalisering. Den relativa uttrycket förhållandet mellan MIR-24 i varje parad tumör och icke-tumörvävnad beräknades med hjälp av två -ΔΔCT metod. Mir-24 expressionsnivån definierades som uppregleras när den relativa uttrycksförhållandet var > 1, och definieras som nedregleras när den relativa uttrycksförhållandet var < 1. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Gastric kontra efter pyloric utfodring: en systematisk genomgång
• Nyttan av intranasal Ketamin och midazolam att utföra ventrikelsköljvätska hos barn: en dubbelblind, placebokontrollerad, randomiserad studie