Valideringen af ​​en ny metode kombinerer både HER2 immunhistokemi og HER2 tofarvet sølv in situ hybridisering på et dias for gastrisk karcinom testing

Validering af en ny metode kombinerer både HER2 immunhistokemi og HER2 tofarvet sølv in situ
hybridisering på én slide for gastrisk karcinom test
Abstract
Baggrund
HER2 status vurdering er en forudsætning for etablering af en passende behandling strategi i gastrisk kræft. Gastric kræftformer er meget heterogene og separate evalueringer af gen-forstærkning og proteinekspression fører til usikkerhed i lokalisering forskellige kloner og er tidskrævende. Denne undersøgelse vurderer ækvivalens af romanen metode kombinerer både gen og protein-platforme på én slide.
Metoder
Immunhistokemi (IHC) og HER2 tofarvet sølv in situ hybridisering (SISH) som enkelte metoder (IHC /SISH) og gen-protein-platform kombinerer begge metoder på et dias (gen /protein) blev udført i tilfældigt indsamlede 100 tilfælde af gastrisk adenocarcinom. Resultater af IHC /SISH blev sammenlignet med gen /protein farvning.
Resultater
96 af 100 prøver var vurderbare. I genet /proteinfarvning, patologer var i stand til at vurdere genamplifikation og deraf proteinekspression på enkelt celle niveau. I forsøg sammenligning blev genamplifikation observeret i 14,6% af både, konventionel SISH og gen /protein-platform (aftale 100%; Kappa-koefficient κ = 1,0). Proteinekspression point ved IHC var 70,8% (0), 10,4% (1+), 9,4% (2+), og 9,4% (3+). Protein ekspression ved gen /protein metode var: 70,8% (0), 11,5% (1+), 7,3% (2+) og 10,4% (3+) af patienterne. Der var fuldstændig konkordanser i IHC vurdering af tilfælde med score 0 (100,0%; K = 1). Høje konkordanser er vist i score 1+ (98,96%; κ = 0,947) og 3+ (96,88%; K = 0,825) cases og gode konkordanser i 2 + tilfælde (95,83%; κ = 0,728).
Konklusioner
Denne hidtil ukendte fusionerede platform har den fordel at være i stand til at evaluere både genet og proteinet status i samme cancercellen og kan være af særlig interesse for forskning og patientens pleje.
Artikelkategori
Disease Biomarkør.
nøgleord
mavekræft HER2 Immunhistokemi Silver in situ hybridisering Gene-proteinassay Baggrund
HER2 onkogenet (også benævnt HER2 /neu eller erbB-2) på kromosom 17q21, koder for et 185-kD transmembrane tyrosinkinasereceptor, der tilhører den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) familie bestående af EGFR /HER1, HER2, HER3 og HER4. HER2-aktivering spiller en central rolle i celleproliferation og overlevelse, hovedsagelig medieres via RAS-MAPK-vejen. Det hæmmer også celledød via phosphatidylinositol 3'-kinase-AKT-pattedyr mål for rapamycin (mTOR) vej. HER2 overekspression er rapporteret i en række faste tumorer [1-7]. Genamplifikationer er sjældne i andre sygdomme og anti-HER2-terapi er i øjeblikket valideres kun i bryst- og gastriske cancere.
Baseret på resultaterne af ToGA forsøget [8] blev trastuzumab godkendt til metastatisk adenokarcinom i maven og gastroøsofageal krydset i kombinationsterapi i USA og Europa. Krav er et bevis på HER2 overekspression. I Europa er dette defineret af en IHC 3+ resultat eller en IHC 2+ og positiv FISH eller SISH resultat (forhold ≥ 2,0). IHC blev betragtet som den primære metode, fordi IHC negative eller ugentlig positive (1+) patienter ikke gavn af trastuzumab i ToGA retssag, selv om de var ISH positive. I litteraturen er der dog betydelig variation i den immunhistokemiske positivitet bestemt. Her er andelen af ​​HER2-positiv avancerede gastriske adenokarcinomer varierer fra undersøgelse til undersøgelse, fra 5% til 30% [9], sandsynligvis på grund af forskellige analyser protokoller og kriterier tolkning.
Potentielle delstudier fra to af adjuvans randomiserede forsøg med trastuzumab versus nul i brystkræft viste, at ca. 20% af HER2-analyser udføres på institutioner på stedet (på det primære behandling webstedets patologi afdeling) var forkert, når den samme prøve blev revurderet i en høj lydstyrke, centralt laboratorium [10, 11 ].
modsætning brystkræft, er histopatologi af gastrisk cancer i form af HER2 anses for at være mere heterogene og fokal overekspression af genamplifikation observeres hyppigt [12]. Derfor forventes vanskeligheder med at bestemme HER2-status til at være mere udtalt end i brystkræft. Samlet set taget disse resultater i betragtning, er der behov for mere pålidelige, reproducerbare og tid besparende metoder til vurdering af HER2-status i mavekræft. Kun få offentliggjorte undersøgelser kombinerer IHC og in situ hybridisering metoder (men ikke SISH) på et dias er blevet udført [13-16]. Specialer undersøgelser udnyttede standard IHC og chromogene eller fluorescens in situ hybridisering (CISH eller FISH) som enkelte metoder og sammenlignede dem med en samtidig analyse (kombineret på én slide) og fundet god overensstemmelse med resultaterne af enkelt farvning. Så vidt vi ved, men der er ingen undersøgelser, der direkte sammenlign resultaterne af både immunhistokemi (IHC) og sølv in situ hybridisering (SISH), når hver bruges separat med resultaterne af at bruge dem i kombination på en enkelt sektion i gastrisk carcinomer.
i den foreliggende undersøgelse, blev HER2 proteinekspression og genamplifikation status 100 gastriske adenokarcinomer og carcinomer i esophagogastric junction undersøgt ved konventionel IHC og ISH enkelt metoder (IHC /SISH) og parallelt af den hidtil ukendte fremgangsmåde kombinerer begge metoder (gen /protein). Formålet med denne undersøgelse var at vurdere ækvivalensen af ​​det nye gen-protein-platform i forhold til de enkelte farvningsmetoder.
Metoder
Patienter og vævsprøver
formalin-faste paraffinindlejrede (FFPE) tumorprøver fra 100 patienter med gastrisk eller gastro-krydset adenocarcinom blev udvalgt fra et væv arkiv af prøver på Patologisk Institut på Krankenhaus Nordwest. Projektet blev udført med tilladelse fra den ansvarlige etik udvalg. For hvert tilfælde blev fire forskellige farvningsmetoder anvendes ifølge de producentgaranti FDA-godkendte procedurer: hematoxylin og eosin (H &E) for at vurdere prøven tilstrækkelighed og for at bekræfte den histologiske subtype, immunhistokemi (IHC) for at evaluere HER2-protein ekspression, sølv in situ hybridisering (SISH) til at vurdere genamplifikation og det hidtil ukendte gen-protein platform, som kombinerer IHC og SISH på et lysbillede.
Immunhistokemi
IHC blev udført med FDA-godkendte Ventana PATHWAY kanin-monoklonalt antistof 4B5 klon og med Ultraview DAB Detection Kit (Ventana) på en benchMark XT automatiseret farvningsværktøjet (Ventana, Tucson, AZ). Kort fortalt blev vævssnittene deparaffineret med EZ Prep ved 75 ° C og 76 ° C, varme forbehandlet i Cell Conditioning 1 (CC1) for antigen hentning ved 76 ° C - 100 ° C og derefter inkuberet med anti-HER2 primært antistof i 16 min ved 37 ° C efter inaktivering af det endogene peroxidase under anvendelse af UV-inhibitor i 4 minutter ved 37 ° C. Objektglassene blev inkuberet med et sekundært antistof, efterfulgt af anvendelse af HRP Universal multimer i 8 min. Antistoffer blev påvist under anvendelse af chromogen (for 38 min). Før montering blev objektglassene kontrastfarvet med hematoxylin II i 4 min og blåneringen reagens til 4 min. At støtte gyldigheden af ​​farvning og identificere eksperimentelle artefakter, blev en positiv kontrol inkluderet i hver kørsel.
Sølv in situ hybridisering
Tofarve SISH blev udført ifølge INFORM HER2 Dual ISH DNAProbe cocktail og Ultraview SISH DNP Detection Kit /Ultraview RED ISH DIG Detection Kit til HER2 og Chr 17 kvantificering og procedure (Ventana /Roche). Begge prober blev mærket med 2,4-dinitrophenol (DNP) og digoxigenin (DIG). De væv Objektglassene blev deparaffineret med EZ Prep ved 65 ° C-76 ° C og varme forbehandlet med EZ Prep-fortyndet Cell Conditioner 2 (CC2) ved 90 ° C efterfulgt af protease fordøjelse med ISH Protease 3 i 16 minutter ved 37 ° C. De genomiske DNA vævssnit og nick-translaterede HER2 og CHR17 prober blev co-denatureret ved varmebehandling i 20 min ved 80 ° C efterfulgt af en hybridisering trin i 6 timer ved 44 ° C. HER2 signaler blev påvist under anvendelse af kanin-anti-DNP-antistof i 20 min ved 37 ° C og inkuberet med et HRP-konjugeret gede-anti-kanin-antistof i 16 minutter ved 37 ° C efter tre 8 min stringens vaske. Signalet blev detekteret som deponeret sølv med sølvacetat, hydroquinon og hydrogenperoxid. For Chr 17 påvisning blev objektglassene inkuberet med muse-anti-DIG-antistof i 20 min ved 37 ° C og med en AP-konjugeret gede-anti-muse-antistof i 24 minutter ved 37 ° C. Den Chr 17 signal blev udviklet som red dot farvning med hurtig rød og naphthol fosfat. Glassene blev endelig modfarvet med hæmatoxylin II og blåneringen reagens før montering.
Gene /protein
Gene /protein-platform kombinerer IHC og SISH på ét dias. For at understøtte gyldigheden af ​​farvning og identificere eksperimentelle artefakter, blev en positiv kontrol indgår i hver run.For HER2 protein farvning og for HER2 /Chr 17 hybridisering, blev iView DAB Detection Kit og Ultraview Detection Kits brugt. Prøverne blev farvet i henhold til flere af assay betingelser for at gennemføre en optimal protokol nødvendig for at opnå IHC /SISH farvningsresultater sammenlignes med individuel IHC og SISH test. Optimeringen blev udført i laboratoriet af Ventana (Roche) og delvis i eget arbejde. Optimale resultater blev opnået ved at udføre IHC proceduren ved SISH procedure.
Prøverne blev afparaffiniseret med EZ Prep ved 72 ° C i 6 cyklusser. For HER2-protein-farvning, vævssnittene blev varme forbehandlet i CC1 for antigen hentning ved 95 ° C og derefter inkuberet med anti-HER2 primære antistof ved 37 ° C i 48 min efter inaktivering af det endogene peroxidase under anvendelse af UV-inhibitor i 4 min ved 37 ° C. Objektglassene blev inkuberet med et biotinyleret sekundært antistof, efterfulgt af anvendelse af HRP-konjugeret streptavidin i 8 min. En kobber forbedret DAB reaktion blev anvendt til at visualisere proteinet. For HER2 genet og CHR17-farvning blev prøver varme forbehandlet med EZ Prep-fortyndet CC2 ved 90 ° C i fire cyklusser efterfulgt af protease fordøjelse med ISH Protease 2 i 12 minutter ved 37 ° C. Proberne blev denatureret i 4 minutter ved 80 ° C og hybridiseret i 6 timer ved 44 ° C under anvendelse af en cocktail af DNP- og DIG-mærkede prober. HybClear opløsning blev tilsat for at blokere interaktionen mellem DNP og DAB deponering under hybridisering. Genet signaler blev påvist under anvendelse af kanin-anti-DNP-antistof i 16 minutter ved 37 ° C og inkuberet med et HRP-konjugeret gede-anti-kanin-antistof i 16 minutter ved 37 ° C efter fire 8 min stringens vaske. Signalet blev udviklet af sølv bundfald med sølvacetat, hydroquinon og hydrogenperoxid. For Chr 17 påvisning blev objektglassene inkuberet med muse-anti-DIG-antistof i 16 minutter ved 37 ° C og med en AP-konjugeret gede-anti-muse-antistof i 24 minutter ved 37 ° C. Den Chr 17 signal blev udviklet som red dot farvning med hurtig rød og naphthol fosfat. Før montering, blev slides kontrastfarvet med hæmatoxylin II i 8 min og blåneringen reagens til 4 min.
Patologi review
Prøverne blev selvstændigt fortolket af en patolog (AB) og en biolog uddannet i mavekræft histologi (DW). Observatørerne modtog prøverne tilfældigt, dvs. SISH, IHC, og kombineret metode blev ikke evalueret i forbindelse med hinanden, men særskilt for hver patient. Konsensus af både korrekturlæsere blev fundet efter hver evaluering. Fordi uoverensstemmende resultater mellem de to metoder kan være et resultat af intra-observatør variation snarere end forskelle i farvningen kvalitet, blev disharmoniske sager revurderes af en tredjepart observatør, der var blindet til resultaterne af den første evaluering, men vurderet de disharmoniske sager (metoder) i association med hinanden. Endelig enighed blev etableret mellem den tredje og observatørens primære observatører.
Den IHC resultater blev fortolket ved hjælp af scoring ordningen foreslås for mavekræft af Hofmann et al. [17] og Rüschoff et al. [18]: 0, ingen reaktivitet eller membranøs reaktivitet i < 10% af tumorcellerne; 1+, svag /lige akkurat synlig membranøs reaktivitet i > 10% af tumorcellerne; 2+, svag til moderat komplet, lateral eller basolaterale membranøs reaktivitet i > 10% af tumorcellerne; og 3+, stærk fuldstændig, lateral eller basolaterale membranøs reaktivitet i ≥ 10% af tumorcellerne. Salg In SISH- resultater, blev det samlede antal HER2 og kromosom 17-signaler talt i mindst 20 tumor cellekerner i to forskellige områder. HER2 /Chr 17-forhold blev fortolket i overensstemmelse med ToGA FISH scoring ordning for HER2 test i mave- og gastro krydset (GEJ) kræft som følger: < 2.0, HER2-genet ikke amplificeret; ≥ 2,0, HER2-forstærket [17]. En gennemsnitlig optælling af seks eller flere blev betragtet som forstærkes.
Statistisk analyse
Analysen var eksplorative med ingen foruddefinerede hypoteser eller prøve størrelse beregninger. Antallet af 100 patienter blev anset for tilstrækkeligt til at udføre de foreslåede statistiske test. Korrelationer mellem IHC /SISH og gen /protein blev estimeret ved hjælp Cohen's kappa koefficient (к). kappa værdi fortolkning af Altmann Med [19] blev anvendt: к > 0,81, meget god aftale; 0,61-0,80, god aftale; 0,41-0,60 moderat aftale; Fra 0,40 til 0,21, fair aftale; ≪ 0,20, svag aftale. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af WinStat software (R.Fitch Software, Version 2009,1).
Resultater
Patient karakteristika
Ninety seks af de 100 patientår sager var vurderbare. Et tilfælde blev udelukket på grund af fraværet af tumorceller og tre sager for fattige signaler i det indre SISH farvning.
Størstedelen af ​​patienterne var mænd (67,7%) og ≥ 65 år (70,8%) (tabel 1). Den kohorte består af patienter med adenocarcinom i midten for at distale mave (50,0%) eller GEJ (45,8%) med flere tilfælde af Lauren`s tarm (67,7%) end diffuse tumorer (28,1%). Indplaceringen af ​​de fleste prøver var G3 (50,0%) efterfulgt af G2 (39,6%) og tumorer klassificeret som G2-3 (10,4%). 85,7% af resektion patienter (n = 28) viste lymfeknudemetastase (N etape) og 64,3% viste ingen fjerne metastaser (M fase). I halvdelen af ​​de resektion patienter, sås T3 tumor scenen, efterfulgt af T2 i 28,6%, T1 i 14,3% og T4 etape i 7,1% af patients.Table 1 patientens karakteristika og HER2 positivitet af undergrupper

I alt n = 96 (%)
Positivitet * (IHC 3+ eller SISH +) enkelt n (%)
Positivitet * (IHC 3+ eller SISH +) combi n (%)
Sex
Kvindelige
27 (28.1)
2 (7.4)
1 (3.7)
Male
65 (67,7)
11 (16,9)
11 (16,9)
Ukendt
4 (4.2)
3 (75,0)
3 (75,0)
Age
18-94 år (Median 69)
≥ 65
68 (70,8)
12 (17,6)
11 (16,2)
< 65
28 (29,2)
4 (14.3)
4 (14.3)
Primær tumor placering
Mid til distale mave
48 (50,0)
5 (10,4)
4 (8.3)
GEJ
44 (45,8)
8 (18.2)
8 (18.2)
Ikke specificeret
4 (4.2)
3 (75,0)
3 (75,0)
Lauren klassifikation
Diffus
27 (28.1)
3 (11,1)
2 (7,4)
Blandet
4 (4.2)
1 (25,0)
1 (25,0)
Intestinal
65 (67,7)
12 (18,5)
12 (18,5)
Biopsi /resektion
biopsi
68 (70,8)
10 (14,7)
9 (13,2)
resektion
28 (29,2)
6 (21,4)
6 (21,4)
T fase (n = 28)
T 1
4 (14.3)
0
0
T 2
8 (28.6)
2 (25,0)
2 (25,0)
T 3
14 (50,0)
4 (28,6)
4 (28,6)
T 4
2 (7.1)
0
0
N etape (n = 28)
N +
24 (85,7)
5 (20,8)
5 (28,8)
N -
4 (14.3)
1 (25,0)
1 (25,0)
M fase (n = 28)
M +
fem (17,9)
1 (20,0)
1 (20,0)
M -
18 (64,3)
3 (16,7)
3 (16,7)
Mx
5 (17,9)
2 (40,0)
2 (40,0)
Grading
G2
38 (39,6)
6 (15,8)
6 (15,8)
G2-3
10 (10,4)
2 (20,0)
2 (20,0)
G3
48 (50,0)
8 (16,7)
7 (14,6)
Forkortelser
: IHC
immunhistokemi, SISH
sølv in situ hybridisering T
primær tumor, N
lymfeknuder, M
metastaser * defineret som IHC 3+ eller SISH ≥2.0.
P
= 1 for alle sammenligninger mellem IHC /SISH og gen /protein metoder (Fisher eksakte test).
i tabel 1 HER2 positivitet efter undergruppe præsenteres også. Ingen væsentlig forskel blev bemærket i HER2 positivitet sammenlignet med undergrupper og forskellige metoder.
Farvningsresultater for HER2 proteinekspression og genamplifikation (enkelt farvningsmetoder)
proteinekspression scores ved IHC var 0 og 1 + i 70,8% og 10,4% af patienterne (tabel 2). 2,9% af score 0 og 10,0% af score 1 + sager blev forstærket. I 9,4% af tilfældene, en moderat udtryk (score 2 +) med 44,4% forstærkede tilfælde blev opdaget. 9,4% af de farvede prøver viste et stærkt udtryk (score 3 +) med 77,8% forstærkede sager. Figur 1 viser repræsentative resultater fra enkelte staining.Table 2 Farvning resultater for HER2 protein-ekspression og genamplifikation
Eneste metode
Kombineret metode
IHC Score
IHC (n = 96)
SISH ≥ 2,0
IHC (n = 96)
SISH ≥ 2,0
n (%)

n (%)
n (%)
n (%)
0
68 (70,8)
2 (2.9)
68 (70,8)
2 (2.9)
1+
10 (10,4)
1 (10,0)
11 (11,5)
1 (9.1)
2+
9 (9,4)
4 (44,4)
7 (7.3)
2 (28,6)
3+
9 (9,4)
7 (77,8)
10 (10.4)
9 (90,9)
Forkortelser
: IHC
immunhistokemi, SISH
sølv in situ hybridisering
Figur 1 Repræsentative resultater af de forskellige farvning metoder.. Intestinal tumor (hematoxylin og eosin (H &E), A.1, 20x) med IHC 3+ (immunhistokemi (IHC), A.2, 20x, gen /protein, A.4, 20x) og amplifikation (sølv in situ hybridisering (SISH), A.3, 40x, gen /protein, A.4, 20x). IHC score 0 (IHC, B.2, 20x; gen /protein, B.4, 40x), intestinal type (H &E, B.1, 20x) og forstærkning (SISH, B.3, 40x; gen /protein , B.4, 40x).
Gene /protein (kombineret farvning metode)
proteinekspression point ved gen /protein-metoden var 0, 1+, 2+, og 3+ i 70,8%, 11,5%, 7,3 % og 10,4% (tabel 2). Der var 2,9% /9,1% forstærket sager i prøver med score 0 /1+. 28,6% amplificerede tilfælde viste en moderat farvning (score 2+). Prøver med høj ekspression (3+) viste i 90,9% genamplifikation. Eksempler på gen /protein farvning er demonstreret i figur 1.
Evaluering af overensstemmende og uharmoniske tilfælde
Vurderingen af ​​IHC farvning i den konventionelle single og genet /protein metode ikke altid afsløre kongruente resultater; aftaler af begge metoder blev også opført i tabel 3 Der var meget gode konkordanser i resultaterne af forstærkede sager (aftale 100,0%; Kappa-koefficient κ = 1) samt score 0 (100%; κ = 1), score 1+ ( 98,96%, κ = 0,947) og score 3+ tumor prøver (96,88%; κ = 0,825) i begge metoder. Sager med score 2+ viste mindre konkordans, men stadig god (95,83%; κ = 0,728). Overensstemmelse mellem den samlede HER2 positivitet (defineret som IHC 3+ eller SISH +) i standard eller en ny metode var meget god (98,69%; κ = 0,963; 17,7% vs. 16,7%) Tabel 3 Konkordanser mellem enkelte metoder og kombineret gen /protein. metoder
Enkelt vs. kombination
Overensstemmelse
Kappa-koefficient к
aftale Altmann [[15]]
SISH forstærkes
100 %
1
Meget god
IHC score 0
100%
1
Meget god
IHC score 1+
98,96%
0,947
Meget god
IHC score 2+
95,83%
0,728
god
IHC score 3+
96,88%
0,825
Meget god
Forkortelser
: IHC
immunhistokemi, SISH
sølv in situ hybridisering.
Der var tolv afvigende sager inden en ny analyse af et tredje observatør (data ikke vist). Efter revurdering af en tredje observatør, afvigende resultater forblev i fire tumorprøver. Årsagen til de otte afvigende tilfælde i den foreløbige analyse viste sig at være inden for observatør variation. Resultaterne af de endelige uoverensstemmende resultater er vist i tabel 4.Table 4 Detaljeret vurdering af uoverensstemmende resultater mellem metoder
Enkelte metoder
Kombineret metode
Case
Histologi (Lauren)
IHC (score)
SISH (≥ 2,0 /< 2,0)
IHC (score)
SISH (≥ 2,0 /< 2,0)
6693
jeg
2+
≥2.0
3+
≥2.0
9924
jeg
2+
< 2,0
1+
< 2,0
20209
jeg
2+
≥2.0
3+
≥2.0
1057
d
3+
< 2,0
2+
< 2,0
Forkortelser
:. IHC
immunhistokemi, SISH
sølv in situ hybridisering diskussion
Formålet med denne undersøgelse var at vurdere mulighederne for nye gen /protein platform i forhold til de enkelte farvningsmetoder i gastriske adenokarcinomer og carcinomer i esophagogastric junction.
af de evaluerbare prøver 28,1% viste en diffus, 4,2 % en blandet og 67,7% en tarm histologisk type. Størstedelen af ​​patienterne var ≥ 65 år (70,8%) og mandlige (67,7%). Hastigheden af ​​adenocarcinom i GEJ eller midt på distal mave var ens (45,8% vs. 50,0%). I standard metode, 17,7% af patienterne var HER2-positiv. Størstedelen af ​​HER2-positive tumorer var af intestinal histologi og blev lokaliseret i GE junction, dette korrelerer godt med data for litteraturen [20, 21]. Samlet set er baseret på patientens og tumor egenskaber samt HER2 positivitet, den evaluerede gruppe er et repræsentativt kollektiv.
Selvom betydelig erfaring for HER2 analyse af IHC og ISH for brystkræft er tilgængelig, er det ikke sikkert, om de kan være direkte overført til carcinomer i mave-tarmkanalen. Ekspressionen af ​​HER2-protein, i modsætning til i karcinom i brystet, er heterogene og ofte fokalt udtalt. Fox et al. [12]. bestemmes HER2 status i 100 vævsprøver diagnosticeret med fremskreden mavekræft eller kræft i esophagogastric krydset i forskellige laboratorier til at teste deres kampe. Til dette, IHC og CISH (chromogent in situ hybridisering) eller SISH blev anvendt. Der var en god overensstemmelse mellem de forskellige laboratorier med hensyn CISH eller SISH, men blev observeret moderat konkordans for alle IHC scoringer. Baseret på resultaterne af undersøgelsen, forfatterens mening var, at en bestemmelse af HER2-status baseret på IHC, efterfulgt af ISH (europæisk standard) er ikke en optimal evalueringsstrategi og anbefalede udfører både farvning metoder [12]. En anden undersøgelse [22] testet HER2 amplifikation og udtryk i 148 patienter med fremskreden gastrisk karcinom ved IHC og FISH /SISH. Positive HER2 tilfælde blev påvist i kun 10% af IHC sammenlignet med 18% til 22% i in situ-hybridisering. Ikke kun fordi det var nemmere at reproducere, forfatteren foreslog in situ hybridisering teknik som den bedre tilgang til bestemmelse af HER2 positivitet [22]. Men baseret på Toga retssagen [8], patienter med ISH positiv men IHC negativ eller ugentligt (1+) positive tumorer ikke gavn af trastuzumab. Derfor er brugen af ​​FISH eller SISH som den primære og eneste metode anbefales ikke i Europa og IHC er stadig betragtes som den primære evalueringsmetode i mange lande.
Så vidt vi ved, men der er ingen undersøgelser, der direkte sammenligne resultaterne af både immunhistokemi (IHC) og sølv in situ hybridisering (SISH), når hver anvendes separat med resultaterne ved at anvende dem i kombination på en enkelt sektion i gastriske carcinomer. At visualisere RNA og DNA in situ, er der forskellige måder at mærkning af prober under anvendelse af fluorescens, kromogent eller sølv detektion. Alle tidligere studier med indstillinger sammenlignelige med vores analyse anvendes kromogene eller fluorescens in situ hybridisering (CISH eller FISH). Downs-Kelly et al. [14] kombineret standard IHC med en aflejring af metallisk sølv ved EnzMetTM på en væv microarray (TMA) af brystcarcinomer og sammenlignet resultaterne af IHC og fluorescens in situ hybridisering (FISH), når der udføres alene. I en anden undersøgelse har forfatterne faktisk anvendes kombinationen af ​​IHC og sølv in situ hybridisering (SISH) i TMA af bryst- og mavekræft prøver, men sammenlignet resultaterne af de, der opnås ved IHC og fluorescens in situ hybridisering (FISH) som enkelt farvning [16]. Reisenbichler et al. [15] rapporterede resultaterne af sammenligningen af ​​IHC og kromogen in situ hybridisering (CISH) som enkelte farvninger med den dobbelte assay IHC /CISH. Den samtidige vurdering af protein og gen-kombinationer på en enkelt dias tilbydes en særdeles reproducerbar og meget robust metode med gode konkordanser.
At teste validiteten af ​​det nye gen /protein farvning sammenlignet med den standardiserede IHC og SISH blev konkordanser beregnet baseret på kappa koefficient. Ifølge retningslinjerne for ASCO /CAP for brystkræft, bør en ny test viser mere end 95% konkordans med en valideret henvisning assay [23]. I vores undersøgelse, den nye metode viste konkordanser over 95% målt på alle prøveresultater. Der var meget gode konkordanser i resultaterne af genamplifikation samt score 0 (hver med 100% overensstemmelse), score 1+ (98,96% aftalen) og score 3+ tumor prøver (96,88% aftale). Sager med score 2+ viste mindre samstemmende resultater, selv om der stadig god (95,83% overensstemmelse). Vanskeligheder med sager med moderat udtryk i vurderingen og klassificeringen er kendt i litteraturen. TAFE et al. [24]. viste, at der var problemer med at tildele en endelig score i evalueringen af ​​IHC på grund af mangel på pålidelig adskillelse af sager med en HER2 score på 1 + eller 2 +. Disse kategorier kan være begrænset af subjektivitet og dårlig reproducerbarhed. Det fænomen, uoverensstemmende resultater observeres hos patienter med lavt HER2 udtryk, der undertiden stadig har HER2 genamplifikation, er blevet rapporteret i kræft i spiserøret [24-26]. Den mest sandsynlige årsag til denne uoverensstemmelse er intra-tumor heterogenitet HER2 status i gastrisk eller GEJ cancer [17, 27, 28]. I vores undersøgelse blev uharmoniske IHC resultater observeret hos fire patienter, men disse har ført til en klinisk relevant forskel i HER2-positivitet i en patient kun (patienti7). Patienten havde diffus form mavekræft. Evalueringen af ​​diffuse tumorer synes at være vanskeligere end intestinale typen tumorer [29, 30]. Ifølge Rüschoff et al. [18]. kun 5% af disse tumorer viser HER2 positivitet; signet ring celle karcinomer er negative. HER2 amplifikation er ekstremt sjældne i diffus gastrisk carcinom, der er associeret med unormal E-cadherin-ekspression [13, 31-33].
SISH er en relativt ny metode til påvisning af amplifikation af HER2 genet. Talrige undersøgelser har bekræftet en høj konkordans med andre in situ hybridisering metoder som CISH og FISH [34]. Sammenlignet med IHC, ISH viser en højere følsomhed og specificitet og en højere reproducerbarhed. Denne erklæring kan bekræftes ved at sammenligne overensstemmelsen af ​​forstærkede sager i vores metoder. Resultaterne viste en meget god overensstemmelse mellem de to metoder (100,0%; к = 1). Desuden ISH er mindre følsom end IHC på grund af en relativ stabilitet i DNA i forhold til forskelle i væv fiksering og forarbejdning.
Vi arbejder i øjeblikket på en udvidet undersøgelse at vurdere, om denne nye metode er forbundet med en reduktion af inter-observatør variabilitet i bestemmelsen af ​​HER2-status i gastrisk cancer. Denne undersøgelse omfatter også en komponent ser på den nødvendige tid til at rapportere endelige resultater. Resultaterne vil blive forelagt for tidsskriftet som brev eller en original rapport, så snart de er tilgængelige.
Konklusioner
I denne undersøgelse har vi tydeligt vist, at anvendelse af den kombinerede metode til at udføre HER2 protein-ekspression og genamplifikation på en enkelt side kan frembringe resultater, der ligner dem, der bruger hver metode individuelt i en kontrolleret undersøgelse gennemførelse tre uafhængige observatører. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Langsigtede virkninger af laparoskopisk ærme gastrektomi versus roux-en-Y gastrisk bypass til behandling af kinesiske type 2-diabetes mellitus patienter med BMI 28-35 kg /m2
• Polymorfier af TGFB1 og VEGF gener og overlevelsen af ​​patienter med mavekræft