Genominlaajuisten geenikopiomäärä ja ilmaisun analyysi ensisijainen mahalaukun kasvaimet ja mahasyövän solulinjoissa

Genominlaajuisten geenikopiomäärä ja ilmaisun analyysi ensisijainen mahalaukun kasvaimet ja mahasyövän solulinjoissa
tiivistelmä
tausta
Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia maailmanlaajuisesti ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvä kuolema. Geenikopiomäärä muutoksiin on tärkeä rooli kehitettäessä mahasyövän ja muutos geenikopiomäärä on yksi tärkeimmistä mekanismeista syöpäsolu ohjaamaan ilmentymistä mahdollisten onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille. Tool Menetelmät
Voit korostaa geenit mahdollisten biologisten ja kliinistä merkitystä mahasyövän, suoritimme järjestelmällisesti array-pohjainen kysely geeniekspression ja kopioluvun tasoilla ensisijainen mahalaukun kasvaimet ja mahasyövän solulinjoissa ja validoitu tulokset käyttäen Affiniteettisieppausreaktiot perustuva transkriptio analyysi ( TRAC määritys) ja reaaliaikainen qRT-PCR.
tulokset
Integrated mikrosiruanalyysi paljasti kokonaan 256 geeniä, jotka oli sijoitettu toistuvia alueilla tai -tappioita ja oli vähintään 2-kertainen kopio numero- liittyvät muuttaisi niiden geenin ilmentymistä. Ilmentymistasojen 13 näiden geenien, ALPK2
, ASAP1, CEACAM5
, CYP3A4, ENAH
, ErbB2:
, HHIPL2
, LTB4R
, MMP9
, PERLD1
, PNMT
, PTPRA
, ja OSMR
, validoitu vuonna yhteensä 118 mahalaukun näytteistä käyttäen joko qRT-PCR tai TRAC määritys. Kaikki nämä 13 geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä syöpä- näytteitä ja ei-pahanlaatuisten kudosten (p < 0,05) ja yhdistyksen välillä kopiomäärä ja geeniekspression muutokset validoitiin yhdeksän (69,2%) näistä geeneistä (p < 0,05).
johtopäätös
Lopuksi integroitu geenien ilmentyminen ja kopioluvun mikrosiruanalyysillä korostettuna geenejä, jotka saattavat olla ratkaisevan tärkeää mahasyövän. TRAC ja qRT-PCR-analyysit validoitu mikromatriisi tuloksia ja siksi rooli näiden geenien mahdollisina biomarkkereita mahasyövän.
Tausta
puutteen vuoksi varhaisen oireita mahalaukun adenokarsinoomaa on ominaista myöhäisessä vaiheessa diagnoosi ja epätyydyttävä vaihtoehtoja parantava hoito [1, 2]. Laskusta huolimatta sen esiintyvyys on viime vuosikymmeninä mahasyövän edelleen toiseksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [3]. Noin 90% kaikista syöpien ovat adenokarsinoomat, jotka johtuvat epiteelin [4]. Mukaan Laurén luokittelun mahasyövistä jaetaan kahteen histologinen alatyyppi, suoliston ja hajanainen [5].
Mahalaukun adenokarsinooman, kuten monet muut kiinteiden kasvainten epiteelin alkuperä, ovat usein monimutkaisia ​​kannalta kromosomi eheyden [6, 7]. Pahanlaatuiset mahalaukun kasvaimet tiedetään kantavan useita poikkeavuuksia niiden genomiin ja tällaiset kromosomi muutokset ovat ratkaisevia aktivaatio ja inaktivaatio syöpään liittyvien geenien [8-17]. Geenikopiomäärä muutos on yksi tärkeimmistä mekanismeista syöpäsolu kontrolloida geenien ilmentymistä keskeinen solujen selviytymiseen ja syövän etenemistä [17-22]. Nämä kopioluvun muutoksia liittyy usein suuri joukko geenejä lähellä toisiaan samassa kromosomissa. Esimerkiksi; in mahasyövistä usein monistettu 17q12-q21 alue sisältää geenejä, kuten ErbB2
, GRB7
, JUP
, PERLD1, PNMT
, PPP1R1B
, STARD3
, ja TOP2A
[14, 17, 23]. Kuitenkin vain pieni osa näistä geeneistä ovat todennäköisesti totta syöpä kuljettaja geenit vaikuttavat kasvainten kehittymiseen, kun taas toiset voidaan monistaa yksinkertaisesti, koska ne kromosomi läheisyyttä vahvistus kohdegeeneissä [24, 25]. Eräs lähestymistapa erottaa tällaista kuljettajan geenejä matkustajan mutaatioiden on integroida genominlaajuisten kopioluvun ja ekspressiotietojen, joka mahdollistaa tunnistamisen geenejä, joiden transkription aktivaation tai repression liittyy kopionumerolla muutos syöpäsolu. Siten yhdistämällä tietoja korkearesoluutioisen geenikopiomäärä ja ilmaisun mikrosiruja, on mahdollista paitsi määritellä raja-arvot kopioluvun muutoksia yksityiskohtaisesti, mutta myös arvioida toiminnallista Näiden muutosten merkitystä ja siten mahdollisesti tunnistaa geenejä, jotka ohjaavat syöpä puhkeamista ja etenemistä.
korostamiseksi geenejä mahdollisten biomarkkereina tai kliinisen tavoitteet mahasyövän, suoritimme järjestelmällisesti korkean resoluution array-pohjainen kysely kopioluvun ja geeniekspressiotasot mahasyövän kudoksissa ja solulinjoissa. Meidän edellinen array-analyysi osoitti, että kopiomäärä voittoja ja tappioita satoja geenejä liittyy samanaikaisesti lisäys tai vähennys geeniekspression [17]. Tässä tutkimuksessa olemme lisänneet resoluutiota kopioluvun analyysi yli 20-kertainen tarkemmin visualisoida keskeytyskohdat kopion numeron muutoksia. Lisäksi olemme toteuttaneet transkription analyysi geenien sijaitsee muuttuneessa kromosomialueita tunnistaa geenit, joiden vapauttaminen liittyy pahanlaatuinen fenotyyppi. Tool Menetelmät
Mahasyöpää kudoksissa ja solulinjoissa
tutkimushanke on tarkistettu ja hyväksynyt eettinen komitea Lääketieteellisen genetiikan osasto ja Kirurgian ja valtuuttama Clinical Review Board of HYKS. Mahalaukun kudosnäytteet takautuvasti kerättiin potilailta, joille tehtiin mahalaukun leikkaus tai gastroskopia- että HYKS vuosina 1999 ja 2007. Tietoon perustuva suostumus saatiin kunkin osallistuvan potilaan. Kolmetoista tuore ensisijainen mahasyövän kudosten ja seitsemän mahasyövän solulinjat valittiin microarray-analyysi (taulukko 1). Kudos koostui kahdesta eri histologisia alatyyppejä, suoliston (n = 9) ja diffuusi (n = 4), ja kasvaimia sijaitsevat kahdessa eri vatsassa, corpus (n = 8) ja antrum (n = 5 ). Kaikkiaan 111 mahalaukun kudosten ja 7 mahasyövän solulinjat kuuluivat qRT-PCR ja Affiniteettisieppausreaktiot perustuu transkripti määritys (TRAC) analysoi (Additional tiedosto 1: Clinical parametrit). Kudosnäytteiden koostui 43-pahanlaatuisten ja 68 syöpä- mahalaukun kudoksiin ja molemmat histologisia alatyyppejä mahasyövän olivat edustettuina (suolen, n = 42; hajanainen, n = 25; yksi tuntematon histologia). Mahalaukun kudos- näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa. Voit tarkistaa kasvain prosenttiosuus ja histologia näytteistä, pakastetut näytteet upotettiin Tissue-Tek lokakuu Yhdistettä (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) ja 5 pm jäinen jää-osat valmistettiin ja värjättiin käyttäen trypaanisineä. Histologia mahalaukun syövän näytteiden arvioitiin kokenut patologi (M.-L. K.-L.). Tissue-Tek poistettiin kudoksista ennen nukleiinihappo- extractions.Table 1 kliiniset parametrit näytteet analysoitiin joukko vertailevaa genomista hybridisaatiota (aCGH) ja ilmaisun mikrosiruja.
Ensisijainen maha- tumors

Age/sex

Histology

Location

14TA
58/M
Intestinal
Corpus
200A
57/F
Intestinal
Corpus
222A
50/M
Intestinal
Corpus
232A
83/M
Intestinal
Corpus
3TC
57/F
Intestinal
Corpus
4T/N
72/M
Intestinal
Corpus
10TB
59/M
Intestinal
Antrum
17TA
77/M
Intestinal
Antrum
185B
78/F
Intestinal
Antrum
1AT/N
41/F
Diffuse
Corpus
6TB
77/F
Diffuse
Corpus
9TD
74/F
Diffuse
Antrum
13TA
56/F
Diffuse
Antrum
Mahalaukun syöpä solulinjoja
ikä /sukupuoli
Histologia
Alkuperä
AGS
54 /F
adeno-karsinooma
Ensisijainen kasvain
KATOIII
55 /M
Diffuusi
Pleuraeffuusio
MKN-1
72 /M
adeno-levyepiteelikarsinooma syöpä
Imusolmuke etäpesäke
MKN-7
39 /M
Suoliston
Imuneste etäpesäke
MKN-28
70 /F
Suoliston
Imusolmuke etäpesäke
MKN-45
62 /F
Diffuusi
Maksa etäpesäke
TMK-1
21 /M
Diffuusi
Imusolmukkeen etäpesäkkeiden
AGS ja KATOIII solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) ja MKN-1, MKN-7 , MKN-28, MKN-45, ja TMK-1 solulinjat olivat ystävällinen lahja Hiroshi Yokozaki, Koben yliopiston Graduate School of Medicine, Kobe, Japan [26]. AGS-soluja kasvatettiin Kaighn F12-väliaine (2 mM glutamiinia, 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä-streptomysiiniä), KATOIII soluja IMDM väliaineessa (2 mM glutamiinia, 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä-streptomysiiniä) ja kaikki muut solulinjat RPMI-1640-väliaineessa (10% FCS: ää, 2 mM glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä-streptomysiiniä). Kaikki solut kasvatettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO 2.
RNA ja DNA: n eristämiseksi
Ennen RNA: n ja DNA: n uuttoa, jäätynyt kudos upotettiin RNAlater-ICE-reagenssia (Ambion, Austin, TX , USA) ja säilytettiin -80 ° C: ssa 16 tunnin ajan vakauttaa RNA. Puolet kudosnäyte (~ 25 mg) homogenoitiin RLT-β-merkaptoetanoli lyysipuskuria (RNeasy mini kit, Qiagen Inc., Hilden, Saksa) ja toinen puoli ATL-puskurissa (DNeasy Veri ja Tissue Kit, Qiagen) käyttäen Ultra-Turrax homogenisaattorilla (IKA Works, Wilmington, NC, USA). RNA uutettiin käyttäen RNeasy mini kit, mukaan lukien valinnainen DNaasikäsittely, ja DNA: lla käyttäen DNeasy Veri ja Tissue Kit. Mahasyövän solulinjoja, 1 x 10 7-solut hajotettiin käyttäen ruiskua ja neulaa joko RLT-β-merkaptoetanoli lyysipuskuria tai ATL-puskuria ennen RNA: n ja DNA: n uuttoa, vastaavasti. RNA ja DNA mitattiin käyttämällä NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja RNA laatu arvioitiin käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Vain RNA: t osoittavat selvästi 18S ja 28S ribosomaalinen huiput Bioanalyzer analyysiin ja suhde 260/280 yli 2,0 hyväksyttiin lisäanalyysiä.
Array CGH ja geenien ilmentymisen mikrosirujen analysoi
Kolmetoista mahalaukun kasvaimet ja seitsemän mahasyövän solulinjoja analysoitiin on 244K Human Genome CGH oligoarrays (G4411B, Agilent Technologies). Kolme kasvaimia ja kaikki seitsemän solulinjojen analysoitiin myös käyttämällä 44K kaikkiaan Human Genome geenin ilmentymistä oligoarrays (G4112F, Agilent Technologies) (kuvio 1). Keskimääräinen suhde 260/280 nämä näytteet olivat 2,1 ja RNA: n ja 1,8 DNA, ja kaikki RNA-näytteet oli selvää, 18S ja 28S-ribosomi-piikkien Bioanalyzer analyysi indikoi hyvää laatua (tietoja ei esitetty). Array CGH kokeet tehtiin käyttäen ihmisen genomista CGH Microarray 244A Kit (Agilent Technologies). Leimaus ja hybridisaatio suoritettiin Agilent protokollan (v5.0, kesäkuu 2007). Lyhyesti, 1,5 ug näyte-DNA ja 1,5 ug sukupuoleen sovitettu viite DNA (ihmisen genomista DNA, Promega, Madison, WI, USA) oli kaksinkertainen pilkottu Alul
ja RsaI
restriktioentsyymeillä (Promega). Digestoitu DNA leimattiin käyttämällä Agilent Genominen DNA Labeling Kit Plus. Näyte-DNA leimattiin Cy5-dUTP ja viite DNA Cy3-dUTP, vastaavasti. Leimattua DNA: ta puhdistettiin Microcon YM-30-suodattimet (Millipore, Billerica, MA, USA). Sen jälkeen, kun puhdistus, näyte ja viite-DNA: t yhdistettiin ja hybridisoitiin array 50 ug ihmisen Cot-1 DNA: ta (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 65 ° C: ssa, nopeudella 20 rpm 40 tunnin ajan. Hybridisaatio suoritettiin Agilent Oligo aCGH Hybridisaatio Kit. Ennen skannaus, levyjä pestiin protokollan mukaan. Sen lisäksi, että näyte-DNA: hybridisaatiot edellä on kuvattu, viitaten uros DNA (Cy3) hybridisoitiin vastaan ​​viite naisten DNA (Cy5), noudattaen samaa protokollaa, jota käytetään viitteenä array aCGH data-analyysi. Kuva 1 Vuokaavio kuvataan eri vaiheita tutkimuksen.
Geenien ilmentyminen kokeet tehtiin käyttämällä kaikkiaan Human Genome Oligo Microarray Kit (Agilent Technologies), ja merkinnät ja hybridisaatio mukaan Agilent protokollan (v5.7, maaliskuu 2008). Lyhyesti, 2 ug kokonais-näytteen RNA: n ja viite-RNA (pooli 10 syöpäsolulinjoja, ei-mahalaukun, ATCC, Manassas, MA, USA) leimattiin käyttäen Agilent Lyhyt Amp Labeling Kit. Näyte RNA leimattiin Cy5-dCTP ja viite DNA Cy3-dCTP, vastaavasti. Leimattua RNA: ta puhdistettiin sitten käyttämällä RNeasy mini spin pylväät (Qiagen). Hybridisaatio suoritettiin Agilent Gene Expression hybridisaatio Kit ja näytteet hybridisoitiin 65 ° C: ssa, 10 rpm 17 tunnin ajan ja pestiin protokollan mukaan ennen skannausta. Sekä aCGH ja geenien ilmentymisen mikrosirujen Levyt skannata DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies) ja analysoitiin Feature Extraction Software (v9.5.1.1.).
Korkean resoluution kopioluvun profilointi
Kaikki kopiomäärä data on saatavilla osoitteessa http: //www. cangem. org (hakunumero: CG-EXP-49) [27]. Agilentin CGH Analytics ohjelmisto (v3.5.14) levitettiin tunnistamaan kopioluvun muutoksia. Microarray aineisto laatu suodatetaan kyseisellä harha saatuja tietoja Feature Extraction analyysiin. Koettimet merkitty harha poistettiin lisäanalyysiä. Lisäksi seuraavat poikkeavuus suodattimia sovellettiin: vähimmäismäärä koettimien alueella = 3, pienin absoluuttinen log 2 suhde alueelle = 0,27, ja enimmäismäärä poikkeavien alueiden = 1000. log 2 suhde 0,27 vastaa 1,2-kertainen muutos kopioluku. Vuonna CGH Analytics, kukin aCGH suhdetta muutetaan ensin log 2-suhde, jota seuraa Z-normalisointi. Uros vs. nainen viitematriisi käytettiin kalibroinnin array tietojen analysoinnin. Koska sukupuolten väliset erot paneelit, jotka voivat aiheuttaa bias analyysissa, kromosomien X ja Y jätettiin kalibrointi. ADM-2 algoritmi kynnysarvon 12,0 käytettiin tunnistamaan geenikopiomäärä muutoksia yksittäisten näytteiden ja solulinjojen. Vähäinen yhteinen alueilla muutoksia 20 näytettä laskettiin, kuten koon ja kromosomaalinen asema muutoksen emäsparia. Poikkeavuus määriteltiin toistuvat, jos se oli läsnä vähintään 25% näytteistä (taulukko 2) .table 2 Vähäinen yhteinen alueiden toistuvien (≥25%) kopioluvun muutoksia.
muuttaminen
kudokset (n = 13)
Solulinjat (n = 7)
Frequency

Koko (Mb)
kanta (Mb)
Mahdollinen kohdegeenien
+ 1q41-q43.1
2
3
25 %
17.30
+216,31-233,61
ENAH, AGT, CAPN2, LEFTY2, LGALS8
+ 5p13.3-q11.1
1
4
25%
19.41
30,18-49,60
OSMR, RNASEN
+ 7q21.3-q22.1
4
3
35%
4,60
97,33-101,93
CYP3A4, AZGP1, VGF
+ 8q24.13-q24.3
3
2
25%
19,8
+126,45-146,25
ASAP1, BAI1, KHDRBS3
+ 8q24.3
6
3
45%
2,23
+143,59-145,82
GML, LYPD, AK3

+ 14q11.2
0
5
25%
1.05
22,89-23,94
LTB4R
+ 17q12-q21.1
3
3
30%
0,28
35,02-35,30
ErbB2, PPP1R1B, PERLD1, PNMT
+ 17q22-q24.2
2
3
25%
13,65
50,45-64,10
AXIN2, RNF43
+ 19q12-qter
4
3
35%
29.36
33,89-63,25
CEACAM5, APOC1, APOE, CEACAM7, FTL, FUT1, GPR4, HPN, KCNN4, KLK1, KLK12, LYPD3, NLRP7, CCNE1
+ 20p13-qter
5
3
40%
57,94
0,04-57,98
PTPRA, BLCAP, CD40, CHGB, CST3, EYA2, PI3, ID1, MMP-9, BMP7
-9p24.3-p21 0,1
3
4
35%
27.81
1,05-28,86
MTAP, CD274, INSL4, JAK2, MLANA, SMARC2, TUSC1
-18q12. 3-q22.2
3
5
40%
26.11
39,48-65,59
Smad7, SERPINB2 /B3 /B4 /B5
-18q22.3 -qter
2
5
35%
3,69
70,95-74,65
TSHZ1
-21q11.2-q21.1
3
3
30%
4,07
14,37-19,44
HSPA13
-Xq28
4
1
25%
1.21
152.24- 153,45
-
tapausten lukumäärä, koko minimaalinen yhteisten alueiden (Mb), ja kromosomaalinen asema muutos (Mb) on merkitty mahdollisimman hyvin kohdegeenien. CNV alueita ei ole esitetty taulukossa. Kopioi vahvistuksenkertojan (+), kopiomäärä tappio (-).
Geenien ilmentyminen mikrosiruanalyysi
Kaikki geenien ilmentyminen tietoja on saatavilla osoitteessa http: //www. Cangem. Org (hakunumero: CG-EXP -49) [27]. Microarray tuloksia laatu suodatetaan harha määrittelemän Feature Extraction Software ja normalisoitu mukaan lössi menetelmää, joka oli mukana ohjelmistopaketti. Geeni-ilmentymisen analyysi rajoittuu geenit sijaitsevat kromosomin alueille, joilla on uusiutuva poikkeamia (taulukko 2). Tavoitteena Tämän lähestymistavan oli tuoda esiin geeniekspression muutoksia, jotka liittyvät muutoksiin geenikopiomäärä, ja voisi siten edustaa potentiaalisia onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille toimiva rooli syövän. Ensinnäkin, mediaani log 10 ilmaus suhde laskettiin kaikille koettimien kohdistaminen samasta geenistä. Sitten kahdessa erillisessä analyyseja voittoja ja tappioita, mediaani ekspressiotaso kunkin geenin verrattiin näytteiden välillä kopio määrä voitto /tappio ja näytteiden normaaliin kopioluvun vaikutuksen arvioimiseksi kopioluvun muutokset geenien ilmentymisen. Geenien ilmentyminen kertamuutoksia (FC) laskettiin joko jakamalla mediaani ilmaus syöpä näytteiden mediaani ilmaus pahanlaatuisten näytteiden tai jakamalla mediaani ilmaus syövän näytteiden kopioluvun muutokset (g1), jonka mediaani ilmaus syöpänäytteissä normaali kopioluku (g0). Vähintään 2-kertaista kopion useita liittyy muutos geenien ilmentyminen katsottiin merkitseväksi. Näiden tietojen perusteella, 13 geenit ALPK2
, ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, erbB2, HHIPL2, LTB4R
, MMP-9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
, ja PTPRA
, valittiin edelleen validoitava qRT-PCR-analyysi ja TRAC (transkriptio analyysin avulla Affiniteettisieppausreaktiot) määritys. Tulokset integroidun mikrosiruanalyysi verrattiin kolmea aikaisemmin julkaistuista tutkimuksista, jotka järjestelmällisesti integroitua genominlaajuisten kopiomäärä ja geenien ilmentyminen tietojen [15-17].
Reaaliaikainen qRT-PCR-analyysi
Reaaliaikainen qRT- PCR suoritettiin 2-geenien, ALPK2
(18q21.31-q21.32) ja HHIPL2
(1q41). Ilmaisu tasot mitattiin 82 mahan kudoksissa (46 syöpä- ja 36 ei-pahanlaatuisten kudosten) ja 7 mahasyövässä solulinjoissa (Additional tiedosto 1: Clinical parametrit). 1 ug kokonais-RNA: ta muutettiin cDNA: ksi käyttäen Moloney-hiiren leukemiaviruksen käänteistranskriptaasia (Promega, Madison, WI, USA) ja satunnaisia ​​alukkeita (Invitrogen), jonka tilavuus oli 50 ui 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Reaktio oli lämpöinaktivoitua (95 ° C, 3 min) ja täytetään lopulliseen tilavuuteen 200 ui molekyyli- laatuista vettä. Selostukset kvantitoitiin käyttäen Assays-on-DemandTM geenin ilmentymisen tuotteet (Hs01085414_m1 varten ALPK2
ja Hs00226924_m1 varten HHIPL2
) mukaisesti valmistajan protokollan (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kaikki alukkeet sijaitsevat eksonin eksonin rajoja. Lyhyesti, 2 ui cDNA-templaattia sekoitettiin 1,25 ui spesifisiä alukkeita ja koettimia leimataan FAM-reportterivärin. 12,5 ui TaqMan ® Universal PCR Mastermix ja RNaasi-vapaata vettä lisättiin niin, että kokonaistilavuudeksi 25 ui. Ihmisen 18S rRNA toimi endogeeninen kontrolli normalisoida ekspressiotasot seuraavassa kvantitatiivisen analyysin. 18S koetin leimattiin VIC-reportteriväriaineesta jotta multiplex PCR kohdegeenien. PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 50 ° C 2 min, 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. Jokainen näyte mitattiin kolmena kappaleena ja tulokset analysoitiin delta-delta vertailemiseksi suhteellisen ilmentymisen tulokset (2 - [Ct näytteen Ct ohjaus]).
TRAC määritys
Transcript analyysin avulla Affiniteettisieppausreaktiot (TRAC) määritys [28] tehtiin 11 eri geenien 88 mahan kudoksissa (53 syöpä- ja 35 ei-pahanlaatuisten kudosten) ja 7 mahasyövän solulinjoissa (Additional tiedosto 1: Clinical parametrit). Geenit mukana analyysissä olivat ENAH
(1q42.12), OSMR
(5p13.1), CYP3A4
(7q21.1) ASAP1
(8q24.1-q24.2), LTB4R
(14q11.2-Q12), PERLD1
(17q12), erbB2
(17q21.1), PNMT
(17q21-q22), CEACAM5
(19q13.1-q13 0,2), PTPRA
(20p13), ja MMP-9
(20q11.2-q13.1). Etuna TRAC määritys on, että ekspressiotasot useita geenejä voidaan mitata samanaikaisesti yhdestä näytteestä näin alentaa näytteen määrä RNA: ta tarvitaan analyysiä varten. Tämä on erityisen tärkeää, että analyysi on usein niukasti kliinistä kudosnäytteistä.
TRAC analyysi suoritettiin PlexPress (Helsinki, Suomi). Custom TRACPackTM reagenssit mRNA (PlexPress) käytettiin analyysiin. Lyhyesti, 90 ui hybridisaatio Mix (sisältävät leimatun geenispesifisiä detektiokoettimia ja biotinyloitu oligo-dT-koettimet) kuoppaa kohti annosteltiin 96-kuoppaiselle PCR-levylle. Kaksi mikrogrammaa RNA-näytettä levitettiin jokaiseen kuoppaan 100 ul: n reaktion kokonaistilavuus. Yhtä suuri määrä (30 amol /reaktio) yksijuosteisen 62-mer synteettistä oligonukleotidia hybridisaatio-ohjaus, mukaan lukien poly-A-hännän, lisättiin kuhunkin näytteeseen ennen hybridisaatiota. Hybridisaatio suoritettiin 60 ° C: ssa, 650 rpm: llä 120 minuutin ajan (Thermomixer mukavuus, Eppendorf, Hampuri, Saksa). Hybridisaation jälkeen Affiniteettisieppausreaktiot, puhdistus, ja eluutio tehtiin käyttäen KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Suomi) magneettinen partikkeli prosessori. Streptavidiini-kytketty magneettinen TRACPACK ™ helmiä (50 ug, PlexPress) lisättiin hybridisaatio- seokseen ja annetaan sitoutua biotinyloitu mRNA-koetin-oligo (dT) -hybrids 30 minuuttia, jonka jälkeen helmet pestiin 5 kertaa käyttäen pestä puskuri poistamiseksi sitoutumattoman materiaalin. Leimatun RNA-koettimet eluoitiin eluutiopuskurilla ja havaita kapillaarielektroforeesilla, käyttäen ABI3100 sekvensseri (Applied Biosystems, Cheshire, UK). Aineisto analysoitiin käyttämällä TRACParser ohjelmistoa (PlexPress).
Tilastollinen analyysi qRT-PCR data
nonparametric Mann-Whitneyn testi kahden itsenäisen näytteen käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi erojen suhteellinen mRNA ilmaisun tasot ALPK2
ja HHIPL2
in-pahanlaatuisten ja syöpä- mahalaukun näytteitä sekä mahasyövän näytteitä eri histologisia alatyyppejä tai TNM-vaiheissa. P-arvo < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä (SPSS 17.0). Lisäksi kahdessa erillisessä analyyseja voittoja ja tappioita, ekspressiotasot syöpänäytteissä kopio numero tai -tappioita (g1) verrattiin syövän näytteiden normaaliin kopioluku (G0) arvioimaan yhdistyksen välillä kopiomäärä ja geenien ilmentymisen. Kopioi numero oli saatavilla 37 mahalaukun näytteet ovat qRT-PCR-analyysi (Additional tiedosto 1: Clinical parametrit). Geenien ilmentyminen kertamuutoksia laskettiin jakamalla keskiarvo ilmaus yksi ryhmä (esimerkiksi syöpä näytettä), jonka keskiarvo ilmaus toisen ryhmän (esim pahanlaatuisten näytettä).
Tilastollinen analyysi TRAC koetulokset
synteettinen hybridisaatio ohjaus käytettiin datan normalisointi poistaa ei-biologinen vaihtelu tietoja. Kunkin kohde, signaalin intensiteetin suhteen tätä sisäistä hybridisaatiota valvonnan laskettiin. Yhdeksän kudosnäytteitä analysoidaan rinnakkaisten tarkoittaa signaalin intensiteettiä käytettiin. Parametristä Mann-Whitney-testi kahden itsenäisen näytteen käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi eroja suhteellinen mRNA: n ilmentymisen tasoja ASAP1
, CEACAM5
, CYP3A4
, ENAH
, erbB2: n, LTB4R
, MMP-9, OSMR
, PERLD1
, PNMT
, ja PTPRA
in-pahanlaatuisten ja syöpä- mahalaukun näytteitä sekä mahasyövän näytteitä eri histologisia alatyyppejä tai TNM-vaiheissa. P-arvo < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä (SPSS 17.0). Vertailu geeniekspressiotasot näytteissä ja ilman kopioluvun muutoksia tehtiin kuten kuvattiin aiemmin varten qRT-PCR-analyysi. Kopioi numero oli saatavilla 43 mahasyövän näytteet ovat TRAC määrityksessä analyysi.
Tulokset
geenikopiomäärä kromosomipoikkeavuuksien
Kaikki geenikopiomäärä muuttuu yksittäisissä näytteissä näkyvät Additional tiedosto 2: Kopioi numero muuttuu havaitaan aCGH analyysi. Minimaalinen yhteiset alueet toistuvien (≥25%) muutokset sekä niiden koko, tiheys, on mahdollista kohdegeenien, ja kromosomaalinen asema emäsparin on esitetty taulukossa 2. toistuvia saadut alueet sijaitsivat 1q41-q43.1 (25% ), 5p13.3-q11.1 (25%), 7q21.3-q22.1 (35%), 8q24.13-q24.3 (25%), 8q24.3 (45%), 14q11.2 ( 25%), 17q12-q21.1 (30%), 17q22-q24.2 (25%), 19q12-qter (35%), ja 20p13-qter (40%). Toistuva poistettu alueet sijaitsivat 9p24.3-p21.1 (25%), 18q12.3-q22.2 (40%), 18q22.3-qter (35%), 21q11.2-q21.1 (30 %), ja Xq28 (25%). Kaikki monistumia muutokset olivat havaittavissa sekä ensisijainen syöpien ja mahasyövän solulinjoissa, paitsi 14q11.2, joka muutettiin vain viidessä solulinjoissa.
Kopioi useita liittyy geeniekspression muutoksia
Kaikkiaan 256 yksilön geenit (10% kaikista geeneistä sijaitsevat toistuvia kromosomialueita kopio numero muutokset) osoitti ainakin 2-kertainen kopio useita liittyy muutos niiden ilmaisun (vaihteluväli 2,0-34,6, mediaani 3,8) (Additional tiedosto 3: Kopioi numero liittyvän geenin ilmentyminen muuttuu). 226 Näiden geenien yli-ilmennetään ja sijaitsee toistuvia alueilla kopioluvun voittoja, kun taas 30-geenit ali-ilmentynyt ja sijaitsee toistuvia alueilla kopioluvun tappioita. Kertainen muutos geenien ilmentyminen laskettiin vertaamalla ekspressiotasot näytteiden kopioluvun muutoksia näytteitä, joilla on normaali kopioluvun tietyn geenin. Siksi positiivinen kertainen muutos viittaa kopion vahvistuksenkertojan liittyvät kasvuun geeniekspression kun taas negatiivinen kertainen muutos tarkoittaa kopiomäärän tappiota liittyvä väheneminen geenin ilmentymisen.
HHIPL2
(HHIP kaltainen 2) geenin, monistettiin että 1q41-q43.1 alue, osoitti korkeinta kopiomäärä voitto liittyy yli-ilmentymisen mahasyövän mukaan integroidun mikrosiruanalyysi (FC = 26,9). Yleensä korkein geenien ilmentymisen kertamuutoksia välillä syöpänäytteissä ja ilman kopioluvun voitot havaittiin klo 19q alueella vuodesta ulos 40 geenit osoittavat > 5-kertainen kopio useita liittyy muutoksia niiden ilmaisun, 19 (47,5%) sijaitsi että 19q alueella (Additional tiedosto 3: Kopioi useita liittyy geenin ilmentyminen muuttuu). Kaikkein ali-ilmentynyt geeni toistuvat alueilla kopioluvun tappioiden oli ALPK2
(alfa-kinaasi 2) (FC = -34,6), joka sijaitsee 18q12.3-q22.2.
Aiemmin kolme tutkimusta meidän ja muiden on julkaistu, että systemaattisesti integroida genominlaajuisten kopiomäärä ja geenien ilmentyminen tietojen tunnistamiseksi geenejä, joiden ilmentyminen on muuttunut johtuen kopioluvun muutos mahasyövässä [15-17]. Vertailu päällekkäisten geenien näiden tutkimusten ja nykyisen Tutkimus paljasti 20 geenien TOMM20
(1q42.3), GGPS1
(1q43), CYP3A4
(7q21.1), MTAP
(9q21 0,3), ASAP1
(8q24.1-q24.2), PPP1R1B
(17q12), erbB2
(17q12-q21), SERPINB3
(18q21.3), SERPINB8
(18q21.3), WDR7
(18q21.2-q22), HIF3A
(19q13.32), ZNF480
(19q13.33), IL4I1
(19q13.3-q13.4 ), CST3
(20p11.21), PTPRA
(20p13), SLC13A3
(20q12-q13.1), DDX27
(20q13.13), PARD6B
(20q13.13 ), SGK2
(20q13.2), ja TUBB1
(20q13.32), joka oli joko saanut ja ilmentynyt tai poistetaan ja ali-ilmentynyt tutkimuksessamme ja ainakin yhdessä aiemmin julkaistujen tutkimusten. Aiemmin julkaistut tiedot ja nykyiset tulokset tarjoavat lisänäyttöä biologisen roolin näiden geenien mahasyövässä.
Validointi mahdollisia mahasyövän kohdegeenien
Reaaliaikainen qRT-PCR-analyysi osoitti, että ilmaus HHIPL2
oli 7,4 kertaa suurempi mahasyövän näytteissä verrattuna pahanlaatuisten mahalaukun kudokset (p < 0,05). Lisäksi yli-ilmentyminen HHILP2
oli merkitsevästi yhteydessä kopio vahvistuksenkertojan (p < 0,05), sillä se osoittaa HHIPL2
oli 17,4-kertainen syöpänäytteissä kopio määrä voitto HHIPL2
(g1 ) kuin syöpänäytteissä normaali kopioluku tämän geenin (g0) (taulukot 3 ja 4). Mukaan qRT-PCR-analyysi oli 2,9-kertainen ali ALPK2
mahalaukun syövistä kopio numero tappiot (g1) verrattuna mahasyövistä normaali kopioluku ALPK2
(G0) (p < 0,05 ). Yllättäen kuitenkin ekspressio ALPK2
mahalaukun syövistä yleisesti oli 1,9 kertaa suurempi (p < 0,05) kuin ei-pahanlaatuisissa mahan kudoksissa (taulukot 3 ja 4). Histologinen alatyyppi tai TNM-vaiheessa ei ollut tilastollisesti merkitsevää vaikutusta ilmaus HHIPL2
tai ALPK2
(taulukko 3) .table 3 tulokset nonparametric Mann-Whitneyn testi qRT-PCR ja TRAC analyysitiedot (SPSS17.0).
Gene
kromosomi
Cancer vs. hyvänlaatuisen
suoliston vs. hajanainen
g1 vs. g0
M0 vs. M1
T1-2 vs. T3-4

N0 vs. N1-3
ALPK2
18q21.31-q21.32
p < 0.05
p
= 0,104
p
< 0.05
p
= 0,451
p
= 0,072
p
= 0,378
ASAP1
8q24.1-q24.2
p < 0,001
p
= 0,319
p
= 0,396
p
= 0,208
p
= 0,232
p
= 0,289
CEACAM5
19q13.1-q13.2
p < 0,001
p
= 0,061
p
= 0,254
p
= 0,543
p
= 0,197
p
= 0,253
CYP3A4
7q21.1
p <

• Prognostic merkitys neutrofiilien lymfosyyttien suhteen ja verihiutaleiden lymfosyyttien suhde edennyt mahasyöpä potilaita hoidettiin FOLFOX chemotherapy
• Uutta menetelmää, digitaalinen genomin skannaus tunnistaa KRAS geenivahvistus mahasyövistä: osallistuminen yli-ilmentynyt villin tyypin KRAS loppupään signalointi ja syöpäsolujen growth