rôles intégratifs de facteur de croissance transformant α dans les mécanismes de cytoprotection de la muqueuse gastrique injury

rôles intégratifs de facteur de croissance transformant α dans les mécanismes de cytoprotection de lésion de la muqueuse gastrique
Résumé de l'arrière-plan
Transforming growth factor α (TGFa) protège contre les lésions de la muqueuse gastrique et facilite la cicatrisation des plaies. Cependant, sa surexpression est connue pour induire une gastropathie hypertrophique ressemblant à la maladie de Ménétrier dans transgéniques (TG) chez la souris FVB sur un fond, en tant que l'un des auteurs précédemment rapportés. Nous avons étudié une autre lignée de souris TGFa exprimant sur un fond CD1, dont la muqueuse gastrique semble normal. Depuis cette souris TG avait une forte résistance aux lésions gastriques induites par l'éthanol, on considère que l'effet à long terme de TGFa sur plusieurs mécanismes de protection gastrique.
Méthodes
TGFa exprimant transgéniques (TG) des lignées de souris portant TGFa humaine ADNc Résultats sous le contrôle de la métallothionéine de souris gène I promoteur ont été générés sur un fond de la souris CD1, et analysé leurs phénotypes blessures résistant à l'éthanol produit par TGFa.
Dans la muqueuse TG, le flux sanguin a été bien entretenu après une blessure à l'éthanol . En outre, les types de neurones et inductibles de NO synthases ont été constamment et largement exprimé dans la muqueuse TG, par rapport à la distribution limitée de neurones de type NO synthase dans la région de la fosse luminale de la muqueuse de type sauvage (WT). COX-2 et de ses NFkB facteur de transcription en amont sont constitutivement élevés dans la muqueuse TG même avant l'administration d'éthanol, alors qu'ils étaient induits dans la même région de la muqueuse WT seulement après une blessure à l'éthanol. Deux protéines anti-apoptotiques, HSP70 et Bcl-2, ont été surexprimés dans la muqueuse TG avant même l'administration d'éthanol, alors qu'ils ne sont pas exprimés dans la muqueuse WT avant la blessure. En outre, la pro-caspase 3 activation est inhibée dans la muqueuse TG, alors qu'il a été converti en la forme active dans la muqueuse WT après l'administration de l'éthanol.
Conclusion
Nous concluons que TGFa maintient la muqueuse gastrique de défense contre les lésions gastriques par intégrer d'autres mécanismes cytoprotecteurs.
fond
Ethanol a longtemps été utilisé pour générer une hémorragie gastrique lésion de la muqueuse chez les rongeurs [1]. L'administration orale d'éthanol acidifié par l'acide chlorhydrique ou absolu, de nombreuses lésions hémorragiques peuvent être produites dans la muqueuse gastrique. Ce modèle de lésion gastrique expérimental a été fréquemment utilisé pour les études de protection de la muqueuse et de restitution gastriques. En effet, un certain nombre de composés cytoprotecteurs ont été testés pour évaluer leur efficacité dans la résistance lésions gastriques, y compris des hormones gastro-intestinaux, des facteurs de croissance, les prostaglandines, les amines bioactifs, et des irritants doux tels que la capsaïcine [2-5]. Parmi ces composés, le facteur de croissance épidermique (EGF) facteurs de croissance de la famille, transformant notamment α du facteur de croissance (TGFa), ont été rapportés comme étant des composés puissants cytoprotecteurs contre éthanol-, aux acides acétique, ou lésions gastriques induites par l'aspirine [2, 4].
TGFa a été exprimée dans la muqueuse gastrique du rat après administration par voie orale de taurocholate acidifiée ou de l'acide chlorhydrique, ce qui suggère son rôle réparatrices des lésions gastriques [6]. TGFa administré par voie intraperitoneale protégé contre les lésions gastriques induites par l'éthanol avec une augmentation significative de la mucine gastrique chez le rat adhérent [7]. La fonction cytoprotectrice d'TGFa semble être médiée par l'activation de la phospholipase C-γ1, mais pas par les Prostaglandines, et était indépendant de l'effet anti-sécrétoire de TGFa [7]. D'autre part, les Prostaglandines et leur enzyme synthétique, la cyclooxygénase (COX), ont longtemps été proposées en tant que facteurs cytoprotecteurs contre les lésions gastriques [5, 8]. EGF a été montré pour exprimer une isoforme inductible de la COX, COX-2, dans la lignée cellulaire de la muqueuse gastrique RGM1 de rat par une voie ERK kinase MAP [9], et fibloblasts Swiss 3T3, en particulier par co-stimulation avec de la gastrine [10]. En outre, la COX-2 expression par EGF facteur de croissance liant l'héparine, un membre des facteurs de croissance de la famille EGF, a été bloquée par un récepteur de l'EGF spécifique (EGF-R), un inhibiteur de la muqueuse gastrique du rat [11]. Ainsi, le signal EGF-R apparaît à la médiation de la COX-2 par induction dans la muqueuse gastrique.
Les mécanismes cytoprotecteurs les plus importants comprennent gastrique flux sanguin muqueux. EGF et le TGFa se sont avérés exercer des effets cytoprotecteurs par stimulation des neurones sensibles à la capsaïcine avec libération du peptide calcitonine gene-related (CGRP) et l'oxyde nitrique (NO) dans des rats exposés à l'administration d'éthanol orogastric, ce qui entraîne une augmentation dans le sang de la muqueuse gastrique débit [11, 12]. En revanche, Konturek et al. minimisé le rôle de l'augmentation de CGRP dépendante du flux sanguin gastrique en démontrant que l'administration de la libération de NO aspirine offre une protection contre les lésions gastriques induites par l'éthanol absolu, même chez les rats à la capsaïcine dénervé, ce qui entraîne la régulation positive de la protéine de choc thermique 70 (HSP70 ) l'expression et de l'atténuation de la lésion oxydative par une forte surexpression de gènes antioxydants tels que le cuivre de zinc superoxyde dismutase (SOD) et la glutathion peroxydase [13].
TGFa a été immunocolorée majoritairement dans les cellules GSM le long de la fosse gastrique chez l'homme [14], de manière intensive dans la muqueuse gastrique de surface (GSM) des cellules sur la zone proliférative et faiblement le long de la région glandulaire sous la zone prolifératif chez le rat [15] et sensiblement le long de la région de la muqueuse des cellules du col chez la souris de souche FVB /N [16]. D'autre part, l'EGF-R a été immunocolorée dans les cellules GSM tapisse la fosse fovéolaire et la région muqueuse des cellules du col de la région glandulaire inférieure chez l'homme [17]. Chez les rats, l'EGF-R a été localisé dans la région de haut fosse et dans les amas de cellules en chef au fond des glandes gastriques [15]. Bien que TGFa est connu pour induire la prolifération des cellules primaires de rat en culture des cellules de la muqueuse gastrique [18] et la prolifération hyperplasique de la muqueuse de la transgénique TGFa exprimant (TG) de la souris [19, 20], la répartition des TGFa et EGF-R dans les cellules de la muqueuse gastrique différenciées suggère que TGFa exerce des fonctions non-prolifératives y compris les effets anti-apoptotiques et formation de la barrière épithéliale gastrique dans /de manière paracrine autocrine. Par exemple, le TGFa a inhibé l'apoptose d'une lignée de cellules de la muqueuse gastrique de souris, GSM06, en exprimant Bcl-2 protéines de la famille anti-apoptotiques par une voie NF-kB-dépendante [21]. Apical et basolatéral gastrique EGF-R a été montré induire une diminution de la perméabilité paracellulaire à l'acide pour la protection des cellules ganglionnaires dans un environnement acide [18, 22]. Ainsi, TGFa exerce deux effets prolifératifs et non-prolifératifs sur les fonctions de la muqueuse gastrique, et ces effets TGFa divers devrait être réévalué, au moins en termes de savoir si leurs résultats sont issus d'un traitement à court terme en utilisant des lignées de cellules de culture ou de longue terme expression utilisant TGFa-transgène exprimant les animaux.
Il y a dix ans, l'un des auteurs, H. Takagi, généré TGFa exprimant des lignées de souris TG sous le contrôle du promoteur du gène de la métallothionéine, et une de ces lignes (MT100) gastropathie hypertrophique Exposée ressemblant à la maladie de Ménétrier, comme le montre de façon similaire par d'autres chercheurs [19, 20]. En revanche, une autre ligne TG (de MT42) affiche une muqueuse gastrique normale apparaissant, bien que TGFa transgène a été exprimé dans une mesure similaire dans les deux lignes TG [20]. Depuis la ligne de MT42 affiche un niveau surprenant de résistance aux blessures induite par l'éthanol à la muqueuse gastrique, nous avons considéré que cela pourrait être utile pour explorer les effets non-prolifératives de TGFa tels que la résistance des muqueuses à des blessures de l'éthanol. Dans la présente étude, nous avons étudié les effets à long terme de TGFa sur les lésions gastriques induites par l'éthanol par l'analyse des changements dans les facteurs réglementaires cytoprotecteurs et anti-apoptotiques, y compris l'écoulement gastrique de sang, NO synthase, COX-2, et les protéines de l'apoptose associée telles comme HSP70, Bcl-2, et de la caspase 3.
Méthodes
TGFa exprimant la souris transgénique et lésions gastriques induites par l'éthanol
TGFa exprimant transgéniques (TG) des lignées de souris portant TGFa humaine ADNc sous le contrôle de la souris gène de la métallothionéine I promoteur a été généré sur un CD1 ou d'arrière-plan de la souris FVB, comme décrit précédemment [20]. L'une des lignes TG, MT100 sur un fond de la souris FVB, affichée gastropathie hypertrophique ressemblant à la maladie de Ménétrier [20], tandis que l'autre ligne, MT42 sur un fond de la souris CD1, affiche une muqueuse gastrique normale apparaissant. Le phénotype de la souris TGFa-TG semblait dépendre de la souche de souris, parce que le MT100 et MT42 lignes ont exprimé un niveau similaire du transgène TGFa dans l'estomac [20]. Dans la présente étude, nous avons utilisé la ligne de MT42 de TGFa exprimant des souris mâles TG et CD1 de type sauvage (WT) de souris mâles à l'âge de 6 à 8 semaines. Les animaux ont été maintenus sous une lumière contrôlée (7h00-19h00) avec de la nourriture et de l'eau fournie ad libitum
.
Les souris, pesant 30-35 g, ont été mis à jeun pendant 24 heures avant l'expérience, mais ont eu libre accès à l'eau. Toutes les procédures expérimentales affectant les souris ont été approuvés par le soin des animaux et l'utilisation Comité d'examen à l'Université de Gunma. Les souris ont ensuite reçu de l'éthanol acidifié orogastric (100 ul, 60% d'éthanol dans 0,15 mol /L HCl). Trois, six et douze heures après l'administration d'éthanol acidifié les souris ont été sacrifiées pour l'évaluation des analyses de blessures et d'immunohistochimie gastriques, et pour l'ARN et l'extraction de protéines pour PCR en temps réel, Northern et Western blot analyses.
Études physiologiques
sécrétion d'acide gastrique a été mesurée comme décrit précédemment [20, 23]. En bref, des souris WT et TG ont été mis à jeun pendant 3 h, puis on a anesthésié à l'éther. Après l'incision de la paroi abdominale, la pyrolus a été ligaturé, et l'incision a été suturée. Le liquide gastrique a été recueilli 4 h après la ligature de pyrolus. Pour la production d'acide maximal, la sécrétion d'acide est stimulée par l'injection de pentagastrine sous-cutanée (500 mg /kg de poids corporel). Le fluide gastrique a été titrée avec du NaOH 0,1 N à pH 7,0 à l'aide d'un microtitrator. Le plus Gastric le flux sanguin de la muqueuse a été mesuré avec un débitmètre doppler à laser (modèle SFA211, Advance Co., Tokyo) en plaçant une sonde sur la surface de l'estomac les muqueuses, comme décrit précédemment [24]. Le signal de débit est surveillé par le programme d'enregistrement MacLab. Le débit sanguin a été exprimé par rapport au niveau de base. Des études morphologiques

l'épaisseur de la muqueuse gastrique a été mesurée à partir de la partie la plus élevée au fond de la glande avec un micromètre. De même, les lésions gastriques blessures ont été mesurées (largeur et longitude) avec un micromètre pour calculer la zone blessée.
Pour immunocoloration, nous avons obtenu des anticorps comme suit. anticorps polyclonaux à H + /K + - ATPase a été obtenue en injectant des fractions de cellules-microsomes de lapin pariétales dans des souris [25]. Lapin anticorps polyclonaux à métallothionéine était un gentil cadeau du Dr Nagamine, University School Gunma des sciences de la santé [26]. Nous avons acheté des anticorps de la manière suivante: un anticorps polyclonal de lapin à TGFa, un anticorps polyclonal de lapin à EGF-R, de chèvre polyclonale d'anticorps à la COX-2, anticorps polyclonal de lapin à NFkB et l'anticorps monoclonal de souris pour la nNOS et iNOS de Santa Cruz Biotech. (Santa Cruz, CA); anticorps monoclonal de souris à proliférative des cellules de l'antigène nucléaire (PCNA) de Zymed Lab. (South San Francisco, CA); anticorps de mouton à pepsinogène II humaine à partir BIOPUR AB (Bubendorf, Suisse), qui réagit également pepsinogène de souris; anticorps polyclonal de lapin à HSP70 de Stressgen Biotech. (Victoria, BC, Canada); et l'anticorps monoclonal de souris pour Bcl-2 à partir de BD Biosciences (San Diego, CA).
Pour la peroxydase de raifort (HRP) -catalyzing coloration immunohistochimique, les estomacs émincés ont été fixés dans neutralisé formol à 10% à 4 ° C pendant 24 h, et a ensuite été inclus dans la paraffine pour la coupe microtome. Les coupes de tissus déparaffinées ont été réhydratées et incubées dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 3% pour inhiber l'activité de peroxydase endogène. Ensuite, les coupes ont été mises à incuber avec un premier anticorps décrit ci-dessus avec une dilution appropriée à la température ambiante pendant 30 min. Un anticorps secondaire biotinylé a été sélectionné sur la base de la première espèce animale produisant un anticorps, et a ensuite été utilisé avec de la streptavidine conjuguée à HRP. La réaction HRP a été réalisée avec 3-amino-9-éthyl-carbazole et de peroxyde d'hydrogène selon les instructions fournies avec la coloration streptavidine-biotine Kit Elite Vectastatin (vecteurs Laboratories, Burlingame, CA). colorations positives sont apparues de couleur brune.
Pour immunofluorescence, les estomacs émincés ont été fixées dans 4% de paraformaldehyde dans 0,1 M de tampon phosphate, pH 7,4 à 4 ° C pendant 24 h. De petits morceaux de tissu haché ont subi le remplacement du saccharose et ont été incorporées dans de l'OCT composé en vue d'une coupe congelée à l'aide d'un microtome. Pour l'immunoréaction primaire, les sections coupées en tranches ont été sondées avec un premier anticorps, et ont ensuite été mises à incuber soit avec indodicarbocyanide (Cy3) purifié par affinité conjugué à dos d'âne anti-lapin, anti-IgG de souris (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), ou la fluorescéine isothiocyanate (FITC) marqué à IgG anti-lapin (Jackson Immuno Research), comme anticorps secondaire. L'anticorps IgG secondaire a été choisi en fonction de l'espèce à laquelle le premier anticorps a été élevé.
Détection in situ de cellules apoptotiques a été réalisée en utilisant le kit de détection Dans Apoptose Situ (TAKARA BIO INC. Tokyo, Japon). Le kit contient un désoxynucléotidyltransférase médiée triphosphate biotine désoxyuridine nick marquage d'extrémité (TUNEL) système de dosage terminal. sections de l'estomac ont été perméabilisées avec de la protéinase K, et l'extrémité 3 'OH extrémités des fragments d'ADN ont ensuite été colorées en suivant les instructions fournies avec le kit. Les noyaux colorés brun foncé ont été considérés comme des cellules apoptotiques.
Analyse de l'ARN
estomacs ont été rognée et les ARN totaux ont été extraits à l'aide Trizol (Gibco BRL, Tokyo) selon le protocole fourni par le fabricant. Pour transfert de Northern, l'ARN total a été soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose à 1,0% et a été transféré sur une membrane en nylon (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo). L'hybridation a été réalisée avec une sonde de l'humain TGFa ADNc (917 pb) marqué avec [α- 32P] désoxy-CTP. Cette sonde reconnaît TGFa ARNm humain, mais ne souris niveau TGF ARNm.
Souris TGFa ARNm a été mesurée en utilisant une réaction en temps réel en chaîne par polymérase (PCR) avec glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) comme témoin interne. La PCR en temps réel a été effectuée en utilisant le détecteur de séquence 7700 ABI Prism et mous (Applied Biosystems, Foster City, CA) en utilisant l'ADN colorant fluorescent SYBR vert détection. Les amorces ont été conçues en utilisant le logiciel de conception Primer Express (Applied Biosystems). Le résultat final pour chaque échantillon a été normalisée par la valeur respective de GAPDH. Les séquences des amorces sont les suivantes: souris TGFa: 5'-CCTGAGCACCCGAAGAT-3 'et 5'-CCTTCCCTCATGCCTTACT-3'; GAPDH: 5'-GTCGTGGATCTGACGTGCC-3 'et 5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'
analyse par transfert de Western
échantillons de tissus gastriques ont été taillés et des protéines totales de la muqueuse gastrique a été homogénéisés dans un tampon RIPA contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéase. (fluorure de phénylméthylsulfonyle, pepstatine, leupeptine et aprotinine) (Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne). Le surnageant a été séparé sur un gel SDS-PAGE et a été ensuite transféré sur une membrane de difluorure de polyvinylidène. La membrane a été sondée avec des anticorps suivants: anticorps anti-iNOS, de la COX-1, COX-2, HSP70, et Bcl-2, qui étaient les mêmes que celles utilisées pour les études morphologiques; anticorps monoclonal de souris à Bax (Santa Cruz Biotech.); anticorps polyclonal de lapin à caspase 3 (Santa Cruz Biotech.); et de l'anticorps monoclonal de souris à l'actine filaments (Santa Cruz Biotech.). des bandes d'anticorps ayant réagi ont été détectés en utilisant un système de détection ECL (Amersham, Buckinghamshire, UK). La mesure de la gastrine

sérum gastrine a été mesurée en utilisant un kit de dosage radio-immunologique de la gastrine (kit RIA gastrine, Dainabot, Tokyo, Japon). L'anticorps est spécifique de la gastrine avec une fraction amide à son extrémité carboxy-terminale.
Mesure de la prostaglandine E2
la muqueuse gastrique a été homogénéisé à 4 ° C dans du tampon de lyse. Les homogénats ont été centrifugés à 12000 rpm pendant 20 min, et les surnageants ont été soumis à la prostaglandine E 2 test utilisant une prostaglandine E 2 Kit Monoclonal immuno-enzymatique (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), selon les instructions du fabricant l'analyse statistique de.
l'analyse statistique a été effectuée par analyse de la mesure répétée de variance (ANOVA) pour la longueur totale des lésions gastriques par le test t non apparié pour la muqueuse gastrique du sang rapport de diminution de débit. Toutes les valeurs sont exprimées en moyenne ± erreur type. P < 0,05 a été acceptée comme statistiquement significative
. Résultats
Caractérisation de la muqueuse gastrique TG souris TGFa exprimant
La souche WT CD1 et TGFa-transgène exprimant souris de la lignée de MT42 ont augmenté de manière similaire et n'a montré aucune différence notable dans leurs fonctions, comportements, ou la durée de vie. La plus grande épaisseur observée pour la paroi gastrique et des glandes fundiques était de 3,50 ± 0,18 mm et 2,33 mm ± 0,20, respectivement, dans les souris WT, et de 3,85 ± 0,24 mm et 2,63 mm ± 0,16, respectivement, chez les souris TG; il n'y avait pas de différences significatives dans la forme des muqueuses et des glandes gastriques entre les souris WT et TG. En plus de l'aspect normal de la muqueuse gastrique, cette lignée de souris TG avait aussi un foie d'apparence normale, le pancréas et d'autres organes.
Nous avons ensuite comparé la capacité de sécrétion d'acide entre les souris WT et TG. Chez les souris WT, le débit d'acide maximal augmenté de manière significative par rapport au niveau de base de 25 ± 1,4 mEq /h à 50 ± 5,8 mEq /h après la stimulation de la pentagastrine. En revanche, chez les souris TG, la production d'acide maximal augmenté dans une moindre mesure à 30 ± 5,7 mEq /h à partir de la sortie de base de 23 ± 0,7 mEq /h (n = 5 dans des souris WT et TG). La production d'acide émoussé peut refléter la masse des cellules pariétales réduite dans la muqueuse TG (figure 1E). Figure 1: Caractérisation de la muqueuse TG TGFa exprimant. Échelle de chaque chiffre indique 100 um. (A) Répartition des cellules TGFa exprimant. cellules Brown couleur TGFa-positifs étaient visibles le long de la région de la fosse luminale de la muqueuse WT, la région allongée de la fosse fovéolaire, et le tiers inférieur de la région glandulaire dans la muqueuse TG. (B) Overlap des cellules TGFa-positives de couleur rouge et les cellules pariétales H + /K + ATPase-positifs de couleur verte. cellules TGFa-positives inférieures en grappe sont distincts des cellules pariétales de couleur verte dans la muqueuse TG. (C) transfert de Northern de l'ARNm et TGFa humain amplifié par PCR de l'ARNm de souris TGFa. Human TGFa ARNm est exprimé dans la muqueuse TG seul (panneau de gauche), mais amplifié par PCR souris TGFa ARNm est exprimé de façon similaire dans les deux WT et TG mucosae (panneau de droite). (D) de Western blot des formes intermédiaires TGFa. TGFa précurseur (20 kDa) et ses formes intermédiaires sont visualisées de manière plus intensive dans la muqueuse TG que dans la muqueuse WT. (E) la localisation du récepteur de l'EGF dans la muqueuse gastrique. récepteur de l'EGF (EGF-R) a été colorée avec Cy3 (rouge) et H + /K + ATPase a été coloré avec FITC (vert). EGF-R a été immunocolorée modérément dans la région de la fosse supérieure et fortement dans la région glandulaire inférieure similaire dans les deux WT et TG mucosae. (F) Répartition de la métallothionéine dans la muqueuse gastrique. Métallothionéine est immunocolorée fortement dans la région glandulaire inférieur, et modérément le long de la région fovéolaire. (G) Allongement de la fosse gastrique de la muqueuse TG. cellules PCNA-positifs sont distribués dans la région supérieure du tiers dans les glandes gastriques WT, alors qu'ils sont distribués plus nombreuse et largement dans la région glandulaire moyenne. Expression de (h) coloration PAS montre fosse allongée dans la muqueuse TG. de TGFa transgène
TGFa exprimant types de cellules ont été identifiés sur la base cellulaire de type spécifique immunocoloration et leur localisation muqueuse. TGFa aurait été immunocolorée le long des cellules GSM dans la fosse gastrique chez l'homme [14] et des rats [15], et le long de la région de cellules du col de mucus dans les souris de souche FVB [16]. Dans la présente étude, les cellules de couleur brune TGFa-positifs ont été distribués le long de la région fovéolaire à la fois du WT et TG mucosae, et le long de la région glandulaire inférieure de la TG muqueuse (figure 1a). Les cellules TGFa-positives le long de la région fovéolaire semblent être des cellules de la fosse gastrique, en fonction de leur localisation (figure 1b, panneau supérieur) et celles le long de la région glandulaire inférieure de la muqueuse TG ne se chevauchent pas avec la couleur verte H + /K + - cellules pariétales ATPase-positifs (figure 1b, panneau inférieur), mais ne se chevauchent avec les cellules principales pepsinogène-positive (données non présentées). L'anticorps, nous avons utilisé pour l'immunocoloration pour TGFa ne pouvait pas distinguer entre l'homme et la souris TGFa, mais sa sonde d'ARNm pouvait le faire pour l'analyse Northern blot. Le TGFa-transgène humain a été exprimé dans la muqueuse TG alors qu'aucune expression a été noté dans la muqueuse WT (figure 1c, panneau de gauche). En revanche, la souris endogène TGFa ARNm a été similaire exprimé à la fois le WT et TG mucosae par PCR en temps réel (Figure 1c, panneau de droite). TGFa est un peptide de 50 acides aminés, dérivée à partir de son précurseur transmembranaire de 160 acides aminés clivée par le facteur onconécrosant-α-enzyme de conversion de (TACE) [27, 28]. Avec l'expression de l'excédent du TGFa-transgène humain dans la muqueuse TG, un précurseur d'environ 20 kDa TGFa et ses formes intermédiaires ont été augmentés par immunoblot (figure 1d).
Depuis le précurseur ainsi que les formes traitées étaient également actifs pour stimuler l'EGF -R [28], nous avons examiné plus EGF-R localisation dans la muqueuse. EGF-R a été localisé lourdement dans la région inférieure chef de la grappe de cellules et modérément dans la région des cellules du cou muqueuse et dans la région de la fosse fovéolaire tant dans le WT et TG mucosae (figure 1E), comme cela a été rapporté précédemment pour la muqueuse gastrique chez le rat [15 ]. Étant donné que le transgène TGFa a été contrôlée dans le cadre du gène de la métallothionéine de souris [20] et la métallothionéine a été censément produit dans la muqueuse gastrique [29], nous avons examiné les types de cellules exprimant de la métallothionéine dans la muqueuse. Immunohistochimique, nous avons noté la métallothionéine coloration principalement le long de la région glandulaire inférieure et scatteringly le long de la région de la fosse de la commande CD1-souche muqueuse gastrique (Figure 1f). Ainsi, la répartition des TGFa exprimant types de cellules est similaire à celle des cellules exprimant la métallothionéine dans la muqueuse gastrique TG (figures 1a et 1f). Emploi de la muqueuse de la souris WT, H + /K + - cellules pariétales ATPase-positifs ont été largement répartis sur la région glandulaire sauf pour la couche supérieure à ciel, alors que le H + /K + - ATPase positif région glandulaire a été réduit en hauteur dans le TG muqueuse (Figure 1e). En effet, l'isthme à la base de la région de la fosse, qui a été confirmée par coloration PCNA, a été déplacé vers le bas au milieu de la muqueuse TG (Figure 1g). En outre, les cellules PCNA positives ont été distribués en couche épaisse au milieu de la muqueuse. Constamment, la fosse fovéolaire PAS-coloration positive a été allongée dans la muqueuse TG contrairement à la fosse courte dans la muqueuse WT (figure 1h). Ainsi, bien que la hauteur de la muqueuse gastrique était similaire entre le WT et TG mucosae, la zone proliférative a été déplacé vers le bas et la région de la fosse fovéolaire était plus allongée avec une région glandulaire réduite dans le mocosa TG. Étant donné que la croissance des cellules du puits est fortement améliorée par la gastrine [25, 30], nous avons comparé les taux de gastrine sérique entre les souris WT et TG mais n'a trouvé aucune augmentation des niveaux de gastrine sérique chez la souris TG (WT, 213 ± 41 pg /ml;. TG, 263 ± 47 pg /ml, n = 5, p = 0,438)
lésions gastriques induites par l'éthanol dans l'administration orogastric du TG souris WT et les muqueuses d'éthanol acidifié (100 ul) ont provoqué hémorragique lésion de la muqueuse TG (Figure 2a, à gauche). Histologiquement la blessure décollée les régions de puits et isthme et atteint la région mi-glandulaire (Figure 2b, à gauche). En revanche, ce type de blessure dans la muqueuse de la souris TG n'a pas été notable (Figure 2a, à droite). La blessure a été histologiquement limitée à la région de la fosse luminale (figure 2b, à droite). WT dans la muqueuse, la zone lésée a augmenté rapidement avec un pic à 6 heures après l'administration d'éthanol, tandis que dans la muqueuse TG la région a augmenté lentement au minimum sans pic marqué (figure 2c). Constamment, les cellules apoptotiques indiquées par la coloration TUNEL distribués profondément à la plus basse glandulaire région 3 h après l'administration de l'éthanol dans la muqueuse WT, alors que les cellules apoptotiques ont été confinés à la région de la fosse, mais ne sont pas étendues à la région glandulaire dans la muqueuse TG ( Figure 2d). Figure 2 Ethanol induite lésions gastriques dans la muqueuse gastrique. (A) vue macroscopique de la muqueuse gastrique. Echelle: 5 mm. Les deux muqueuses sont 6 h après l'administration de l'éthanol. A noter que le WT muqueuse affiche extensives lésions hémorragiques, en revanche, la muqueuse intacte TG air après l'administration d'éthanol. (B) hématoxyline et éosine d'éthanol blessé WT muqueuse (à gauche) et TG muqueuse (à droite). Notez la formation d'ulcères profonds dans la muqueuse WT. Echelle: 100 um. (C) du cours Heure de lésions gastriques induites par l'éthanol. Blessé zone est tracée en fonction du temps jusqu'à 12 h après l'administration de l'éthanol. Chaque point représente une moyenne de cinq souris. p
< 0,05 (d) coloration TUNEL de WT muqueuse (à gauche) et TG muqueuse (à droite). Les deux sections sont consécutives à celles de 2B
, respectivement. Les cellules apoptotiques sont visibles avec des noyaux brun foncé. De nombreuses cellules apoptotiques sont notées dans la muqueuse WT. Toutes les photos ont 6 h après l'administration d'éthanol. Echelle:. 100 um
gastrique flux sanguin muqueux dans la muqueuse de l'éthanol traité
Bien qu'un certain nombre de facteurs de régulation cytoprotecteurs ont été rapportés, y compris NON, le CGRP, la COX2 et HSP70 [12, 13, 31, 32] , le flux sanguin de la muqueuse a été proposée comme un facteur primordial pour la protection et la restitution des lésions gastriques induites par l'éthanol [1, 33]. Nous avons mesuré le flux sanguin gastrique en plaçant une sonde de débitmètre à laser Doppler sur la muqueuse gastrique accessible par une paroi abdominale exposée dans la souris anesthésiée. la circulation sanguine gastrique a diminué de 43,5 ± marqué 6,37% après l'administration de l'éthanol sur la muqueuse gastrique de la souris WT (Figure 3). En revanche, il n'a diminué que de 17,2 ± 9,21% après l'administration de l'éthanol sur la muqueuse TG (figure 3). Ainsi, le flux sanguin gastrique a été bien maintenue dans la muqueuse TG même après un traitement à l'éthanol. Depuis la muqueuse ischémie est l'un des facteurs les plus importants ulcérogènes [33], le maintien du flux sanguin gastrique ne semble pas être un facteur essentiel pour la protection de la muqueuse. Figure 3 Évaluation de l'estomac flux sanguin muqueux dans la muqueuse gastrique. Gastrique flux sanguin de la muqueuse a été évaluée en comparant le rapport d'écoulement du sang avant et après le traitement à l'éthanol. Le ratio a été obtenu sous forme d'un pour cent par rapport au flux de sang avant le traitement, ce qui est beaucoup plus grande dans la muqueuse WT que dans la muqueuse TG. * P
< Expression de 0,03 de protéines cytoprotectrices:. NO synthase, COX-2, et HSP70
Pour explorer le mécanisme de maintien de flux sanguin élevé dans la muqueuse TG, nous avons examiné l'expression de NO synthases, qui ne fait pas de l'arginine, et détend les muscles lisses vasculaires par cGMP protéine kinase dépendante [34]. Il existe trois types de NO synthase (NOS): neuronal NOS (nNOS), inductible NOS (iNOS) et NOS endothéliale (eNOS). nNOS et eNOS sont exprimés de manière constitutive, alors que la iNOS est induite lors d'une lésion gastrique [35]. nNOS a été distribué de manière similaire au PAS-coloration sur la région de la fosse fovéolaire (Figure 1g); il a été observé au cours de la fosse allongée de la muqueuse TG et a été limitée à la fosse luminale de la muqueuse WT (figure 4a). eNOS a été faiblement dispersée sur l'ensemble de la muqueuse gastrique est similaire à la fois le WT et TG mucosae (données non présentées). La coloration iNOS a été négligeable dans la muqueuse WT, même si elle est fortement induite dans la région glandulaire inférieure après la muqueuse a été exposée à l'éthanol (figure 4b). Dans la muqueuse TG, iNOS a été exprimé constitutivement dans la région glandulaire inférieure de la même avant et après la blessure (figure 4b), qui semble contribuer davantage au maintien du débit sanguin élevé. La figure 4 immunocoloration de NO synthases dans la muqueuse gastrique. Echelle: 100 um. immunocoloration (a) nNOS. nNOS était visible le long de la région de la fosse, ce qui entraîne sa distribution plus large le long de la fosse allongée dans la muqueuse TG. immunocoloration (b) iNOS. iNOS a été induite dans la région glandulaire inférieure après une blessure à l'éthanol dans la muqueuse WT, alors qu'elle a été exprimée de façon constitutive dans la même région de la muqueuse TG indépendamment de blessure de l'éthanol.
prostaglandines ont été proposés comme un facteur cytoprotecteur majeur il y a plus de trois décennies [ ,,,0],8] et leurs rôles ont été largement étudiées [36, 37]. Le rôle des enzymes de prostaglandine filmogène, COX-1 et COX-2, a été controversé dans la protection de la muqueuse gastrique contre les irritants [7, 11, 32]. Nous avons examiné l'expression de la COX dans le WT et TG mucosae lors de blessures de l'éthanol. L'expression de la COX-1 ne différait pas entre le WT et TG mucosae, ni avant ou après la blessure de l'éthanol (figure 5b). COX-2 n'a pas été détecté dans la muqueuse WT, mais son expression est devenue évidente 6 h après une lésion de l'éthanol et sa coloration a été localisée à la région glandulaire inférieure (figure 5a et 5b). Dans la muqueuse TG, la COX-2 immunocoloration était intense à la même région avant même la blessure et est restée positive après la blessure (figure 5a). Comme il a été démontré COX être exprimée dans des cellules mésenchymateuses telles que les fibroblastes et les cellules mononucléaires dans la muqueuse gastrique [38], et le procédé streptavidine /biotine /HPR présente parfois une coloration de faux positifs, nous avons effectué une coloration immunofluorescente à l'aide d'une section congelée qui a confirmé l'expression de la COX similaire dans la région inférieure glandulaire de la muqueuse TG (données non présentées). Par immunoblotting, la COX-2 a augmenté après la blessure de la muqueuse WT, alors qu'il a été très élevée dans une mesure similaire avant et après la blessure (figure 5b).

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