La régulation négative de facteur de croissance tissulaire inhibant la croissance et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques et atténue la dissémination peritoneale

La régulation négative de facteur de croissance tissulaire inhibant la croissance et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques et atténue la dissémination peritoneale
facteur de croissance du tissu conjonctif de résumé de l'arrière-plan (CTGF) a été montré être impliqué dans le développement et la progression tumorale. Cependant, le rôle du CTGF dans le cancer gastrique reste largement inconnu.
Résultats
Dans cette étude, nous avons montré que le CTGF a été fortement exprimée dans les tissus de cancer gastrique par rapport aux tissus gastriques normaux appariés. L'expression de CTGF dans le tissu tumoral a été associé avec le grade histologique, métastase ganglionnaire et la diffusion péritonéale (P < 0,05). Les patients avec une expression de CTGF positifs avaient postopératoires cumulatif taux de survie à 5 ans significativement inférieurs à ceux avec l'expression négative de CTGF (22,9% versus 48,1%, P < 0,001). Nous avons démontré que knockdown de l'expression CTGF croissance cellulaire a inhibé significativement des cellules de cancer gastrique et une diminution de la cycline D 1 expression. Par ailleurs, knock-down de l'expression de CTGF a également nettement réduit la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques et une diminution de l'expression de la métalloprotéinase matricielle (MMP) -2 et MMP-9. Les études animales ont révélé que les souris nude injecté avec le CTGF knockdown lignées cellulaires stables en vedette un plus petit nombre de nodules de semis péritonéale que les lignées de cellules de contrôle. de Conclusions
Ces données suggèrent que le CTGF joue un rôle important dans la croissance cellulaire et l'invasion dans cancer de l'estomac humain et il semble être un marqueur pronostique potentiel pour les patients atteints de cancer gastrique.
Mots-clés
Connective croissance tissulaire néoplasmes facteur d'estomac prolifération cellulaire invasives péritonéale diffusion Présentation
en dépit des progrès importants dans la recherche sur le cancer, le cancer reste un problème de santé dans le monde entier et de la mortalité due au cancer reste élevé [1]. Le cancer gastrique est la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde alors qu'il semble y avoir une tendance à la baisse dans la survenue, notamment dans les pays occidentaux; il est encore fréquemment rapportés en Chine et au Japon [2, 3]. Même si le pronostic des patients atteints de cancer gastrique avancé semble s'être améliorée à la suite de la normalisation des techniques chirurgicales et les progrès récents dans la chimiothérapie, le taux de survie post-opératoire de 5 ans reste faible [4, 5]. métastase péritonéale est la cause la plus fréquente et significative de la mortalité après chirurgie du cancer gastrique [6, 7]. Cependant, les mécanismes de métastase peritoneale ne sont pas clairement définies du facteur de croissance du tissu conjonctif de. (CTGF), également connu sous le nom CCN2, est un membre de la famille CCN, y compris protéine riche en cystéine 61 (Cyr61), également connu sous le nom CCN1 et nephroblastoma-over gène exprimé (novembre), également connu sous le CCN3, ainsi que Wisp-1 /elm1 (CCN4), Wisp-2 /rcop1 (CCN5) et Wisp-3 (CCN6) [8, 9]. Le CTGF est considéré comme un modulateur de la signalisation multifonctionnelle impliquée dans une grande variété de processus biologiques ou pathologiques, tels que l'angiogenèse, l'ostéogenèse, de la fibrose dans les reins et de la peau, et le développement de la tumeur [10 à 12]. Bien que le rôle de CCN2 dans la fibrose des tissus normaux a été bien étudiée [13], la fonction de CCN2 dans le cancer ne sont pas aussi bien compris. Il est intéressant de CCN2 a été identifié comme un oncogène dans une variété de types de cancers, mais est considéré comme un gène suppresseur de tumeur dans d'autres formes de cancer [14]. La surexpression du CTGF est trouvé dans le cancer de la prostate [15], les gliomes [16], le cancer du sein [17] et la leucémie lymphoblastique aiguë adulte [18]. augmentation de l'expression du CTGF a été associée à la progression des tumeurs du col [19], et de l'oesophage carcinome spinocellulaire [20]. A l'inverse, dans les adénocarcinomes pulmonaires [21] et les cancers du côlon [22], la surexpression du CTGF inhibe l'invasion et les métastases des cellules cancéreuses in vitro et in vivo.
Des études cliniques ont montré que la surexpression du CTGF était significativement corrélée avec les ganglions lymphatiques métastases et de mauvais pronostic chez les patients atteints de cancer gastrique [23, 24]. Toutefois, le rôle précis de CTGF dans le cancer gastrique est encore inconnue. Dans cette étude, nous avons détecté l'expression de CTGF dans les tissus du cancer de l'estomac. Nous avons constaté que le CTGF était surexprimé dans le cancer de l'estomac, et son expression est associée à un comportement agressif du cancer gastrique. Nous avons ensuite utilisé la technologie siRNA à knockdown expression de CTGF endogène dans les cellules de cancer gastrique. Nous avons démontré que la régulation négative de CTGF a inhibé la croissance et l'invasion du cancer gastrique in vitro et atténué la diffusion péritonéale in vivo. Notre étude met en évidence fortement l'importance de CTGF dans la croissance et l'invasion d'un cancer gastrique, et peut constituer une cible thérapeutique dans le cancer gastrique. Matériaux et méthodes
Diméthyl le sulfoxyde (DMSO) et de la trypsine de réactifs ont été achetés auprès Sigma (St. Louis, MO, USA). DMEM, la streptomycine et d'autres fournitures de culture cellulaire étaient de GIBCOBRL (Grand Island, NY, USA). sérum fœtal bovin était de Hyclone (Logan, UT, USA). MTT [3- (4, 5-diméthylthiazol-2-yl) -2, le bromure de 5-diphenyltrazolium] a été obtenu auprès de Fluka (Ronkonkoma, NY, USA). Le CTGF, la cycline D1, la métalloprotéinase matricielle (MMP) -2, MMP-3, MMP-9 et de l'anticorps primaire GAPDH, ainsi que d'un second anticorps rhodamine (TRITC) AffiniPure conjugué à de chèvre anti-IgG de souris ont été obtenus auprès de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). kit ELISA CTGF a été acheté chez R & D (Minneapolis, MN, USA). Trizol et Lipofectamine 2000 ont été achetés chez Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). kit SYBR @ Primescript ™ RT-PCR était de Takara biotechnologie, au Japon. Les échantillons de tissus
et la coloration immunohistochimique
échantillons de tumeur ont été obtenus à partir de 110 patients atteints de cancer gastrique ayant subi une chirurgie au département d'oncologie chirurgicale, d'abord affilié hôpital de l'université médicale de la Chine au cours de la période 2003-2005. Tous les patients ont gastrctomy, et leurs données cliniques et pathologiques étaient disponibles. tissus de l'estomac normaux ont été prélevés sur la marge distale réséquée identifié d'échantillons de cancer gastrique. Tous les spécimens chirurgicaux ont été examinés par des pathologistes expérimentés et la marge distale réséquée était sans tumeur. Les tissus frais ont été coupés en petits morceaux, à une congélation rapide dans de l'azote liquide immédiatement et stocké à -80 ° C jusqu'à l'extraction de la protéine. Le protocole d'étude a été examiné et approuvé par le Comité d'éthique de l'Université médicale de Chine.
Pour la coloration immunohistochimique, 4 um coupes histologiques ont été déparaffinées avec du xylène et réhydratées par une série graduée d'alcool. Les sections ont ensuite été bouillis pendant 10 min dans un tampon 0,01 M de citrate et de peroxydase endogène a été bloquée par incubation dans 0,3% de H 2 O 2 dans du methanol pendant 30 minutes. La liaison non spécifique a été bloquée par l'incubation des lames avec du sérum de chèvre normal pendant 30 minutes à température ambiante. Les coupes ont été mises en incubation pendant une nuit à 4 ° C avec une dilution 1:50 d'anticorps primaire CTGF. Les sections ont été exposées à l'anticorps secondaire marqué à la biotine pendant 1 h, à un système de réaction streptavidine-peroxydase, puis développées avec DAB- H 2 O 2. La coloration a été marqué sur l'échelle suivante: 0, aucune coloration; 1+, une coloration minimale; 2+, coloration modérée à forte dans au moins 20% des cellules; 3 +, une forte coloration d'au moins 50% des cellules. Cas avec 0 ou 1+ coloration ont été classés comme négatifs, et les cas avec 2+ ou 3+ coloration ont été classés comme positif. Human gastriques cancer lignées cellulaires
Culture cellulaire, MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 et MGC803 ont été obtenus auprès du Département de biologie cellulaire, Université médicale de Chine, la Chine. Elles ont été cultivées dans DMEM contenant 10% de sérum bovin fœtal, 100 U /ml de pénicilline, 100 ug /ml de streptomycine à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2. Construction de Les cellules ont été délogées en utilisant 0,25% de trypsine et 0,02 mol /L EDTA dans du PBS pour la sous-culture. Du CTGF knockdown Deux petits ARN interférents (siARN) oligonucléotides
lignées cellulaires stables ont été synthétisés pour cibler deux régions différentes dans le CTGF ADNc: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC1) et GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). Ils ont été clonées dans le vecteur d'expression de siRNA pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP. L'ARNsi non spécifique a été utilisé comme témoin négatif (PSNC). Les plasmides d'expression d'ARNsi ont été transfectés dans des cellules en utilisant la Lipofectamine SGC7901 2000. Les cellules ont été criblées avec G418 (800 pg /ml) et les colonies ont été prélevées au bout de 3 semaines, déterminée par RT-QPCR et Western Blot. Les cellules transfectées avec PSC1, PSC2 ou PSNC ont été désignées cellules de PSC1, PSC2 des cellules ou des cellules PSNC, respectivement.
Quantitative en temps réel Polymerase Chain Reaction (RT-QPCR)
ARN total a été isolé à partir des culots cellulaires en utilisant le réactif Trizol. L'ARN total (1 ug) a été converti en ADNc en utilisant une RT (transcriptase inverse) Kit de réaction. PCR en temps réel a été réalisée en utilisant Mx3000P système PCR en temps réel selon les instructions du fabricant et SYBR ® Premix ExTaq comme colorant fluorescent spécifique de l'ADN. La PCR a été réalisée pendant 40 cycles de 95 ° C pendant 5 s et 60 ° C pendant 40 s. Les séquences des amorces sont présentées dans le tableau 1. Le cycle seuil (Ct) a été obtenue et des quantités relatives ont été déterminées pour chaque échantillon normalisé à la GAPDH. Les expressions d'ARNm ont été calculées en utilisant la méthode ΔΔCt [25] .Tableau 1 PCR Primer Sequences
Gene
Séquences d'amorces (5'-3 ') avant et arrière
produit (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
L'analyse par transfert western
tissus ou cellules ont été lysées dans du tampon RIPA additionné avec un mélange d'inhibiteurs de protéase pendant 30 min à 4 ° C. Les lysats cellulaires ont ensuite été traités aux ultrasons brièvement centrifugés (14 000 g à 4 ° C) pendant 15 minutes pour éliminer les matières insolubles. Des quantités égales de protéines ont été séparées par SDS-PAGE et transférés sur une membrane de PVDF. Les membranes ont été bloquées avec du lait sec non gras à 5% et ensuite incubées avec le premier anticorps, suivi par un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort. Immunofluorescence et confocale l'imagerie de bandes de protéines ont été visualisées par la méthode de chimioluminescence ECL.
Les cellules sur Lab-Tek diapositives de la chambre de culture de tissus ont été fixés dans le froid méthanol à 100% pendant 10 min, puis bloqué avec du sérum de chèvre normal pendant 30 min . Les cellules ont été incubées avec l'anticorps primaire pendant une nuit à 4 ° C, on l'a lavé 3 fois dans du PBT (PBS avec 1 ‰ de Triton X-100), puis mis en incubation avec un second anticorps conjugué à de la rhodamine. Le DAPI ADN colorant a été utilisé pour colorer l'ADN. Les cellules ont été imagées sur un Leica SP2AOBS microscope confocal.
Milieu conditionné (CM) de collecte et immuno-enzymatique (ELISA)
3 × 10 5 cellules ont été ensemencées à 100 mm boîte de culture tissulaire avec du DMEM contenant 10 % de sérum de fœtus bovin pendant 2 jours. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et mises en incubation avec 5 ml de DMEM sans sérum. 48 h plus tard, le milieu conditionné a été recueilli et centrifugé à 2000 g pendant 5 min, passé à travers les filtres (taille de pores 0,45 um) et stockés à -80 ° C jusqu'à utilisation.
Les niveaux de CTGF dans le milieu conditionné à partir de des lignées cellulaires de cancer de l'estomac ont été mesurés en utilisant le kit Quantikine ELISA humain suivant les instructions du fabricant. essai de prolifération
MTT
la capacité de la prolifération cellulaire a été évaluée à l'aide de MTT [3- (4, 5-diméthylthiazol-2-yl) -2 , le bromure de 5-diphenyltrazolium] dosage. Environ 5 × 10 3 cellules ont été ensemencées dans des plaques de culture 96 puits et cultivées dans du DMEM dépourvu de sérum pendant 24, 48, 72 et 96 h, respectivement. Ensuite, les cellules ont été mises en incubation avec 20 ul de MTT (bromure de 10 mg /ml) pendant 4 h à 37 ° C, et 200 ul de DMSO ont été introduits à la pipette pour solubiliser le produit formazan pendant 20 min à température ambiante. La densité optique (DO) a été déterminée en utilisant un spectrophotomètre (Bio-Rad) à une longueur d'onde de 570 nm.
Colonie de test de formation
5 × 10 2 cellules en suspension dans 2 ml de 0,3% d'agarose en milieu DMEM contenant 10% de sérum de fœtus bovin ont été étalées dans des plaques à 6 puits sur la partie supérieure de 0,6% d'agarose bas existant avec le même milieu. Les plaques ont été incubées à 37 ° C dans un 5% de CO 2 de l'incubateur. Au bout de trois semaines, des colonies de cellules > 0,1 mm de diamètre ont été comptées sous un champ microscopique. Test d'invasion
Cell
L'invasion a été déterminée par un dosage de la chambre d'invasion. Les cellules (2 x 10 4) ont été ensemencées sur la chambre supérieure d'un micropore filtre à membrane de Matrigel revêtue de 24 puits avec 8 um pores et la chambre inférieure a été remplie de 0,5 ml de DMEM avec 10% de sérum fœtal bovin en tant que chimiotactique. Après une incubation de 24 h, les cellules non-invasion (chambre supérieure) ont été éliminées en douceur à l'aide d'un coton-tige à pointe et envahir les cellules (chambre basse) ont été fixés en utilisant du méthanol et colorées avec du bleu trypan. La capacité invasive a été déterminée par le nombre de cellules qui pénètrent sous un microscope à 200 × grossissement pour 10 champs aléatoires dans chaque puits test de migration Chambre
.
La méthode de test in vitro de migration a été l'aide d'un non-matrigel revêtu 24 puits chambre de Boyden (8 pm, Millipore). Les cellules (2 x 10 4) ont été ensemencées sur des inserts en suspension dans 0,2 ml de milieu DMEM exempt de sérum. les cellules non migrantes ont été retirées de la chambre supérieure du filtre après incubation pendant 24 h. cellules migrées ont été colorées et quantifiées basées sur la procédure comme décrit précédemment. des essais ont été effectués en triple pour chaque groupe de cellules dans l'invasion et la migration des essais, et les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SD.
Gélatine zymographie
MMP-2 et MMP-9 activité a été déterminée par zymographie sur gélatine comme décrit précédemment [ ,,,0],26]. En bref, après centrifugation, le surnageant a été séparé et la concentration en protéine déterminée; des quantités égales de protéines, a été ajoutée par tampon échantillon (Tris-HCl 1 M, pH 6,8, du sulfate de sodium dodécylique (SDS) à 2%, du glycerol à 10%) ont été appliqués à 7,5% de gel de SDS-polyacrylamide contenant 1 mg /ml de gélatine. Après électrophorèse, le SDS a été éliminé du gel par lavage à deux reprises avec 2,5% de Triton X-100 pendant 1 h. Après un bref rinçage, le gel a été mis en incubation à 37 ° C pendant 18 h dans un tampon, pH 7,6, contenant 100 mM de Tris-HCl, 10 mM de CaCl 2, 20 mM de NaCl. Le gel a été coloré avec1% Bleu de Coomassie R250 pendant 2 h et ensuite traité avec une solution de décoloration (40% de methanol, d'acide acétique à 10%, 50% d'eau distillée). L'activité protéolytique a été détectée sous forme de bandes claires contre la tache du substrat non digérés dans le gel de fond.
étude animale de l'implantation péritonéale
Cette expérience a été réalisée en conformité avec les lignes directrices émises par l'État Food and Drug Administration (SFDA de Chine ). Les animaux ont été logés et soignés conformément aux lignes directrices établies par le Conseil national des sciences de la République de Chine Femme BALB /c nu souris de., 35-40 jours et pesant 20-22 g, ont été fournis par le laboratoire Shanghai Slac Company Limited animaux. Les souris ont été maintenues dans des conditions stériles et nourris avec un régime alimentaire de souris stérilisée et de l'eau. Les animaux ont été anesthésiés par inhalation d'isoflurance. PSC1, PSC2, et PSNC SGC7901 cellules (1 x 10 7 cellules) ont été mises en suspension dans 0,5 ml de DMEM et inoculé dans la cavité abdominale de souris d'essai. Les souris ont été sacrifiées six semaines plus tard, et tous les nodules disséminés présents sur le mésentère et le diaphragme ont été évalués.
Analyse statistique
Toutes les valeurs dans le texte et les chiffres sont présentés sous forme de moyenne ± écart-type. Les taux globaux de survie ont été déterminées en utilisant l'estimateur de Kaplan-Meier, un événement étant défini comme la mort pour la cause du cancer en corrélation. Le test du log-rank a été utilisé pour identifier les différences entre les courbes de survie des différents groupes de patients. En analyse univariée, 2-tailed χ 2 tests pour les variables catégorielles et test t 2-queue pour les variables continues ont été utilisées pour des comparaisons statistiques. Les valeurs de p <
Résultats de 0,05 ont été prises pour montrer une différence significative entre les moyens.
CTGF est surexprimé dans les cancers gastriques et corrélés avec les caractéristiques clinico-pathologiques du cancer gastrique patients
Nous avons déterminé l'expression de CTGF dans les tissus de cancer gastrique et les tissus normaux appariés distales . Figure 1A illustre l'expression de CTGF dans cinq patients choisis au hasard. Des niveaux élevés de la protéine CTGF ont été trouvées dans les tissus du cancer gastrique humain par rapport aux tissus normaux appariés des patients. Ceci a également été confirmée par une coloration immunohistochimique (figure 1B). Par ailleurs, afin d'étudier plus la corrélation entre l'expression de CTGF et les caractéristiques clinico, 110 échantillons ont été utilisés pour l'examen avec la coloration immunohistochimique. L'analyse statistique a révélé l'expression de CTGF positive a été associée de manière significative avec le grade histologique, métastase ganglionnaire et la diffusion péritonéale par rapport à ces patients avec une expression de CTGF négative (tableau 2). expression de CTGF positive a été plus fréquemment détectée dans les cas de ganglions lymphatiques métastases (P = 0,012). Les niveaux d'expression CTGF ont augmenté de manière significative dans les cancers gastriques indifférenciées par rapport aux cancers gastriques différenciés (P = 0,039). Et l'expression de la protéine CTGF était significativement corrélée avec le développement de la dissémination peritoneale du cancer gastrique (p = 0,011). Calcul de la durée de survie des 110 patients concernés par la méthode de Kaplan-Meier a révélé que les patients qui ont comporté des tumeurs CTGF positifs ont montré une survie plus courte en comparaison avec les patients qui ont souffert de tumeurs CTGF-négatives (figure 1C, P < 0,001 ). La figure 1 Surexpression du CTGF dans le cancer gastrique à un plus mauvais pronostic. A. Analyse par transfert de Western a démontré l'expression de CTGF dans les tissus du cancer gastrique et les tissus normaux appariés distale de cinq patients atteints d'un cancer de l'estomac choisis au hasard. résultats B. immunohistochimie d'expression CTGF dans des échantillons de tissus de cancer gastrique appariés. Les courbes de survie C. Kaplen-Meir pour 110 patients atteints de cancer gastrique, regroupés en fonction de l'expression de CTGF.
Tableau 2 Association entre l'expression de CTGF et les caractéristiques clinico-pathologiques des patients atteints de cancer gastrique (n = 110)

expression de CTGF


négatif

la valeur P positive
20
23
âge (années) Homme de
33
34
0,779
Femme sexes
≤ 65
35
40
0,642
> 65
18
17
Tumor taille (cm)
< 5
26
25
0,585
≥ 5
27
32
localisation de la tumeur
42
37
0,413 de
Lower Moyen
5 8
Upper 3
6
entier 3
6
Grade histologique
Differentiated
26
17
0,039 *
27
40
Lauren année
indifférencié
Intestinal
28
21
0,108
diffus
25
36
métastases ganglionnaires
négatif
23
12
0,012 *
30
45
stade TNM de positive
I
11
8
0,080
II
15
9
III
20
22
IV
7
18
métastases hépatiques
négatif
50
55
0,588
positif 3 2
diffusion péritonéale
négatif
50
44
0,011 *

positive 3
13
* P < 0,05; L'expression de CTGF, du tissu conjonctif facteur de croissance. du CTGF dans des lignées gastriques humaines de cellules cancéreuses et le silence ARNsi à médiation
Tout d'abord, nous avons examiné l'expression de CTGF dans six lignées cellulaires de cancer gastrique (MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 et MGC803) par Western blot. Le CTGF a été détectée dans toutes les lignées cellulaires évaluées, et SGC7901 des cellules exprimant le plus haut niveau (figure 2A). Par conséquent, SGC7901 cellules ont été sélectionnées en tant que modèle pour les études fonctionnelles ultérieures. Étant donné que le CTGF biologiquement actif est à la fois sécrétée et exprimée dans le cytoplasme [8, 27], nous avons également mesuré le niveau de sécrétion du CTGF dans le milieu conditionné de ces gastriques lignées de cellules cancéreuses par ELISA, qui a coïncidé avec le niveau de CTGF dans le cytoplasme de chaque lignée cellulaire (figure 2B). La Figure 2 Expression de CTGF dans des lignées cellulaires de cancer gastrique et par effet de choc du CTGF ARNsi. A. Western Blot montrant l'expression du CTGF dans 6 lignées cellulaires de cancer gastrique. GAPDH a servi de témoin protéine de chargement. B. CTGF dans des milieux conditionnés de 6 lignées cellulaires de cancer de l'estomac et des cellules transfectées de manière stable ont été analysées par ELISA. Les résultats sont exprimés en pg /ml /1 x 106cellules (moyenne ± écart type, n = 4). C. Analyse par transfert Western de CTGF expression des protéines dans SGC7901, et CTGF PSNC lignées cellulaires knock-down stable (PSC1 et PSC2). D. Analyse immunofluorescence d'expression CTGF. E. RT-QPCR montrant les niveaux d'ARNm dans CTGF SGC7901, PSNC et CTGF lignées cellulaires stables knockdown (PSC1 et PSC2). Les données sont exprimées en tant que facteur de variation par rapport au contrôle (contrôle est SGC7901). Les valeurs sont exprimées en tant que moyenne ± écart-type de trois expériences. * P < 0,05 par rapport au témoin.
Pour étudier la fonction de CTGF dans SGC7901 cellules, le CTGF knockdown lignées cellulaires stables ont été utilisées pour analyser l'effet de silence. Comme on le voit sur la figure 2B, le niveau de sécrétion du CTGF dans le milieu conditionné a été significativement réduite dans les cellules transfectées siARN stable par rapport au témoin. Western blot et immunofluorescence ont montré que l'expression de la protéine CTGF dans le cytoplasme a diminué de façon marquée dans les CTGF knockdown des lignées cellulaires stables (figure 2C, D). En outre, l'expression d'ARNm du CTGF était également significativement diminuée dans le CTGF des lignées cellulaires knock-down stable (figure 2E).
Knockdown de l'expression du CTGF inhibe la croissance des cellules cancéreuses gastriques
Le dosage de formation de colonies a été utilisé pour évaluer la croissance des cellules dans lesquelles CTGF a été réduit au silence. Comme on le voit sur la figure 3A, les cellules knock-down CTGF stables (PSC1 et PSC2) formée de manière significative moins de colonies sur agar mou par rapport aux cellules et SGC7901 PSNC (83 ± 10 90 ± 15 contre 30 ± 7 et 20 ± 5, respectivement). Pour tester davantage l'effet négatif du CTGF effet de choc sur la croissance des cellules du cancer gastrique, un test MTT a été effectuée et les courbes de croissance ont été générées (figure 3B). Comme cela est représenté par les courbes, les deux cellules de PSC1 et PSC2 prolifèrent plus lentement que les cellules et PSNC SGC7901 cellules pendant les 96 premières heures après que les cellules ont été plaquées. La réduction spectaculaire de la formation de colonies et la croissance des cellules CTGF a réduit au silence a proposé la suppression du CTGF peut réguler négativement la croissance des cellules du cancer gastrique. RT-QPCR a montré que les taux d'ARNm de la cycline de protéine du cycle cellulaire ont été liées D1 régulés à la baisse dans les deux lignées cellulaires stables du CTGF knockdown par rapport aux PSNC et SGC7901 (figure 3C). Conformément à ce résultat, nous avons observé une réduction marquée de la cycline D1 expression de la protéine dans les cellules knockdown CTGF PSC1 et PSC2 (Figure 3D). Chose intéressante, le traitement avec un milieu conditionné de SGC7901 sécrétant une grande quantité de CTGF a été capable de sauver la cycline D1 et de rétablir la régulation négative de la prolifération cellulaire dans les cellules knock-down stable CTGF. Ces données ont indiqué que la suppression du CTGF peut réguler négativement la croissance des cellules du cancer gastrique et diminuer la cycline D1 expression. La figure 3 knockdown de l'expression du CTGF inhibe la croissance des cellules cancéreuses gastriques. A. Colony formation essai. B. MTT de test de prolifération. C. Knockdown de CTGF bas régulé au niveau de la cycline D1 de l'ARNm. D. Knockdown de CTGF bas réglementé au niveau de la cycline D1 de protéines. PSC1 /PSC2 + CM SGC7901: Des cellules ou PSC1 PSC2 ont été incubées avec un milieu conditionné (CM) de SGC7901. Tous les résultats ont été reproductibles dans trois expériences indépendantes. * P < 0,05 par rapport au contrôle (contrôle est SGC7901).
Knockdown d'expression CTGF inhibe la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques
migration cellulaire et l'invasion sont des processus critiques dans les métastases tumorales. Nous avons investigué la migration cellulaire par une chambre de Boyden non revêtue de matrigel et l'invasion des cellules par des tests de la chambre d'invasion de Matrigel revêtu, respectivement. Dans les essais de migration (figure 4A), les taux de migration de la PSC1 et les cellules PSC2 ont diminué de façon significative par rapport au contrôle (P < 0,05). Comme cela est représenté sur la figure 4B, le CTGF knockdown également nettement réduit les propriétés d'invasion de cellules par rapport au témoin. Les taux de cellules PSC1 et PSC2 l'invasion des cellules ont été réduites de 61,4% et 55,8%, respectivement. RT-QPCR et Western blot a montré que la MMP-2 et MMP-9 ont été régulés à la baisse dans les deux clones stables par rapport aux cellules témoins (figure 4C; D). En revanche, la MMP-3 n'a pas changé de manière significative à la fois dans les niveaux d'ARNm et de protéines. Par ailleurs, l'analyse des zymographie a montré les activités tant de MMP-2 et MMP-9 dans les cellules transfectées stables ARNsi étaient significativement inférieurs à ceux des cellules témoins (figure 4E). Chose intéressante, le traitement avec un milieu conditionné de SGC7901 sécrétant une grande quantité de CTGF a induit la ré-expression de MMP-2 et MMP-9 et rétablit la migration et l'invasion des cellules knock-down CTGF stables. Ces résultats suggèrent que le knock-down de l'expression de CTGF a réduit la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques et une diminution de l'expression de MMP-2 et MMP-9. La figure 4 knockdown de l'expression du CTGF inhibe la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques. A. essai de migration cellulaire. B. dosage d'invasion cellulaire. les cellules de migration et d'invasion ont été fixées et colorées, et les champs représentatifs ont été photographiés. Pour la quantification, les cellules ont été comptées dans 10 champs aléatoires sous un microscope optique (x 200). des essais ont été effectués en triple pour chaque groupe de cellules dans l'invasion et la migration des essais, et les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type. C. RT-QPCR de l'analyse a été effectuée pour l'expression de l'ARNm de la MMP-2, MMP-3 et MMP-9 dans le CTGF knock-down Des lignées cellulaires stables et des cellules de contrôle. Les barres représentent la moyenne ± écart-type de trois expériences. D. Les niveaux de MMP-2, MMP-3 et MMP-9 protéines ont été détectées par Western blot. GAPDH a servi de témoin protéine de chargement. E. Analyse de Gélatine zymographie pour les activités de MMP-2 et MMP-9. PSC1 /PSC2 + CM SGC7901: Des cellules ou PSC1 PSC2 ont été incubées avec un milieu conditionné (CM) de SGC7901 * P <de;. 0,05 par rapport au contrôle (contrôle est SGC7901).
La régulation négative du CTGF inhibe la diffusion péritonéale du cancer gastrique in vivo
Pour explorer les effets de CTGF sur la dissémination péritonéale de cellules de cancer gastrique in vivo, nous avons inoculé des cellules différentes dans souris nude. cellules SGC7901, contrôle lignée cellulaire stable (PSNC), et CTGF cellules knockdown stables (de PSC1 et PSC2) ont été injectés dans quatre groupes distincts de souris nues. Comme conséquence d'un tel traitement, la suppression de la dissémination peritoneale mesurable chez les souris injectées avec des cellules stables du CTGF knockdown par rapport à celles injectées avec des cellules ou des cellules SGC7901 PSNC a été noté (figure 5A). Quantitativement, 117 ± 20 nodules disséminés ont été observés pour les souris de test inoculées avec des cellules SGC7901 et 137 ± 26 nodules disséminés ont été notés pour les souris inoculées avec des cellules PSNC. En revanche, les nodules importants disséminés moins ont pu être observées chez les souris injectées avec des cellules stables du CTGF knockdown (figure 5B). Figure 5 Knockdown de CTGF inhibe le cancer gastrique SGC7901 xénogreffe dissémination péritonéale. lignées cellulaires stables knockdown SGC7901, PSNC et CTGF (PSC1 et PSC2) ont été injectés par voie intrapéritonéale comme décrit sous "Matériel et méthodes". 6 semaines plus tard, les souris ont été sacrifiées, photographiées disséqués et de nodules disséminés présents sur le mésentère et le diaphragme ont été comptées. A. La photographie de souris nude avec diffusion péritonéale de chaque groupe. B. Les nodules disséminés ont été évalués. Chaque barre représente la moyenne ± écart type (n = 5 pour chaque groupe). * P < 0,05 comme Rapport
La littérature la plus vaste à ce jour concernant CTGF par rapport au contrôle (contrôle est SGC7901) de. Définit son rôle dans la guérison des plaies et des maladies fibrotiques. Récemment, plusieurs études mettent en cause CTGF dans le développement de la tumeur et la survie des cellules tumorales [28-30]. Néanmoins, le rôle exact de CTGF dans la progression tumorale est non définie, et la fonction de CTGF dans la biologie des cellules tumorales de cancer gastrique n'a pas été complètement étudiée. Pour répondre à ces questions, nous avons évalué l'expression de CTGF à l'égard des corrélations directes possibles avec la croissance cellulaire et l'invasion des cellules de cancer gastrique. De plus, nous avons encore étudié les effets de la diffusion CTGF péritonéale des cellules de cancer gastrique in vivo.
Dans cette étude, les résultats ont montré que le CTGF a été fortement exprimé dans les tissus du cancer de l'estomac par rapport à des tissus normaux appariés gastriques. L'expression de CTGF dans le cancer gastrique indifférenciée a été significativement plus élevés que ceux dans le cancer gastrique différencié. L'expression du CTGF dans le tissu tumoral a été associée à des métastases des ganglions lymphatiques et la dissémination peritoneale. En outre, les patients avec une expression de CTGF positifs avaient taux significativement plus bas postopératoire cumulatif de 5 ans de survie (22,9%) que ceux avec l'expression de CTGF négatif (48,1%, figure 1C). Ces résultats suggèrent que le CTGF pourrait être impliquée dans la progression et les métastases du cancer gastrique. Par ailleurs, le CTGF peut être un marqueur pronostique utile.
Plusieurs études récentes ont révélé que le CTGF réguler la croissance cellulaire dans les cellules cancéreuses de l'oesophage et des cellules du cancer du pancréas [20, 30]. Cependant, on connaît peu sur l'effet de l'expression du CTGF sur la croissance cellulaire des cellules cancéreuses gastriques. Nos résultats ont montré que la suppression de CTGF a entraîné une inhibition de la prolifération cellulaire et la croissance donogene. Les changements dans la croissance des cellules peuvent être des facteurs clés dans la régulation de la progression du cancer [31].

• Augmentation du nombre de sites de phosphorylation Helicobacter pylori CagA Epiya C augmente le risque de cancer de l'estomac, mais pas ulcer
• les profils des lésions précurseurs du cancer gastrique du nombre de copies d'ADN