fonctions Lnc ARN Hotair comme un ARN endogène en compétition pour réguler l'expression de HER2 par épongeant miR-331-3p dans le cancer gastrique

fonctions Lnc ARN Hotair comme un ARN endogène en compétition pour réguler l'expression de HER2 par épongeant miR-331-3p dans le cancer gastrique
Résumé de l'arrière-plan
accumulation de preuves indique que la longue non codant l'ARN Hotair joue un rôle crucial dans la progression du cancer et des métastases. Cependant, le rôle biologique globale et la signification clinique de Hotair dans la carcinogenèse gastrique reste largement inconnu.
Méthodes
expression Hotair a été mesurée dans 78 apparié des échantillons de tissus cancéreux et non cancéreux par PCR en temps réel. Les effets de l'air chaud sur les cellules cancéreuses gastriques ont été étudiés par la surexpression et l'interférence ARN approches in vitro et in vivo. Un aperçu du mécanisme des ARN endogènes compétitifs (ceRNAs) ont été tirés de l'analyse bio-informatique, des dosages de luciférase et la protéine de liaison d'ARN immunoprécipitation (RIP). L'interaction Hotair /HER2 positif a été identifié et vérifié par un test d'immunohistochimie et de l'analyse de corrélation bidimensionnelle.: Résultats
Hotair surexpression était associée à une plus grande taille de la tumeur, le stade pathologique avancé et étendue des métastases, et aussi en corrélation avec la survie globale plus courte de l'estomac les patients cancéreux. En outre, la surexpression Hotair a favorisé la prolifération, la migration et l'invasion des cellules du cancer de l'estomac, tandis que l'épuisement Hotair a inhibé à la fois l'invasion cellulaire et la viabilité des cellules, et l'arrêt de croissance induit in vitro et in vivo. En particulier, Hotair peut agir comme un Cerna, devenant effectivement un puits pour miR-331-3p, modulant ainsi la dérépression de HER2 et d'imposer un niveau supplémentaire de régulation post-transcriptionnelle. Enfin, le Hotair /HER2 corrélation positive était significativement associée à des cancers gastriques avancés.
Conclusions
Hotair surexpression représente un biomarqueur de mauvais pronostic dans le cancer gastrique, et peut conférer phénotype malin des cellules tumorales. Le réseau réglementaire Cerna impliquant Hotair et l'interaction positive entre Hotair et HER2 peut contribuer à une meilleure compréhension de la pathogenèse du cancer gastrique et faciliter le développement de produits diagnostiques et thérapeutiques lncRNA-dirigé contre cette maladie.
Mots-clés
Competing endogène ARN HER2 Hotair gastrique prolifération du cancer et de l'invasion de fond
cancer gastrique est la deuxième principale cause de décès induite par le cancer, et est le cancer gastro-intestinal le plus fréquent en Asie de l'est, Europe de l'est, et certaines parties de l'Amérique centrale et du Sud. Dans la plupart des patients, le cancer gastrique est diagnostiqué à un stade avancé et est accompagnée par une prolifération maligne, une vaste invasion et la métastase lymphatique. stratégies thérapeutiques efficaces sont limitées et le taux de mortalité est élevé [1, 2]. Longues ARNs non codants (lncRNAs) ont récemment attiré l'attention significative à délimiter les mécanismes complexes des processus malins sous-jacents tels que la carcinogenèse, la métastase et la résistance aux médicaments. Par conséquent, si nous voulons comprendre la carcinogenèse gastrique, nous devons considérer cette famille de transcriptions réglementaires qui ajoutent une nouvelle couche de complexité à la biologie de la tumeur.
Bien que seulement un petit nombre de lncRNAs fonctionnels ont été bien caractérisés à ce jour, ils ont été montré pour réguler l'expression des gènes à différents niveaux, y compris la modification de la chromatine, la transcription et le traitement post-transcriptionnel [3, 4]. Récemment, un nouveau mécanisme de régulation a été identifié dans lequel la diaphonie entre lncRNAs et ARNm se produit par compétition pour microARN (miARN) partagées des éléments de réponse. Dans ce cas, lncRNAs peut fonctionner comme concurrentes ARN endogènes (ceRNAs) à éponge miARN, modulant ainsi la dérépression des cibles miARN et en imposant un niveau supplémentaire de régulation post-transcriptionnelle [5]. Dans les rapports précédents, un lncRNA spécifique du muscle, LINC-MD1, a été signalé comme étant un Cerna qui protège l'ARN MyoD messager (ARNm) de la dégradation de miARN médiée [6]. Pluripotence-associé lnc-RoR peut fonctionner comme un Cerna clé pour relier le réseau des miARN et des facteurs de transcription de base, par exemple, Oct4, Sox2 et Nanog, dans les cellules souches embryonnaires humaines. En particulier, lncRNA HULC est fortement régulée positivement dans le cancer du foie et joue un rôle important dans la tumorigenèse [7]. En particulier, HULC peut agir comme une «éponge» endogène qui régule à la baisse une série d'activités miARN, miR-372, y compris [8]. Nous proposons donc que certains lncRNAs peuvent aussi avoir des rôles ceRNAs, miARN de liaison et le réseau post-transcriptionnelle dans la pathogenèse gastrique.
Hotair (Hox transcription ARN antisens intergénique
) est un long ARN ~ 2,2 kb non codante transcrit à partir du locus du Hoxc, qui peut réprimer la transcription dans
trans de HOXD
dans les fibroblastes prépuce [9]. Comme une nouvelle molécule dans le domaine de la biologie des tumeurs, Hotair initialement est devenu bien connu pour son implication dans les tumeurs du sein primaires et les métastases du cancer du sein, dans lequel l'élévation de Hotair promu invasivité et les métastases [10]. En outre, l'expression Hotair corrélation positive avec les processus malins et un mauvais pronostic dans le cancer colorectal, le carcinome hépatocellulaire, le cancer du pancréas et les tumeurs stromales gastro-intestinales [11-14]. Des études récentes ont rapporté que Hotair a été régulée à la hausse dans le cancer gastrique [15, 16]. Néanmoins, le rôle biologique globale et mécanisme moléculaire sous-jacent de Hotair dans la carcinogenèse gastrique reste largement indéfini.
Dans cette étude, nous rapportons que Hotair surexpression est un changement moléculaire caractéristique dans le cancer gastrique et étudions les rôles biologiques de Hotair sur les phénotypes de les cellules de cancer gastrique in vitro et in vivo. En outre, l'analyse mécanistique révèle que Hotair peut fonctionner comme un Cerna pour réguler l'expression du récepteur du facteur de croissance épithélial humain 2 (HER2) à travers la compétition pour miR-331-3p, jouant ainsi un rôle dans la pathogenèse oncogénique gastrique. Les résultats de la présente étude fournit la première preuve d'une Hotair /HER2 corrélation positive et la diaphonie entre miR-331-3p, Hotair et HER2, apportant un nouvel éclairage sur le traitement du cancer gastrique.
expression Hotair est surexprimés dans les tissus de cancer gastrique humain
Le niveau d'expression a été déterminée dans Hotair 78 échantillons de cancer de l'estomac et des tissus adjacents par paires, histologiquement normaux par qRT-PCR et normalisé à la GAPDH. expression Hotair était significativement régulée positivement dans les tissus cancéreux (rapport de 14,35 fois, P <moyenne; 0,01) par rapport à leurs homologues normaux (Figure 1A). L'examen de la corrélation entre l'expression Hotair et les caractéristiques pathologiques cliniques ont montré que Hotair une régulation positive était corrélée à la taille plus importante de la tumeur, le stade pathologique avancé, les métastases à distance (figure 1 B et C), de métastases ganglionnaires et la différenciation des cellules tumorales (Tableau 1). Cependant, l'expression Hotair n'a pas été associée à la position de la tumeur ou le sexe du patient (tableau 1). En ce qui concerne la survie globale, les patients présentant une expression élevée de Hotair avaient un pronostic nettement plus pauvres que ceux qui ont une faible expression de Hotair (P < 0,001, log-rank test, figure 1D). Ces résultats indiquent que la surexpression Hotair peut être utile dans le développement de nouveaux marqueurs pronostiques ou la progression du cancer gastrique. La figure 1 relative l'expression de Hotair dans les tissus de cancer gastrique et de son importance clinique. (A) Expression relative de l'air chaud dans les tissus du cancer de l'estomac (n = 78) par comparaison avec les tissus normaux correspondants non tumorales (n = 78). expression Hotair a été examiné par qRT-PCR et normalisée à l'expression de GAPDH. Les données ont été présentées en tant que facteur de variation dans les tissus tumoraux par rapport aux tissus normaux. (B) L'examen de la corrélation entre l'expression Hotair et les caractéristiques pathologiques cliniques a montré que Hotair surexpression en corrélation avec la taille plus grande de la tumeur et le stade pathologique avancé. expression (C) Hotair était significativement plus élevée chez les patients atteints de métastases à distance que dans ceux avec métastases non lointain. (D) de Kaplan-Meier courbes de survie globale selon le niveau d'expression Hotair. La survie globale du groupe de haut-Hotair (n = 39: ratio médian Hotair rapport d'expression ≥) était significativement plus élevée que celle du Bas-Hotair groupe (n = 39; Hotair rapport rapport d'expression ≤ médiane; P < 0,001, log- test de rang). * P < 0,05, ** P < 0,01.
Tableau 1 Corrélation de l'expression de Hotair avec des caractéristiques clinico
caractéristiques clinicopathologiques
n (%)
expression relative de
P-valeurB de HOTAIRa
Sexe
P = 0,62
Homme
50 (64)
12,21 (0,97 à 17,53)
Femme
28 (36)
15.01 (7.34 -19,52)
site de la tumeur
P = 0,910
distal troisième
18 (23)
9.1 (1,37 à 14,12)
troisième
Moyen 20 (26)
7,96 (2,55 à 9,72)
40 (51)
7,76 (1,24 à 13,58)
Différenciation
P = 0,045
Poor estomac proximal
56 (72)
15,6 (6,25 à 20,36)
High /
modérée 22 (28)
8.1 (0,98 à 11,14)
métastase ganglionnaire
P = 0,005
N0
10 (13)
1,14 (0,75 à 1,42)
N1
11 (14)
3,44 (1,15 à 4,85)
N2
29 (37)
11,99 (7.15- 14,77)
28 (36)
32,58 (7,34 à 36,27)
métastases
N3
P = 0,029
M0
64 (82)
9,35 (2,53 14 fig de -33,64)
M1
28,82 (16,39 à 39,39)
aMedian d'expression relative, 25e percentile-75e entre parenthèses. bP < 0,05 a été considérée comme significative (test
Mann-Whitney U entre 2 groupes et Kruskall-Wallis pour 3 groupes). Es Manipulation des niveaux Hotair dans les cellules cancéreuses gastriques
Nous avons ensuite effectué une analyse qRT-PCR pour examiner la les niveaux d'expression d'air chaud dans diverses lignées de cellules cancéreuses, y compris l'estomac, cancer non à petites cellules du poumon (NSCLC), et les cellules cancéreuses dérivées du sein. Comme le montre la figure 2A, des quatre lignées cellulaires de cancer gastrique étudiés (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, et AGS), BGC-823 ont exprimé des niveaux plus élevés de Hotair (3,18 fois) que la cellule de l'épithélium gastrique normale ligne (GES-1). De même, la lignée cellulaire NSCLC, SPC-A1, a montré une surexpression 3,73 fois de Hotair sur la ligne humaine normale des cellules épithéliales bronchiques, 16HBE. La lignée cellulaire de cancer du sein hautement métastatique MDA-MB-231 a montré une régulation à la hausse 4,77 fois d'air chaud par rapport aux cellules MCF-7 (figure 2A). Nos données suggèrent que Hotair peut être fréquemment régulée positivement dans les cellules tumorales nombreuses. Figure 2 Le niveau d'expression Hotair dans les cellules cancéreuses gastriques et son effet sur la prolifération cellulaire in vitro. (A) Les résultats de qRT-PCR démontrant Hotair niveaux de lignées cellulaires de cancer gastrique (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, et AGS) expression par rapport à la normale lignée cellulaire de l'épithélium gastrique (GES-1), la lignée cellulaire NSCLC ( SPC-A1) par rapport à la ligne normale de l'épithélium bronchique humain cellulaire (16HBE) et des lignées de cellules mammaires cancéreuses MDA-MB-231 par rapport aux cellules MCF-7. (B) qRT-PCR analyse du niveau d'expression Hotair traitement suivant cellules BGC-823 avec siRNA ciblant les cellules SGC-7901 Hotair et de traitement avec pCDNA /Hotair vecteur. essai (C) de MTT a été effectuée pour déterminer la prolifération des si-Hotair transfectées BGC-823 ou des cellules SGC-7901 pCDNA /Hotair-transfectées. Les données représentent la moyenne ± e.t. à partir de trois expériences indépendantes. (D) Essai de croissance de formation de colonies a été effectuée pour déterminer si la prolifération des Hotair-transfectée BGC-823 cellules. Les colonies ont été comptées et capturés. * P < 0,05 et ** P < 0,01.
Pour manipuler les niveaux Hotair dans les cellules de cancer gastrique, un vecteur pCDNA /Hotair a été transfecté dans des cellules et si-Hotair SGC-7901 a été transfecté dans BGC-823 cellules, respectivement. Analyse qRT-PCR des niveaux Hotair a été effectué à 48 h après la transfection et a révélé que l'expression a été augmentée Hotair 98 fois dans des cellules CGS-7901, par rapport aux cellules témoins. Cependant, BGC-823 cellules, expression Hotair était effectivement 75% renversé par si-HOTAIR2, le siRNA plus efficace par la suite utilisé dans les expériences suivantes (figure 2B).
Effet de Hotair sur la prolifération cellulaire et l'apoptose in vitro
l'augmentation significative de l'expression Hotair dans des échantillons de cancer gastrique nous a incité à explorer la signification biologique possible de Hotair dans la tumorigenèse. un test MTT a révélé que la croissance cellulaire était significativement altérée chez BGC-823 transfectées avec de si-Hotair, tandis que la prolifération des cellules CGT-7901 a été augmentée dans les cellules /pcDNA d'air chaud transfectées par rapport aux témoins respectifs (figure 2C). De même, le résultat de l'essai de colonies formation a révélé que la survie clonogénique a diminué suite à l'inhibition de la Hotair dans les cellules BGC-823 (Figure 2D).
Pour déterminer si l'apoptose a été un facteur contribuant à la cellule inhibition de la croissance, nous avons effectué Hoechst coloration et analyse de cytométrie en flux de si-Hotair traités BGC-823 cellules. Les données ont montré que le nombre de cellules avec des noyaux condensés et fragmenté indiquant la fraction de cellules apoptotiques précoces était significativement plus élevée dans Hotair si-traité BGC-823 cellules par rapport aux cellules SI-NC-traitées (Figure 3A et B). En outre, nous avons constaté que l'inhibition de la Hotair améliorée caspase-3-dépendante l'apoptose, démontrée par analyse par transfert Western de la caspase-3 activée après si-Hotair transfection (fichier supplémentaire 1: Figure S1). Pris ensemble, ces résultats indiquent que l'effet de choc de Hotair gastrique inhibe la prolifération des cellules cancéreuses et induit une apoptose in vitro. Figure 3 L'effet de l'air chaud sur l'estomac de l'apoptose des cellules cancéreuses, la migration et l'invasion in vitro. BGC-823 cellules ont été transfectées avec si-Hotair ou si-NC, et les cellules SGC-7901 ont été transfectées avec pCDNA /Hotair vecteur vide ou contrôle vectoriel. (A) coloration de Hoechst dosage de l'apoptose cellulaire; le pourcentage de noyaux positifs par Hoechst-champ optique (au moins 50 champs) a été déterminée. (B) Les taux de cellules apoptotiques ont été détectées par cytométrie de flux. UL, les cellules nécrotiques; UR, les cellules apoptotiques terminaux; LR, début des cellules apoptotiques. (C et D) Transwell essais ont été effectués pour étudier les changements dans la migration cellulaire et l'invasivité. * P < 0,05 et ** P < 0,01.
Hotair favorise la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques in vitro, l'invasion cellulaire
est un aspect important de la progression du cancer qui implique la migration des cellules tumorales dans les tissus contigus et la dissolution des protéines de la matrice extracellulaire. Ici, nous avons évalué l'invasion des cellules cancéreuses à travers Transwell essais. Comme cela est représenté sur la figure 3C, la transfection d'ARNsi Hotair nui à la capacité migratoire des cellules BGC-823 d'environ 66%. Un effet correspondant sur invasivité a également été observée dans un essai d'invasion parallèle. A l'inverse, la transfection de cellules SGC-7901 avec pCDNA /Hotair vecteur promu la migration cellulaire et l'invasivité ~ 1,9 fois (Figure 3D). Ces données indiquent que Hotair a des propriétés oncogènes qui peuvent favoriser un phénotype migratoire et envahissante dans les cellules de cancer gastrique.
Hotair favorise la tumorigenèse des cellules de cancer gastrique in vivo
Pour déterminer si le niveau d'expression Hotair affecte tumorigenèse, BGC-823 cellules transduites avec le vecteur sh-Hotair /pENTR (EV) ont été utilisés dans un modèle de xénogreffe de souris nude. Jusqu'à 16 jours après le knockdown de Hotair, il y avait une diminution spectaculaire du volume tumoral et de poids dans le groupe SH-Hotair par rapport aux témoins (figure 4A, B et C). Ensuite, l'analyse immunocoloration du PCNA marqueur de prolifération a été réalisé dans des tissus de tumeur réséquée. En comparaison avec celle des tumeurs formées à partir de cellules témoins, les tumeurs sh Hotair dérivées montré une réduction significative de PCNA positivité (figure 4D). Ces résultats suggèrent que le niveau d'expression Hotair est significativement associée à la capacité de prolifération in vivo des cellules cancéreuses gastriques. La Figure 4 Effet de l'air chaud knock-down sur la croissance tumorale in vivo. (A) des courbes de croissance de la tumeur ont été mesurés après l'injection de BGC-823 cellules transfectées avec sh-Hotair ou pENTR vecteur. Le volume des tumeurs a été calculé tous les 3 jours. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± e.t. (N = 5). (B) Le poids de la tumeur. Les valeurs sont des moyens de poids de la tumeur ± e.t. (C) Analyse qRT-PCR de l'expression Hotair dans les tissus des tumeurs réséquées. (D) Tumeurs développées à partir BGC-823 cellules /sh-Hotair ont montré un niveau inférieur de la protéine PCNA que les tumeurs développées à partir de cellules de vecteurs BGC-823 /pENTR. Tige: H & E coloration; Basse: immunocoloration. * P < 0,05 et ** P < 0,01.
Hotair est une cible de miR-331-3P et l'analyse bioinformatique de miR-124 de miARN reconnaissance des séquences sur Hotair a révélé la présence de 11 miARN tumorales-suppressive sites de liaison. L'air chaud d'ADNc a été clone en aval du gène de la luciférase et son nom Rluc-Hotair (figure 5A), puis transfecté conjointement avec divers plasmides codant pour des miARN. rno-miR-344 a agi comme un contrôle négatif. Les résultats ont montré que l'activité luciférase a été réduite de 48% et 31% par rapport au contrôle du vecteur vide lorsque respectivement miR-331-3p et miR-124 ont été exprimées,. Ces données démontrent que les deux miR-331-3p et miR-124 peuvent directement lier à Hotair à travers des sites de reconnaissance miRNA respectifs (figure 5B panneau de gauche). Figure 5 Hotair est une cible de miR-331-3P ou miR-124 et miR-contrôle cible 331-3p. (A) Les 11 sites putatifs miRNA de liaison dans la séquence Hotair. L'ADNc Hotair contenant les miARN putatifs sites de reconnaissance a été cloné en aval du gène de la luciférase et nommé Rluc-Hotair. (B) Gauche: Le plasmide rapporteur luciférase (Rluc-Hotair) a été co-transfecté dans des cellules avec les 11 différents plasmides miRNA codant HEK-293 T. A droite: le plasmide rapporteur luciférase contenant de type sauvage ou mutant Hotair a été co-transfecté dans des cellules avec miR-331-3p en parallèle avec un vecteur plasmidique vide HEK-293 T. L'activité luciférase a été déterminée en utilisant le dosage de la luciférase double et montré que l'activité de la luciférase normalisée par rapport à une activité de Renilla. Histogramme indique les valeurs de luciférase mesurée 48 h après la transfection. (C) L'extrémité 3 'UTR de HER2 a été fusionnée à la région codante de la luciférase (Rluc-HER2 3' UTR) et transfecté dans des cellules HEK293T avec miR-331-3p pour confirmer HER2 est la cible de miR-331-3p. Rluc-HER2 3'-UTR et les constructions miR-331-3p ont été co-transfectés dans des cellules HEK293T avec des plasmides exprimant Hotair (pCDNA /Hotair) ou avec un vecteur de contrôle pour vérifier l'activité Cerna de Hotair. rno-miARN-344 a été utilisé comme témoin négatif. Histogramme indique les valeurs de luciférase mesurée 48 h après la transfection. (D) RIP avec un anticorps monoclonal de souris anti-Ago2 IgG pré-immune ou 10% entrée provenant des extraits BGC 823 cellules. Les taux d'ARN dans les immunoprécipités ont été déterminées par qRT-PCR. Top: niveaux de Hotair, miRNA331-3P et FOS ARN ont été présentés comme un enrichissement fois dans Ago2 par rapport à immunoprécipités IgG. En bas: les niveaux d'ARN relatifs de U1 snRNA dans SNRNP70 par rapport à immunoprécipités IgG. Les chiffres sont e.t. ± moyenne (N = 3). (E) L'analyse par Western blot de niveau de protéine HER2 après traitement du BGC-823 cellules avec si-Hotair ou pCDNA /Hotair, et les cellules SGC-7901 avec pCDNA /Hotair. GAPDH a été utilisé comme témoin. * P < 0,05, ** P < 0,01 et N.S. non significatif.
Ici, nous avons choisi miR-331-3p comme modèle miRNA pour d'autres études. Pour confirmer en outre que la réduction de l'activité luciférase du vecteur Rluc-Hotair-WT était due à une interaction directe entre le miARN et son site de liaison putatif, nous avons muté au site de liaison miR-331-3p par mutagenèse dirigée sur le site, ce qui entraîne Rluc -HOTAIR-Mut. Comme prévu, la suppression de l'activité luciférase a été complètement abolie dans cette construction mutant comparé à de type sauvage vecteur (figure 5B panneau de droite).
Hotair et miR-331-3p lient tous deux avec Ago2 dans les cellules de cancer gastrique
miARN sont connu pour être présent dans le cytoplasme sous forme de miARN ribonucléoprotéines complexes (miRNPs) qui contiennent également Ago2, le composant de base du silençage RNA-induced complexe (RISC) [17, 18]. Pour tester si les associés Hotair avec miRNPs, ARN liaison protéine immunoprécipitation (RIP) expériences ont été effectuées sur des extraits cellulaires BGC-823 en utilisant des anticorps contre Ago2. Les taux d'ARN dans les immunoprécipités ont été déterminées par qRT-PCR. Hotair a été préférentiellement enrichi (354 fois) dans Ago2 contenant miRNPs par rapport à contrôler l'immunoglobuline G (IgG) immunoprécipités. De même, miRNA-331-3p a été détecté à un niveau 840 fois supérieur à celui du contrôle anti-IgG. immunoprécipitation réussie de l'ARN Ago2 associée a été vérifiée par qRT-PCR, en utilisant des amorces RIP contre FOS humains inclus dans le kit RIPAb + Ago2 (Figure 5D, panneau supérieur). En outre, l'anti-SNRNP70 a été utilisé comme témoin positif pour la procédure de RIP et ARNsn U1 a également été détectée à un niveau de 206 fois supérieure à celle de l'anti-IgG (figure 5D, panneau inférieur). Ainsi, Hotair est présent dans Ago2 contenant miRNPs, probablement par association avec miRNA-331-3p, conformément à nos analyses et luciférase analyses bioinformatiques.
Hotair contrôle la cible miR-331-3p, HER2
Parmi les nombreux cibles de miR-331-3p, nous nous sommes concentrés sur HER2 car elle code pour une protéine transmembranaire avec une fonction correspondante dans la carcinogenèse et la résistance à la thérapie à base trastuzumab [19]. L'extrémité 3 'UTR de HER2 a été fusionnée à la région codante de la luciférase (Rluc-HER2 3' UTR) et transfectées avec des plasmides codant pour miR-331-3p et un plasmide vecteur vide. rno-miARN-344 a agi comme un contrôle négatif. Le dosage de la luciférase a montré que miR-331-3p a inhibé de manière significative l'activité de la luciférase (~ 41% d'inhibition) de la Rluc-HER2 3 'UTR rapporteur, ce qui confirme que HER2 est une cible de miR-331-3p. Le Rluc-HER2 3'-UTR construction a ensuite été transfectées avec des plasmides codant pour miR-331-3p et Hotair (pCDNA /Hotair). les dosages de luciférase ont indiqué que, en présence d'air chaud, Rluc-HER2 3 'UTR de répression a été restaurée par rapport au groupe témoin (figure 5C). Ceci indique que Hotair agit comme une «éponge» endogène par liaison miR-331-3p, abolissant ainsi l'activité refoulante induite par miARN sur le HER2 3 'UTR.
En outre, l'effet de l'expression Hotair sur la protéine HER2 endogène combinaison avec la modulation des niveaux d'ARNmi ou lncRNA a été contrôlée par les différentes méthodes indiquées à la figure 5E: (1) la surexpression de miR-331-3p contre HER2 dans des cellules BGC-823; (2) Hotair knockdown contre HER2 dans BGC-823 cellules; (3) Hotair surexpression HER2 dans les cellules SGC-7901. L'analyse Western Blot a montré que l'expression forcée de miR-331-3p ou knock-down de Hotair dans BGC-823 cellules a provoqué un effet significatif sur le silençage endogène expression de la protéine HER2. En outre, la protéine HER2 expression a été nettement régulée positivement après transfection avec Hotair dans SGC-7901 cellules, ce qui démontre un niveau d'expression de Hotair endogène relativement faible.
Ensemble, ces données indiquent que la liaison par miR-331-3p, Hotair agit comme un Cerna pour la cible HER2 ARNm, modulant ainsi la dérépression de HER2 et d'imposer un niveau supplémentaire de régulation post-transcriptionnelle.
miR-331-3p et miR-124 supprimer gastrique cellules cancéreuses prolifération
pour servir comme un puits endogène pour cible miARN, l'abondance de Hotair devrait être comparable ou supérieure à miR-331-3p /miR-124. Dans notre étude, l'analyse qRT-PCR a montré que miR-331-3p /miR-124 expression était inversement corrélée avec l'expression Hotair dans 20 paires de cancers gastriques avancés (figure 6A). Pour valider si miR-331-3p et miR-124 pourrait également inhiber la prolifération gastrique des cellules cancéreuses, nous avons forcé leur expression dans BGC-823 cellules en utilisant des plasmides miRNA codant. Les niveaux d'expression de miARN-331-3p et miR-124 transfectées dans BGC-823 cellules ont été significativement augmenté de 36 fois et 29 fois, respectivement, par rapport aux cellules de contrôle (Figure 6B). Ensuite, MTT et la formation de colonies de tests ont été effectués pour déterminer la viabilité cellulaire. Les résultats des courbes de titrage et de croissance MTT a révélé que les cellules transfectées avec miR-331-3p ou miR-124 présentaient un retard de croissance significatif comparativement à des cellules transfectées avec un vecteur vide (figure 6C). Ces données indiquent que la surexpression de miR-331-3p ou miR-124 peut arrêter l'expression gastrique prolifération des cellules cancéreuses, ce qui est cohérent avec les résultats de l'expression dans Hotair knockdown BGC-823 cellules. Figure 6 corrélation positive entre Hotair et HER2 expression et la pertinence pour /miR-124 niveaux d'expression de miR-331-3p. (A) bivariées d'analyse de corrélation de la relation entre l'expression Hotair et miR-331-3p, ou miR-124 niveau. (B) BGC-823 cellules ont été transfectées avec des plasmides codant pour miR-331-3p ou miR-124 et qRT-PCR a été utilisée pour détecter les niveaux de miARN par rapport aux contrôles (miR-NC). (C) dosage MTT et dosage de formation de colonies de croissance ont été effectuées pour déterminer la prolifération de miR-331-3p ou miR-124 transfectées BGC-823 cellules. (D) gauche: immunocoloration de la protéine HER2 dans des échantillons de tissus de cancer gastrique avancé. Upper: immunocoloration de HER2 a été négative dans les tissus de cancer gastrique relativement faible expression de Hotair. Basse: immunocoloration de HER2 a été positive dans les tissus de cancer gastrique avec une expression relativement élevée de Hotair. A droite: bivariées analyse de corrélation de la relation entre Hotair et HER2 niveau d'expression. * P < 0,05, ** P < 0,01.
HER2 est co-exprimées avec Hotair dans les tissus de cancer gastrique
Le taux de surexpression HER2 a été signalé à être 7-34% dans le cancer gastrique, et était associé à une maladie plus agressive et moins bonne survie dans le cancer gastrique [19]. Nous avons détecté une expression de HER2 dans 50 les tissus gastriques avancés de cancer (stade III /IV) choisis parmi les 78 tissus de cancer gastrique antérieurs par immunohistochimie (IHC) et l'analyse qRT-PCR. Les résultats de la coloration IHC a montré la protéine HER2 positivité dans 56% des 50 tissus de cancer gastrique sélectionnés. Quatre-vingt-six pour cent de ces échantillons positifs HER2 étaient de stade avancé III /IV tumeurs, et 71% affiché une expression de haut Hotair (Figure 6D et fichiers supplémentaires 2: Tableau S2). analyse de corrélation bivariée a montré que l'expression de HER2 était significativement corrélée avec Hotair niveau de transcription dans les tissus de cancer gastrique par rapport à leurs homologues normaux (Figure 6D). Ces données indiquent que l'expression de HER2 est positivement associée à Hotair upregulated dans des échantillons de tissus de cancer gastrique, ce qui suggère que la caractérisation de l'interaction HER2 /Hotair pourrait être biologiquement significative dans la tumorigenèse gastrique humaine.
Notamment, en raison d'une phase III en cours /IV procès, le taux de surexpression HER2 détecté dans la présente étude est supérieure à la fourchette médiane précédemment. Cette augmentation du taux de surexpression de HER2 est fortement liée à des résultats médiocres pour les patients atteints de la discussion
lncRNAs, métastatique et de haute qualité localisée cancers gastriques, soulignant ainsi l'importance de HER2 dans le développement du cancer de l'estomac et les métastases de. Qui sont plus 200 nucléotides de long avec une capacité codant pour la protéine limitée, sont souvent exprimés de façon aux maladies, tissu ou développement spécifique du stade, ce qui indique des fonctions spécifiques pour lncRNAs dans le développement et les maladies et de faire ces molécules cibles thérapeutiques intéressantes [20-22]. Un certain nombre de travaux récents ont révélé que la dysrégulation de ces lncRNAs peut également affecter la régulation du génome eucaryote et de fournir un avantage de croissance cellulaire, entraînant dans la croissance tumorale progressive et incontrôlée [23-25]. Par conséquent, lncRNAs peut fournir une pièce manquante du puzzle de réseau suppresseur oncogène et de la tumeur par ailleurs bien connu.
Dans cette étude, nous avons testé l'expression de Hotair dans des échantillons de carcinome gastrique et leurs tissus environnants non-tumoraux. Nous avons également identifié la fonction de Hotair dans les cellules de carcinome gastrique en appliquant des approches et la perte intensité forte de fonction. Les résultats ont démontré que Hotair a été régulée à la hausse dans les tissus du cancer de l'estomac en comparaison avec les tissus normaux adjacents gastriques, et une régulation positive en corrélation avec Hotair plus grande taille de la tumeur, le stade pathologique étendu de pointe et les métastases. En outre, la durée de survie globale des patients ayant de faibles niveaux d'expression Hotair était significativement plus longue que celle des patients ayant des niveaux d'expression d'air chaud modéré ou fort. En outre, la surexpression Hotair a favorisé la prolifération, la migration et l'invasion des cellules du cancer de l'estomac, tandis que l'épuisement Hotair inhibé l'invasion des cellules et la viabilité cellulaire, et l'arrêt de croissance induit à la fois in vitro et in vivo. En outre, la suppression Hotair a conduit à la promotion de l'apoptose des cellules gastriques. Ces résultats suggèrent que Hotair joue un rôle direct dans la modulation de multiples propriétés oncogéniques et la progression du cancer gastrique, stimulant de nouvelles orientations de recherche et les options thérapeutiques qui envisagent Hotair comme marqueur pronostique nouvelle et cible thérapeutique dans le cancer gastrique.
L'importance de lncRNAs dans la maladie humaine peut être associée à leur capacité à influer sur les fonctions cellulaires par l'intermédiaire de divers mécanismes. Dans cette étude, dans la mesure où le mécanisme d'air chaud est concerné, il convient de mentionner que subcellulaire analyse de la localisation de Hotair par l'ARN fluorescence essai d'hybridation in situ montre la localisation d'air chaud à la fois le noyau et le cytoplasme [24]. Il est évident que Hotair nucléaire peut cibler polycomb complexe répressif 2, altérant H3K27 modèles de méthylation et l'expression des gènes dans le génome [10, 11]. Des travaux récents rapporté une fonction d'échafaudage pour Hotair dans le cytoplasme comme inducteur de l'ubiquitine protéolyse [26]. Néanmoins, les propriétés tumorigènes et hétérogénéité mécaniste de Hotair, et en particulier ceux de la forme cytoplasmique, sont loin d'être complètement élucidé.
Inspiré par le réseau réglementaire des «ARN endogènes compétitifs et de nouvelles données qui suggèrent que lncRNAs peut participer à cette un circuit de régulation, nous avons supposé que Hotair peut également servir de Cerna et nous avons donc cherché des interactions potentielles avec miARN. À l'appui de cette notion, nous avons utilisé l'analyse bioinformatique et des essais de luciférase pour valider la capacité de liaison directe des éléments de réponse miRNA prévus sur la transcription de Hotair pleine longueur. * P < 0,05. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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