Karakterizacija ljudskog metilacije želučanog karcinoma povezanih s 9 miR CpG otoka i represiju njihovih izraza in vitro i in vivo

karakterizacija ljudskih metilacije 9. Mir želučanog karcinoma povezanih
CpG otoka i represiju nad svojim izrazima in vitro pregled i In vivo
apstraktne pregled pozadini pregled Mnogi Mir pregled, geni se nalaze unutar ili oko CpG otocima. Nejasno je da li metilacije ovih CpG otoka potiskuje Mir pregled transkripciju redovito. Ciljevi ovog istraživanja su okarakterizirati karcinom želuca (GC) su povezane s metilacije Mir
CpG otoka i njegov odnos s Mirne izražavanja. Pregled metoda
metilacije status od 9. reprezentativnog Mir pregled CpG otoke u ploča stanične linije i ljudske želučane uzoraka (uključujući 13 normalnih biopsije, 38 gastritisa biopsije, 112 parova GCS i njihove kirurških uzoraka margin) analizirana je bisulfitne-DHPLC i sekvenciranje. Zreli Mirna razine su određena kvantitativnom RT-PCR. Odnosi između MIR pregled metilacije, prepisivanje, razvoj GC, a kliničkopatološkim osobine su statistički obrađeni. | Rezultati
Metilacija frekvencija 5 MIR
CpG otoci (Mir-9-1 pregled, Mir-9 -3 pregled, Mir-137 pregled, Mir-34b pregled i Mir-210 pregled) postupno povećava dok je udio mctiliranog Mir-200B postupno
smanjila tijekom želučane karcinogeneze (Ps
< 0,01). Više Mir-9-1 pregled metilacije otkrivena je u 62% -64% od uzoraka GC i 4% od normalne ili gastritisa uzoraka (18/28 naspram 2/48; omjer izgleda, 41,4; P izvoznici <0,01). Mir-210 pregled metilacije pokazala visoku korelaciju s H. pylori
infekcije. Mir-375 pregled, Mir-203 pregled i Mir-193.b pregled metilacije može biti domaćin prilagodba na razvoj GCS. Metilacija od tih Mir pregled CpG otoka dosljedno pokazuje značajno smanjenje odgovarajuće Mirna razine prikazane u linijama humanih stanica. Inverzna veza također je uočena za Mir-9-1 Netlogu, Mir-9-3 pregled, Mir-137 pregled i Mir-200b pregled u želučanim uzoraka. Među 112 GC pacijenata, Mir-9-1 pregled metilacije bila samostalna povoljan pokazatelj sveukupne opstanka GC pacijenata u oba univarijantne i multivarijatne analize (P izvoznici < 0,02). Pregled Zaključci pregled U zaključku , promjena metilacije status 6 od 9 testira miR
CpG otoci obilježeno je u želučanoj karcinogeneze. Mir-210 pregled metilacije u korelaciji s H. pylori
infekcije. Mir-9-1 pregled metilacije može biti GC-specifičan događaj. Metilacija Mir
CpG otoci mogu značajno dolje reguliraju njihovu transkripciju redovito. Pregled Pozadina pregled Mirni su u izobilju klasa malih nekodirajuće RNA koja se uglavnom reguliraju ekspresiju gena u post-razini transkripcije. Oni igraju ključnu ulogu u obnovi i diferencijaciju matičnih stanica i pospješuje staničnim lozama. Prethodna istraživanja su pokazala da se kod raka nekoliko Mir
gene kao Mir-200b /200A /429 pregled, Mir-21 pregled, Mir-30b
, Mir-30d
, Mir -31
i Mir-423 pregled izraženi su, dok su ostale Mir pregled, geni, kao što Mir-143 Netlogu i Mir-145 Netlogu regulirani [1-3]. Dokazi sugeriraju da su promjene u ekspresiji Mirna se često javljaju kod mnogih vrsta raka i ove varijacije ili doprinijeti procesu karcinogeneze ili odražava na razvoj i progresiju raka.
Postoji nekoliko puteva koji mogu utjecati na zrele razine Mirne u stanicama i tkivima, kao što su amplifikacija gena ili brisanja, transkripcijski regulaciju ili regulacija, post-transkripcijski obradu i Mirna degradacija [4-7]. Poznato je da su neki intragenetskom miR
gene, kao što su Mir-218-2 Netlogu, koordinirano prepisuju sa svojim domaćinima genima kroz mehanizme suradnje regulacije [8]. Međutim, mnogi Mir pregled, geni su extragenic i određeni udio intragenetskom Mir
gene kao Mir-9-1 pregled prepisuju u genskoj neovisan uzorak domaćina [9]. Budući da je točan promotorska regija većine Mir pregled gena ne karakterizira, posebno s obzirom na extragenic Mir pregled gena, točan regulatorni mehanizmi Mir pregled transkripcije su daleko od jasne. Pregled metilacije ili Hipermetilacija od CpG otoka u regiji transkripcije počinje stranicama (TSS) općenito se priznaju za represiju transkripciju gena epigenetically. Za razliku od gena za kodiranje proteina koji mogu obuhvaćati više CpG otoke, Mir
geni mogu biti kraći od otoka CpG, te u nekim slučajevima, multiple miR
gena (tj Mir pregled gen klastera) može biti nalazi unutar ili uz bok jedan otok CpG (Dodatne datoteke 1: Tablica S1). Netipična metilacije CpG otoka povezanih s Mir
gene, kao što je neka-7a-3 Netlogu i Mir-34A Netlogu, često se promatra u mnogim raka [10, 11]. On je predložio da metilacije CpG otoka koji su povezani s MIR pregled gena (tj Mir-203 pregled, Mir-152 pregled, Mir-124-1 pregled, Mir-34b /c
mir-129-2 pregled, mir-9-1 pregled, mir-130b pregled, mir-124-2 pregled i mir-181C pregled) možda obrnuto korelira s njihovim razina ekspresije [12-17]. Međutim, da li ili ne transkripcija Mir pregled gena redovito utječe status metilacije Mir
CpG otoke nije sustavno proučavana.
To je dobro poznato da je nenormalan metilacije ili metilne skupine iz CpG otoka u malom udio (< 1%), od populacije stanica mogu biti osjetljivije u uzorcima staničnim heterozigotnih tkiva. To pokazuje prednost metilacije analizi, preinaka genske ekspresije na RNA i proteina koji se mogu otkriti samo kad je prisutan u velikom broju stanične populacije u uzorku [18] takva promjena. Naš bioinformatika analiza pokazuje 50, 9 i 70 od 721 ljudskih Mir pregled gena u miRbase (Release 14.0) se nalaze, odnosno, u roku, uz bok, au blizini CpG otocima (kolektivno ćemo se odnosi na to kako je Mir Netlogu CpG otoci, dodatne datotečne 1: Tablica S1). Pretpostavljamo da se može dogoditi nenormalna metilacije Mir pregled CpG otocima tijekom razvoja i napredovanja raka. Zbog toga bi se mogli koristiti kao gena kandidata, ne samo za predviđanje prognozu raka, ali i za istragu o metilacije-ekspresije udruge in vivo pregled. Dakle, CPG otoci 9 Mir pregled gena povezanih s bolešću, uključujući 5 extragenic Mir pregled gena ili genskih nakupina (Mir-9-3
, Mir-137 pregled, Mir-200b /200A /429 pregled, mir-203 pregled i mir-375 pregled) i 4 intragenetskom gena ili genskih klastera (mir-9-1
, mir-34b /c pregled, mir-193.b /365 -1 pregled i mir-210 pregled), odabrano je kao predstavnik gena u ovom istraživanju (dodatne datotečne 1: Tablica S1). Metilacija-izraz udruga za 3. ovih Mir pregled gena prije nije uspostavljena (Dodatni datoteke 1: Tablica S2) [12, 14, 19-27]. U početku smo prikazivali za želučane karcinoma (GC) - ili domaćin vezane nenormalna miR
metilacije, a potom je istraživao metilacije-izraz udrugu in vitro pregled i in vivo pregled. Udruge između kliničkopatološkim obilježja GC pacijenata i metilacije ovih Mir
također su analizirani CpG otoci
Metode pregled izvora stanična linija i stanična kultura pregled Izvor informacija korištenih staničnih linija koje su korištene u ovom istraživanju. RKO stanica linije, pod uvjetom da je dr Guoren Deng na University of California u San Franciscu; SW480 i HCT 116 su od Dr. Yuanjia Chen na Medical College Hospital u Pekingu unije; MKN74 i 293 T pruža Tokyo medicinske i Sveučilište Dental; PC-3 kupljen je od strane stanične linije banke pri Kineskoj akademiji medicinskih znanosti; HL60 i KG1A dobiveni su iz Odjela za hematologiju Peking University Prva bolnica; DU145 je dobiven od Hanmi farmacije Društva; SIHA dao je Peking sveučilišnih Narodnoj bolnici. HepG2 je od Dr. Qingyun Zhang, Calu3 i A549 dr Zhiqian Zhang, H1299 i AGS dr Chengchao shou, MKN45 dr Youyong LV, i druge stanične linije (SGC7901, BGC823, MGC803, HeLa i GES-1) Dr. Yang Ke, sve u Pekingu University Cancer Hospital /Institute. Ove stanične linije su kultivirane na 37 ° C u 5% CO 2, pomoću različitih medija za kultiviranje. MKN45, MKN74, SGC7901, BGC823, MGC803, HL60, KG1A, 549, H1299, GES-1 HepG2, 293 T, DU145 i RKO su uzgajane u 90% RPMI-1640 i 10% FBS. PC-3 i AGS uzgojene su u 90% F-12 i 10% FBS. Calu3, HeLa i SiHa uzgojene su u 90% DMEM i 10% FBS. SW480 i HCT 116 uzgojene su u 90% DMEM: RPMI-1640 (1: 1). I 10% FBS
Pacijenti i uzorci tkiva
Kirurški uzorci primarni GC i njihove upareni nekanceroznog kirurški margin (SM) uzoraka bila prikupljeni od 112 bolničkih (prosječne dobi 59.2 godina [raspon, 32-79]; 80 muškaraca i 32 žena, 78 ne-srčana GCS i 34 srčane GCS 40 GCS u pTNM fazi sam ~ II i 59 u fazi III ~ IV) u Peking University Cancer Hospital. Follow-up podataka za sve bolesnike se prikupi najmanje pet godina. Svi kliničkih uzoraka, kao i patohistološko i obradili informacije za svaki pojedini slučaj dobiveni su u skladu s odobrenim institucionalnih smjernica. Želučani biopsije iz 13 zdravih ispitanika i 38 gastritisa ambulantno prikupljenih iz iste bolnice su korišteni kao ne-raka kontrole bolesnika. Prije bisulfita modifikacije svakog pacijenta želuca genomska DNA uzorak je analiziran na prisustvo H. pylori
specifičnih 23. S rDNA
prema testu PCR kao što je prethodno opisano [28]. The Institutional Review odbori Peking University Cancer Hospital i Instituta odobrila studiju (É1041207), a svi pacijenti dali pismeni informirani pristanak.
Ekstrakciju DNK i bisulfita modifikaciju pregled raka stanične linije i uzorci tkiva genomska DNA (1.8 ug) se izolira ekstrakcijom pomoću fenol /kloroforma [29]. Je nemetilirani citozin ostaci u uzorcima DNA se prevedu uracil ostataka (postaju timidin ostataka u PCR proizvoda) dodavanjem 5 M natrij bisulfita [30]. Kit Wizard® DNA Clean-Up sustav (Promega) se koristi za pročišćavanje DNK bisulfita tretirana prije PCR amplifikaciju. Pregled PCR amplifikacija i kvantifikacija Mir
CpG otok metilacije by DHPLC
CpG bez univerzalni temeljni premaz setovi su korišteni za pojačavanje miR
CpG otoke hot-start PCR polimeraze (Dodatni datoteke 1: Slika S1 i dodatne datotečne 1: Tablica S3). Sekvence CpG otoka ugrađenih ili na obje te povezane Mir pregled gena su korišteni za izradu primere. PCR produkti su zatim analizirane kvantitativno DHPLC na WAVE® fragment DNA analize sustava [31]. Ispiranje profili Mir-9-3 Netlogu, Mir-200B Netlogu i Mir-203
metilacije je analizirana s ultraljubičastim detektorom; druge MIR pregled gen metilacije je detektirano post stupcu HSX-3500 Pribor (Transgenomic, Inc., Omaha, SAD) i visoke osjetljivosti fluorescencije (FL) detektor (ekscitacija na 450 nm, emisija na 520 nm) [32 ]. Metiliran i unmethylated Mir pregled gena PCR produkti su odvojeni DNASep® analitički stupac (Transgenomic) na odgovarajući djelomičnom temperature denaturacije (dodatne datotečne 1: Tablica S3 i slici S2-10). Površine pikova odgovaraju metiliranih i nemetiliranih PCR proizvoda su korišteni za izračunavanje postotka metiliranom MIR
otok CpG [udjela metilnog kopija = metilacija-masa /ukupna površina pika] kako je ranije opisano [33]. M.SssI- pregled metilirani genomska DNA iz uzoraka krvi je korišten kao pozitivna kontrola. Slika 1 DHPLC kromatogrami i bisulfita sekvencioniranje 7 miR CpG otoka u predstavničkim staničnim linijama i uzorcima želučane tkiva. I ljudski DNA periferne krvi (u krvi) i njegova M.Sss pregled I-metiliranih produkata (M.BLOOD) su korišteni kao kontrola. Svi CpG mjesta u produkta amplifikacije svakog Mir
otok CpG su gore navedene rezultate bisulfita sekvenciranje. Svaki redak predstavlja jedan klon; svaka ružičasta traka predstavlja metilirani CpG stranice. Odgovarajuća kromatograma svakog nanizani uzorka (desni stupac) prikazana (lijevi stupac).
Bisulfita klon-sekvenciranje pregled Fresh PCR produkti Mir
CpG otoke pojačani s CpG slobodnih univerzalnih primer setovi su klonirane s pGEM-T Easy kit (Promega, Madison, SAD) i sekvenciran s Biosystcms 3730xl DNA Analyzer na SinoGeneMox Company (Peking, Kina).
ekstrakcija RNA i otkrivanje zrele Mirna razini s kvantitativnim RT-PCR testovima
Ukupno 50 ng RNA se ekstrahira iz svježih uzoraka tkiva ili stanične linije pomoću trizolne reagens (Life Technologies, Carlsbad, USA) prema protokolu proizvođača. Odgovarajući cDNA uzorci su sintetizirani korištenjem TaqMan® mikrornk reverzne transkripcije Kit (Life Technologies) sa Mir
specifičnih matičnih petlje inverzni transkripciju (RT) klice (specifično za Mir-375 pregled # RT000564, Mir-34b
# RT000427, mir-137 pregled # RT000593 i mir-9 pregled # RT000583). RT uvjeti korišteni su 16 ° C kroz 30 min ➔ 42 ° C tijekom 30 min ➔ 85 ° C tijekom 5 minuta. Razine Mirna su potom analizirani pomoću TaqMan Gene Expression Master Mix kita (Life Technologies) s odgovarajućom sondom i klicama (Life Technologies, Mir-375 pregled # TM000564, Mir-34b pregled # TM000427, Mir-137
# TM000593 i mir-9 pregled # TM000583). U6 pregled (Life Technologies, # RT001093 i # TM001093) je korišten kao interni standard. PCR uvjeti su bili biciklističke 95 ° C tijekom 10 minuta ➔ slijedi 40 ciklusa 95 ° C 20 sekundi ➔ 60 ° C 1 min. Razina ekspresije Mir-200B
i miR-210
određene su pomoću standardnog polyA RT-PCR. Sekvence adaptera primer RT, univerzalne inverznom primer i U6 pregled početnica u regularnom polyA RT-PCR analizi prikazani su u dodatne datoteke 1: Tablica S5. RT uvjeti su bili 55 ° C kroz 5 minuta ➔ zatim 25 ° C tijekom 10 min ➔ 42 ° C kroz 1 sat ➔ i 70 ° C tijekom 5 minuta. PCR biciklističke uvjeti bili su 95 ° C for10min ➔ slijedi 40 ciklusa od 95 ° C tijekom 20 sekundi ➔ i 61 ° C tijekom 1 min. Pregled, Statistička analiza pregled SPSS 16,0 Trend pregled -test i Pearsonov Chi- kvadrat test se koristi za analizu Mir pregled metilacije frekvencije razliku između normalne biopsijama, gastritis lezije, GC i SM uzoraka. Kruskal-Wallis H
-test i jednosmjerna ANOVA analize Mir pregled metilacije omjeru razlike između normalne biopsijama, gastritis lezije, GC, i uzoraka SM. Fisherov egzaktni test, Pearsonov hi-kvadrat test, a trend pregled -test su se analizirati povezanost između miR
metilaciju pozitivne stope i kliničkopatološka značajke. Mann-Whitney U-test
i Studentov t-test pregled, korišteni su analizirati povezanost između udjela metiliranih Mir pregled alela i kliničkopatološkim značajke. Kaplan-Meier i Cox-proporcionalnih rizika metode su korištene za univarijantne i multivarijatne analize usporediti ukupno preživljenje GC bolesnika s razlikama u statusu metilacije Mir pregled CpG otoke. Svi statistički testovi bili obostrani, a P izvoznici < 0,05 smatrana je statistički značajna. | Rezultati
Karakterizacija metilacije ili metilne skupine iz 6. Mir
CpG otoke koji se odnose na razvoj GCS pregled smo pojačan bisulfita liječenih predložaka 9 reprezentativnih miR
CpG otocima s CpG besplatno primeri i razvili 9 DHPLC analize da se analizira stanje metilacije CpG otoka u fragmente 4 intragenetskom Mir pregled gena (Mir-9-1
, Mir-34b
, Mir-193.b pregled, Mir-210 pregled) i 5 extragenic Mir pregled geni (Mir-9-3 pregled, Mir-137 pregled, Mir-200b pregled, Mir-203 pregled i mir-375 pregled), odnosno (Slika 1, Dodatna file 1: Tablica S3 i dodatni file 1: Slika S1-S10). Ove DHPLC testovi pokazali da je metilacije pozitivna stopa od 5 MIR
CpG otoci (Mir-9-1 pregled, Mir-9-3 pregled, Mir-34b pregled, Mir-137 pregled, i miR-210 pregled) bio je značajno povećan istodobno s ozbiljnosti patoloških promjena u želucu. Ova otkrića snažno sugeriraju da metilacije to miR
CpG otoka je povezan s razvojem GCS (trend pregled -test, Mir-9-1 Netlogu, P < pregled, 0.001, Mir-9- 3. pregled, P < pregled, 0.001; mir-34B Netlogu, P = 0,008 pregled, mir-137 pregled, P < pregled, 0.001, mir-210 pregled, P pregled = 0,001; Tablica 1). Mir-9-1 pregled metilacije otkriven je u 18 od 28 GCS (osjetljivost, 64%), ali samo u 2 od 48 normalna ili gastritis biopsija pokazala metilacije (specifičnost, 96%). Iako je detektiran metiliranje miR-200B
u skoro svim uzorcima tkiva želuca, udio metiliranom miR-200B
u normalnim ili gastritisa tkiva (46% -100%) bio je značajno veći nego u oba SM i GC uzorci (41% ~ 47%) (Mann-Whitney U-pregled, test, gastritis biopsije odnosu SMS-a, P = 0,001 pregled Tablica 1). To upućuje na zaključak da je Mir-200b pregled metilne skupine bio je GC, pacijent-specifični događaj. Bisulfit sekvencioniranje tih Mir
CpG otoci potvrdili podatke dobivene od DHPLC analize (Slika 1) .table 1 Metilacija status miR CpG otoka uzoraka želuca sluznice s različitim patološkim promjenama u GC i non-kancerogen bolesnika u kontrolnoj
MIR pregled CpG otoci
skupina uzoraka želuca
Mir
metiliranjem
pozitivnu stopu
Udio (%) od mctiliranog MIR
u Mir pregled metilacije-pozitivnih uzoraka pregled pregled pozitivnu stopu (%)
χ pregled 2 pregled,-vrijednost
Trend pregled -test (P pregled-vrijednost)
Medijan pregled [25% ~ 75%]
Srednja pregled ± SD
t /F /χ pregled 2 pregled,-vrijednost
P pregled-vrijednost
mir-9-1
Normalan pregled 1/13 (7,7)
27,598 izvoznici < 0.001 pregled NA
NA pregled Gastritis pregled 1/35 (2,9)
NA
SM
9/28 (32,1)
17 [13-30]
20 ± 4 pregled t pregled = -3,039 pregled 0.005 g pregled GC pregled 18/28 (64,3)
29 [19-40] pregled, 32 ± 4 pregled, mir-9-3
Normalan pregled 6/13 (46.2) pregled 23,389 izvoznici < 0.001 pregled 38 [31-59] pregled, 43 ± 6 pregled F pregled = 1.639
0.189 h
Gastritis pregled 15/37 (40,5)
43 [36-48]
42 ± 2
SM pregled 26/28 (92,9)
38 [26-44]
36 ± 2 pregled, GC pregled 26/28 (92,9)
37 [26-43]
36 ± 2
Mir-137
Normalan pregled 5/13 (38,5) pregled 18,626 izvoznici < 0.001 pregled 10 [4-41] pregled χ pregled 2
= 8,065 pregled 0.045 d pregled Gastritis pregled 24/38 (63,2)
19 [7-36] pregled SM
25/26 (96,4)
15 [7-40]
21 ± 3g pregled GC pregled 24/26 (92.3) pregled 36 [20-51]
37 ± 4 pregled, mir-34b
pregled Normalno pregled 6/13 (46.2) pregled 6,947 pregled 0,008 pregled 13 [7-19] pregled χ pregled 2
= 0,658 pregled 0,883 d pregled Gastritis pregled 13/36 (36.1)
11 [3-20] pregled SM
22/28 (78,6)
11 [4-18]
GC
19/28 (67.9)
10 [5-32]
Mir-200b
Normalno
13/13 (100) pregled 0,486 pregled 0.922 f
54 [52-83] pregled χ pregled 2
= 17,883 izvoznici < 0.001 d pregled gastritis pregled, 35/36 (97,2) pregled 52 [46-100] e
SM pregled 27/28 (96,4)
44 [40-47] pregled GC pregled 27/28 (96,4)
48 [40-53]
Mir-210
pregled Normal Netlogu 2/13 (15,4)
11.908
0,001 pregled NA
NA pregled gastritis pregled, 13/38 (34,2) pregled, 7 [ ,,,0],5-10] pregled SM
22/27 (81,5)
11 [5-22] pregled GC pregled 16/27 (59,3) pregled, 9 [4-16]
mir-193.b
Normalan pregled 0/13 pregled 7.045
0,008 b pregled NA
NA pregled Gastritis pregled 2/37 (5,4) pregled NA
SM
7/28 (25,0)
5 [4-14] pregled GC pregled 4/28 (14,3) pregled 5 [2-12] pregled miR- 203
Normalan pregled 5/13 (38,5) pregled 5,617 pregled 0,018 b pregled 32 [29-75] pregled χ pregled 2 pregled = 2,957
0,398 d pregled Gastritis pregled 20/38 (52.6)
31 [26-36] pregled SM
21/28 (75,0)
34 [30-36] pregled GC pregled 11/28 (39.3) c pregled 32 [29-35] pregled, mir-375
Normalan pregled 0/13 pregled 12.266 Netlogu < 0.001 b pregled NA pregled NA pregled Gastritis pregled 13/38 (34,2) pregled 3 [3-4] e pregled SM
16/28 (57,1) pregled, 7 [4 -14] pregled GC
8/28 (28.6) c pregled 17 [8-21]
je, trend pregled, ispitivanje, među Normalno, gastritis, SM i uzoraka GC; b, Trend pregled -test, među Normalno, gastritis i uzoraka SM; c, Pearsonov hi-kvadrat test, GC odnosu SM: Mir-203 pregled, χ pregled 2 pregled, = 7,292, P = 0,007 pregled; Mir-375 pregled, χ pregled 2 pregled, = 4,667, P = 0,031 pregled; d, Kruskal-Wallis H
-test; e, Mann-Whitney U-test
: gastritis odnosu na SM, Mir-200B Netlogu, U pregled = 230.000, P = 0,001 pregled; Gastritis odnosu na GC, Mir-375 pregled, U pregled = 46,000, p = 0,011 pregled; SM odnosu na GC, Mir-137 pregled, U pregled = 170.000, P pregled = 0,009; f, Pearsonov hi-kvadrat test, među Normalno, gastritis, SM i GC uzoraka; g. U paru t pregled -test: SM odnosu na GC, Mir-137
, t
= -2.652, p = 0,014 pregled; h. Jednosmjerna ANOVA; NA, nije dostupan.
Osim Mir-9-1 Netlogu i Mir-137
, a metilacije pozitivne stope ili proporcije mctiliranog Mir-9-3 Netlogu, Mir-34b pregled, Mir-210
i Mir-200b pregled u GCS bile su slične onima u SMS (tablica 1). Kako bismo utvrdili da metilacije nekih od tih Mir pregled gena je unipolarni događa istovremeno u oba kancerogenih i ne-kancerogen tkiva u želucu zbog istog izloženosti čimbenicima okoliša, otkrio je podatke metilaciju u drugoj podskupini GC i SM uzoraka iz 84 pacijenata, te je utvrdio da je pozitivna stopa i udio mctiliranog mir-9-1 Netlogu u GCS je još uvijek znatno veći nego u SMS-a (60,7% u odnosu na 32,1%; Pearsonov hi-kvadrat test, P =
0,001; Prijavite rank test p izvoznici &0,001; Dodatne datoteke 1: Tablica S4, Podskup-2). Prosječna udio mctiliranog Mir-137 Netlogu bio je značajno viši u GCS od SMS (Srednja pregled ± SD pregled, 26 ± 2 u odnosu na 38 ± 2, u paru t
test, P < pregled 0.001). Kao što se očekivalo značajnu razliku u pozitivnom stopom ili udjela mctiliranog Mir-9-3, Mir-34b pregled, Mir-210 pregled i Mir-200b pregled nije uočena između GC i uzoraka SM. Ovi rezultati potvrđuju da je Mir-9-1 pregled i Mir-137 pregled metilacije bio događaj tumor specifične i da Mir-9-3 pregled, Mir-34b pregled i Mir-210
metilacije, kao Mir-200b pregled metilne skupine, bio je s efektom polja koja se dogodila tijekom želučane karcinogeneze.
Nadalje, pozitivno stopa mctiliranog Mir-203 Netlogu i Mir-375
postupno povećava od normalne do gastritisa do uzoraka SM, ali je značajno smanjen u usporedbi s GCS SMS (Pearsonov Hi-kvadrat test, mir-203 pregled, P = 0,007 pregled, mir-375 pregled, P = 0,031 pregled Tablica 1). U podskupini-2 uzorka, mi također analizirali Mir-375 pregled metilacija i našao više Mir-375
metilacije u SMS nego u GCS ponovno (Pearsonov Hi-kvadrat test, P = 0,034 pregled, Dodatni datoteka 1 Tablica S4). Ovi podaci upućuju na to da Mir-375 pregled (a Mir-203 pregled) metilacije nije GC-specifičan i može biti jedna vrsta adaptacije domaćina u ne-maligne tkivima u razvoju GCS.
MIR
metilacije i H. pylori infekcije pregled, pregled bi se utvrdilo da li H. pylori pregled infekcija igra ulogu u miR pregled metilacije, tražili smo H. pylori
specifičnih 23. s rDNA
u želučanim genomske DNA uzorke PCR-om i utvrdili da je H. pylori pregled pozitivnih stopa istodobno porasla s težinom patoloških promjena [15,4% (2 od 13) normalnih želučanih biopsija, 52,6% (20 od 38) gastritis lezije, te 69,0% (29 od 42) SM biopsija; trend pregled -test, P = 0,001 pregled] i smanjen je u uzorcima GC (18 od 42 = 42,9%; GCS u odnosu na SMS, Pearson Chi-kvadrat test, P pregled = 0,016; Dodatni file 1: Slika S11 ). H. pylori
pozitivnih gastritis /normalna i SM uzorci su pokazali značajno veću metilacije Mir-210 pregled metilacije od H. pylori pregled -negativno uzoraka (P pregled = 0,036 i 0,022, odnosno, Slika 2A i B). Slika 2. Usporedba Mir metilacije u različitim uzorcima želučane sluznice sa i bez postojanja H. pylori. (A) Normalno ili gastritis biopsije iz kontrolnih ambulantno, bez maligne bolesti; (B i C) Kirurški margine i tumorskih uzoraka bolesnika s želučanim karcinoma, respektivno; H. pylori specifična 23 S rDNA pregled je otkriven pomoću PCR.
Obrnuti odnos između Mir pregled metilacije CpG otoka i njihovih odgovarajućih razina ekspresije
Ispitati odnos između gornje abcrantnog Mir Netlogu metilacije i transkripcija odgovarajućeg Mir pregled gena, kvantificirati smo zrele razine Mirna Mir-9-1 Netlogu, Mir-9-3 pregled, Mir-34b pregled, Mir-137
miR-210 pregled, miR-200b pregled, (a-miR 375 pregled), čije metilaciju stanje je povezano s razvojem GC (i GC domaćin prilagodbe) kako je gore opisano, u nizu ljudske stanične linije s različitim metilacije status Mir
CpG otoke. Metilacija status svake Mir
CpG otok u tim staničnim linijama je određena DHPLC kao što je prikazano u dodatne datoteke 1: Slika S2-S10. Rezultati kvantitativne RT-PCR analiza pokazala je da je u ispitanim staničnim linijama koje sadrže metilira Mir pregled alela zrele razine Mirna svih 6 Mir pregled geni GC-vezana i jedna domaćina adaptaciji Mir pregled gena bile znatno niže od onih otkrivena u staničnim linijama koje sadrže unmethylated Mir pregled alela (slika 3A-G). Slika 3 Odnos između razine ekspresije i metilacije status Mir gena u ljudskim staničnim linijama i uzorcima želučane tkiva. (A-G) Korelacija analiza između metilacije udjelu Mirna CpG otoka i njihove zrele razine Mirna ekspresije u ciljnom CpG otoku metilni i unmethylated ljudskim staničnim linijama; (H-P) Izražavanje miRNAs u 20 uparenih, svježih uzoraka karcinoma želuca; (U) Ciljna CpG otok stanične linije unmethylated; (M) Cilj CpG otok metilira stanične linije; (U /M) Cilj CpG otok djelomično metilni stanične linije. Pregled smo dalje analizirali razinu Mirna od 20 pari svježe GC i uzoraka SM i zaključili višu razinu ekspresije Mirne-200B, pregled Mirna-375, i Mirna-210 u SMS nego u GCS (parni t pregled -test: Ps
≤0.030; Dodatni file 1: Slika S12). Razine Mirna-137 u SMS također su bili veći od onih u GCS, ali nije bila statistički značajna (P = 0,059 pregled). Razina ekspresije Mirne-9 i Mirna-34B bili su slični SMS i GCS. Ono što je najvažnije, inverzni odnos između Mir pregled metilacije i odgovarajuća razina ekspresije zabilježena je za Mir-9-1 Netlogu, Mir-9-3 Netlogu, Mir-137 pregled i Mir-200b
u tim uzorcima želučane tkiva (Spearmanov mjesto korelacijska analiza, mir-9-1
, r pregled a pregled = -0,533, P = 0,001 pregled, mir-9-3
r pregled a pregled = -0,464, P = 0,004 pregled, mir-137 pregled, r pregled a pregled = -0,378, P =
0,019, mir-200b pregled, r pregled a pregled = -0,409, P = 0,010 pregled Slika 3H-K). Slaba inverzni metilacije-izražavanje odnos Također je utvrđeno za Mir-375 Netlogu u tim uzorcima tkiva (r pregled a pregled = 0,287, P = 0,085 pregled Slika 3O). Takav odnos nije uočeno je za Mir-34B Netlogu i Mir-210 Netlogu (Slika 3L, N).
Mir pregled metilacije korelaciji s kliničkopatološkim karakteristikama bolesnika GC
bi proučiti mogućnost pomoću miR
metilacije kao prognozu prediktor GCS, utvrdili smo prevalenciju metilacije 7 Mir pregled gena i analiziraju odnos između kliničkopatološkim obilježja GC i odgovarajućih razina metilacije od ovih Mir
CpG otoke proučeni features

miR-9-1
methylation

miR-9-3
methylation

miR-137
methylation

miR-34b
methylation

miR-200b
methylation

miR-375
methylation

miR-210
methylation

Positive pylori
infekcije.

• Prisutnost upalnih stanica S100A9-pozitivne u tkivu raka korelira s rani stadij raka i bolju prognozu u bolesnika s karcinomom želuca
• Jeste prijenos Helicobacter pylori kod ljudi izazvati izbijanje bolesti u koloniju prugom lica Dunnarts (Sminthopsis macroura)?