Epigenetikai mechanizmusok tanulmányozása eltérés MDR1mRNA kifejezés között gyomor- és vastagbélrák sejtvonalak és magyarázattal klinikai kemoterápia

Epigenetikai mechanizmusok tanulmányozása eltérés MDR1 katalógusa mRNS expressziója között gyomor- és vastagbélrák sejtvonalak és magyarázattal klinikai kemoterápia katalógusa Abstract katalógusa Háttér katalógusa A membrán transzporterek, mint például a P-glikoprotein (Pgp), a MDR1
gén terméke, az egyik oka a kezelés sikertelensége a rákos betegeknél. Ebben a vizsgálatban, a epigenetikai mechanizmusok részt eltérés MDR1
mRNS expressziós összehasonlították a 10 gyomor- és 9 vastagbélrák sejtvonalak.
Módszerek
az MDR1
mRNS szintek meghatározása PCR és valós idejű PCR vizsgálatokat reverz transzkripciót követően. A citotoxicitást végeztük az MTT assay. Metilációs státusának feltártuk által számszerűsítése PCR-alapú metiláció és biszulfit DNS-szekvenálással elemzéseket.
Eredmények
az MDR1
mRNS szinteket nyert 35 cikluson RT-PCR a gyomorrák-sejtek voltak csak hasonló kapott 22 ciklus RT-PCR vastagbélrákos sejtekben. Real-time RT-PCR analízis kimutatta, hogy az MDR1
mRNS-t nem lehetett kimutatni a 10 gyomor rákos sejtvonalak, de változó MDR1
mRNS-szintje a 7. 9 vastagbél rákos sejtvonalak, kivéve a SNU-C5 és HT-29 sejtek . MTT esszé azt mutatta, hogy a Pgp inhibitorok, mint például a ciklosporin A, a verapamil és PSC833 érzékenyített Colo320HSR (vastagbél, legmagasabb MDR1
kifejezés), de nem SNU-668 (gyomor, legmagasabb) és SNU-C5 (gyomor, nem kifejezés) a paclitaxel. Számszerűsítése PCR-alapú metilációs elemzés kimutatta, hogy 90% -a gyomor rákos sejtek, és 33% a vastagbélrák sejtek metilezett, amely teljesen illeszkedik a kapott eredmények biszulfit-DNS-szekvenáló analízis. 5-aza-2'-deoxcytidine (5AC, DNS metiltranszferáz inhibitorok) növelte az MDR1
mRNS-szintje a 60% -a gyomor sejtek és 11% a vastagbél rákos sejteket. Trichostatin A (TSA, hiszton-dezacetiláz inhibitor) növelte az MDR1
mRNS-szintje a 70% -a gyomor rákos sejteket, és 55% a vastagbél rákos sejteket. A kombinált kezelés az 5AC TSA növelte az MDR1
mRNS szintek additívan 20% gyomorrák-sejtek, de szinergikusan 40% gyomor- és 11% a vastagbél rákos sejteket.
Következtetés
Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az MDR1
mRNS szintek gyomor rákos sejtekben lényegesen alacsonyabb, mint a vastagbél rákos sejteket, amely legalább részben a különböző epigenetikus szabályozások, mint például a DNS-metilációs és /vagy a hiszton-dezacetilezés. Ezek az eredmények, hogy jobban megértsük a hatékonyságát kombinált kemoterápia, valamint ezek orális biológiai hozzáférhetősége.
Alapon
Gyomor- és kolorektális rákos megbetegedések oka a morbiditás és a mortalitás a mai világban. Ha a gyógyító sebészi eltávolítás nem lehetséges, ezek a rákok nagyon gyengén reagálnak a kemoterápiára és így a rossz prognózist. A gyomor rákos betegek, az 5-fluorouracil (5-FU) alapú kombinációs kemoterápia nem tett kísérletet annak érdekében, hogy javítsák a kezelési eredmények [1]. Colorectalis rák, az 5-FU volt a legszélesebb körben használt drog több mint 40 éve. Azonban más szerek, mint például irinotekán vagy oxaliplatin volna használni, hogy javítsa a tumorellenes hatékonyság kombinációban 5-FU [2]. Az 5-FU zavarja a DNS-szintézis blokkolásával a termelés pirimidin nukleotid dTMP dump során de novo
DNS szintézis gátlása révén timidilát-szintáz, valamint beépítése révén fluor-nukleotidok a DNS-t és RNS-t [3].
P-glikoprotein (Pgp) által kódolt multidrog rezisztencia 1 (MDR1
) gén egy reprezentatív membrán efflux pumpa az ATP-kötő kazetta (ABC) transzporterek [4-6]. Pgp funkciók például az energia-függő efflux pumpák különféle szerkezetileg különböző kemoterápiás szerek, mint a doxorubicin, a vinkrisztin, vinblasztin, paklitaxel, colhicine, aktinomicin D és mitomicin-C [7], amely csökkenti az intracelluláris szintjét gyógyszer akkumulációjához. Ennek eredményeként fokozott expressziója ezeknek a fehérjéknek ruházza MDR hogy a rákos sejtek által megkerülése citotoxikus hatásait gyógyszerek. Az emberi vastagbél, Pgp erősen expresszálódik az apikális felszínen a felületi oszlopos hámsejtjeiben az ileum és a vastagbél, és annak expressziós szint fokozatosan csökken proximálisan a jejunum, duodenum és a gyomor [8]. Szabályozása transzkripciós aktivitását az MDR1 katalógusa gén függ számos transz-ható fehérjék, amelyek kötődnek a konszenzus cisz-elemeket [9]. A hozzáférhetőség a promoter elemek azok kötő faktorok szabályozzák szintjén kromatin szerelvény. A szintek mindkét DNS metiláció és hiszton deacetiláció szabályozzák MDR1 katalógusa génexpresszió [10-12]. Eddig a transzkripciós szabályozása MDR1 katalógusa génexpresszió révén epigenetikai mechanizmusok számoltak be expresszió vastagbél rákos sejtek [13-16], de egyik sem a gyomor rákos sejtekben. Továbbá, a kapcsolatot a transzkripciós expresszióját MDR1 katalógusa génexpresszió és epigenetikai mechanizmusok gyomor- és vastagbél rákos sejtek nem hasonlították össze. Ezért nem világos, miért kemoterápiás protokollok kerültek másképp kezelésére használják gyomor- és colorectalis rák, és miért MDR1
mRNS expresszálódik differenciálisán gyomor- és colorectalis rák sejtek. Ezért ez a tanulmány vizsgálta-e vagy sem a mértéke metilezése promoter helyén a MDR1 katalógusa gén szorosan kapcsolódik a MDR1
génexpresszió mind a rákos sejtekben.
Methods
Sejtkultúra
A 10 humán gyomor rákos sejtvonalat (SNU-1, -5, -16, -216, -484, -601, -620, -638, -668 és -719), és a 9. vastagbélrák sejtvonalak (SNU-C1, C4, -C5, Colo320HSR, LoVo, DLD-1, HT-29, HCT-8 és HCT-116) nyertük ki a Cancer Research Center a szöuli Nemzeti Egyetem (Dél-Korea). Az összes sejtet 37 ° C-on, 5% CO 2 atmoszférában, RPMI 1640 tápközegben (GibcoBRL, Gland Island, NY, USA), amely 10% hővel inaktivált borjúembrió-szérumot (Sigma, ST. Louis, MO, USA). A sejteket tartottunk fenn akár szuszpenzió vagy egy egyrétegű kultúra, és átoltjuk, amíg elérték összefolyása.
Reverz transzkripciós polimeráz-láncreakció (RT-PCR) vizsgálati
A teljes RNS-t extraháltunk MagExtractor ® for az MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japán) Auto-nukleinsav tisztító rendszer, a gyártó utasításai szerint. Az MDR1
és a β-aktin
mRNS alkalmazásával detektáltuk az RT-PCR vizsgálati eljárásban. MDR1
expresszió kimutatható volt az 5 'és 3' primerek megfelelő nukleotidok 907-930 (5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 ') és a 1179-1201 (5'-TGCCAAG-ACCTCTTCAGCTACTG-3'), illetőleg a publikált cDNS-szekvenciát [17], így kapunk egy 296 bp méretű PCR-terméket. β-aktin
mRNS expresszióját alkalmaztuk kontrollként az összeg RNS, és kimutatható volt az 5 'és 3' primerek nukleotidjainak felel meg 1912-1932 (5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 ') és a 2392-2412 ( 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3 '), illetve a közzétett cDNS-szekvencia [18], így kapunk egy 501 bp méretű PCR-terméket. Az RNS-t minden egyes mintából t reverz transzkripciónak 200 egység Moloney rágcsáló leukémia-vírus reverz transzkriptáz (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA), és 0,18 ug /ml oligo (dT 20) primer 1 órán át 37 ° C-on. Az így kapott cDNS-t, a gyomor rákos sejtek (2-szeres hígított cDNS a vastagbélrák sejtek) amplifikáltuk 1,25 egység Taq-polimeráz (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 mM MgCI 2 és 10 pmol mindegyik primerből egy thermal cycler (GeneAmp 2400 PE Applied Biosystems, Boston, MA, USA) 22 ciklus a vastagbél rákos sejteket, de 35 ciklus a gyomorrák sejtek MDR1
és 17 ciklust β-aktin
a szekvenciális denaturációs (94 ° C-on 30 s), hibridizálásból (65 ° C-on MDR1 katalógusa, 53 ° C-on β-aktin
), és kiterjesztés (72 ° C-on 30 s). Miután az utolsó ciklus, az összes PCR-termékeket vetettük alá egy végső extenziós 5 perc 72 ° C-on. A mennyiségi meghatározás céljából, 3 uCi [α- 32P] dCTP-t adtunk minden egyes reakcióelegyhez. Polimeráz-láncreakció után a PCR-termékeket egyesítjük, és azután elektroforetizáltuk 7,5% -os nem-denaturáló poliakrilamid gélen. A sávokat beolvasott denzitásmérővel (PDI, Huntington Station, NY, USA). Az egyes mRNS transzkriptum normalizáltuk azzal a minden egyes β-aktin
mRNS-t.
Fehérjeextrakció és Western-blot analízis
Teljes sejt lizátumokat készítünk lizálásával betakarított sejtek extrakciós pufferrel (1% NP-40 , 0,5% nátrium-dezoxikolát, 0,1% SDS, foszfáttal pufferolt sóoldatban), kiegészítve 2 mM fenil-metil-fluoridot (Sigma) és 10 ng /ml leupeptin (Sigma). DNS-t nyírt szonikálással és Western-blot analízist végeztünk egy kis mértékű módosítását módszer első Towbin et al. [19]. A fehérjéket átvittük nitrocellulóz membránra elektrolenyomatolással segítségével áram 60 V éjszakán át. A membránt inkubáltuk blokkoló oldatot (5% -os sovány tej) 1 órán át szobahőmérsékleten, mostuk, majd inkubáltuk primer kecske poliklonális antitesttel (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) Pgp. A membránt mostuk és inkubáltuk tormaperoxidázzal konjugált másodlagos antitesttel (1: 1000 hígítás) egymás ellen IgG hosts primer antitestekkel 1 órán át. A membránt ezután megfestjük a kimutatási reagens az ECL detektáló reagenskészlet (Amersham, Piscataway, NJ, USA).
Real-time PCR
kitermelése mRNS szerint végeztük az RNeasy proctocol (Qiagen, Hilden, Németország ). Egy mikrogramm össz-RNS-t reverz transzkripcióval cDNS-be egy 20 pl térfogatban 200 egység Moloney rágcsáló leukémia-vírus reverz transzkriptáz (Gibco-Bethesta Research Laboratory, Grand Island, NY, USA), és 0,18 ug /ml oligo (dT 20) primerek (Promega, Madison, USA) szerint a gyártó utasítás. Real-time PCR-t a fény Cycler 2.0 Eszköz (Roche, Mannheim, Németország) a Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit (Roche). Az ellenőrzés céljából a megfelelő amplifikációs termék, PCR-eket analizáltuk 2% -os agaróz gélen etídium-bromiddal festett. A szekvenciákat a primerek a következők: a β-aktin katalógusa, 5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3 'és 5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'; az MDR1
, 5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3 'és 5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'. Mindegyik reakció (20 ul) tartalmazott 4 ul cDNS-t (10-szeres hígítás), 4 mM MgCI 2, 10 pmol mindegyik primerből és 2 ul Fast Start DNA Master SYGR Green I Mix tartalmazó puffer, dNTP-k, SYBR zöld festék és Tag-polimeráz. Az amplifikációs eljárás a megcélzott gének a következő volt: pre-denaturáló 95 ° C-on 10 percig, 40 ciklus denaturálás 95 ° C-on 15 másodperc, lágyítás az MDR1
át 67 ° C-on (β-aktin katalógusa 55 ° C-on) 5 másodpercig, és kiterjesztés 72 ° C-on 7 sEC (β-aktin katalógusa 21 sec). Olvadási görbe analízist végeztünk, hogy erősítse meg a termelés egyetlen termék. A negatív kontrollok nélkül sablon gyártottak minden távon. Génexpresszió-értékek (relatív mRNS szintek) fejezzük arányok (különbség a Ct értékeket = A pont a görbén, ahol a mennyiségét fluoreszcencia emelkedni kezd gyorsan, általában néhány standard eltéréseket az alapvonal fölé, nevezzük a küszöb ciklus ( ct érték).) között a számunkra érdekes gén (MDR1
mRNS), és egy belső referencia gén (β-aktin
mRNS), amelyek egy normalizációs tényező a mennyisége izolált RNS egy mintában. Az adatok elemzése segítségével végeztük Fény Cycler szoftver 4.0 verzió (Roche).
Citotoxicitási teszt segítségével MTT assay
Az in vitro
citotoxicitását a kábítószer mértük MTT-vizsgálat alkalmazásával, amit a leírásban máshol [20]. A sejteket egy 2 × 10 4cells /ml és egy éjszakán át inkubáljuk, hogy lehetővé tegye a fel- és stabilizáció. A sejteket 37 ° C-on 3 napig, és MTT [3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazólium-bromid, Sigma] oldatot ezután hozzáadjuk az egyes lyukakhoz, amely tartalmazza a sejteket. Rázatás után 1 perc, a lemezt inkubáltuk 5 órán át. Formazánkristályok a szuszpenziós tenyészetben feloldunk 150 ul dimetil-szulfoxidban (DMSO) A felülúszó eltávolítása után. Az optikai sűrűséget a kutak mértük mikrolemez leolvasó (μQuant, Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) 540 nm-en.
Számszerűsítése PCR-alapú metilációs elemzés
Öt mikrogramm genomiális DNS-t -t emésztettünk 50 U Msp katalógusa I. vagy Hpa
II (Fermentas MBI, Vilnius, Litvánia) 37 ° C-on 16 órán át, hozzáadjuk egy 1/15 térfogatú 0,6 M Tris (pH = 7,5) és 1,5 M NaCI, és emésztettük 50 egység PstI katalógusa I (New England Biolabs, MA, USA) 37 ° C-on 8 órán át keverjük. A metilációs állapotát az MDR1 katalógusa 5'CpG promoter régió elemzésével vizsgálták 100 ng restrikciós enzimmel emésztett DNS-t PCR-rel 25

• Képalkotó értékelésekor a máj és a peritoneális áttétek gyomorrák: szisztematikus áttekintése
• Gyomorszonda behelyezése közvetlen látás a király Vision ™ video Gégetü: randomizált, prospektív klinikai trial