-Regulação de CLDN1 no câncer gástrico está correlacionada com a sobrevivência reduzida

-Regulação de CLDN1 no câncer gástrico está correlacionada com a sobrevivência reduzida da arte abstracta
Fundo
As alterações genéticas em adenocarcinoma gástrico são extremamente ainda não foram identificados complexos e confiáveis ​​marcadores tumorais. Há também notáveis ​​diferenças geográficas na distribuição desta doença. Nosso objetivo foi identificar os genes mais diferencialmente regulados em 20 adenocarcinomas gástricos de uma seleção norueguesa, em comparação com mucosa normal correspondido, e temos relacionado nossas conclusões ao prognóstico, sobrevivência e Helicobacter pylori
infecção crônica.
Métodos
as biópsias de adenocarcinoma gástrico e mucosa gástrica normal adjacente foram obtidas de 20 pacientes imediatamente após a ressecção cirúrgica do tumor. do genoma completo, a análise de cDNA microarray foi realizada em RNA isolado a partir dos pares de amostras para comparar os perfis de expressão de genes entre o tumor contra a mucosa correspondente. As amostras foram analisadas microscopicamente para classificar gastrite. A presença de H. pylori
foi examinada usando microscopia e imuno-histoquímica.
Resultados
130 genes mostraram regulação diferencial acima de um nível de corte predefinido. A interleucina-8 (IL-8
) e Claudina-1 (CLDN1
) foram os mais consistentemente genes regulados positivamente em tumores. Muito alta expressão CLDN1
no tumor foi identificado como um gene preditor independente e significativo da sobrevivência pós-operatória reduzida. Havia distintamente diferentes perfis de expressão entre o grupo de tumor eo grupo mucosa controle, e os subconjuntos histológicos de tipo misto, tipo difuso e câncer tipo intestinal demonstrou ainda mais sub-agrupamento. -Regulada genes foram mapeados para de adesão celular, processos relacionados com o colagénio e a angiogénese, ao passo que as funções intestinais normais, tais como digestão e a excreção foram associados com genes regulados para baixo. Nós relacionam os resultados atuais para o nosso estudo anterior sobre a resposta genética das células epiteliais gástricas a infecção por H. pylori
.
Conclusões
CLDN1
foi altamente regulada para cima no câncer gástrico, e CLDN1
expressão foi independentemente associada com um prognóstico pós-operatório pobres, e pode ter importante valor prognóstico. IL-8 Comprar e CLDN1
podem representar ligações centrais entre a resposta gene visto em H. pylori infecção aguda
das células epiteliais gástricas e câncer, em última análise gástrica.
Palavras-chave
O câncer gástrico interleucina 8 claudina-1 Helicobacter pylori
cDNA microarray Survival Prognosis fundo
câncer gástrico (CG) é apenas a segunda câncer de pulmão em mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, no entanto, existem grandes diferenças geográficas na distribuição de GC. Dados de 2010 demonstram que a incidência GC na Noruega é muito baixa (machos 6.9, as fêmeas 3,0 por 100.000 habitantes) [1] em comparação com áreas menos desenvolvidas, particularmente na Ásia Oriental, onde a incidência é de aproximadamente 6 vezes (homens 42,4, fêmeas 18.3 por 100.000 habitantes) [2].
adenocarcinoma gástrico é extremamente heterogênea geneticamente, citologia e com uma arquitetura em comparação com outros carcinomas gastrointestinais. A busca de marcadores tumorais confiáveis ​​e indicadores prognósticos consistentes tem sido difícil. Vários autores têm tentado prever doenças GC e prognóstico baseado em genes únicos ou múltiplos [3-8], mas há discrepâncias entre os estudos, e, atualmente, nenhuma assinatura gene ou biomarcadores estão em uso clínico de rotina. Compreender o cancro gástrico subjacente mecanismos é um dos principais desafios no campo da genômica do câncer. A classificação Lauren divide adenocarcinomas em três diferentes subtipos histológicos: tipos intestinal e difuso e uma variante mista [9], que são pensados ​​para assumir diferentes vias de carcinogênese. O tipo intestinal é atribuível a uma progressão de várias etapas de gastrite crônica através de atrofia gástrica, metaplasia, displasia e da doença, em última análise maligno [10]. tipos difusos podem surgir de inflamação crônica sem
uma manifestação clara de etapas pré-malignas intermediários [11-13]. O tipo misto mostra misturas não homogéneas de ambos arquitetura tipo intestinal e difuso, e pode representar uma categoria separada com câncer de mutações genéticas exclusivos e um curso mais agressivo [14, 15]. Apesar de extensa pesquisa sobre as mudanças genéticas de GC, os mecanismos subjacentes da doença ainda estão longe de ser compreendida, e que a doença não pode ser facilmente explicada por um modelo de adenoma-carcinoma como no câncer colorretal. Existem três mecanismos moleculares que levam carcinogênese gástrica: instabilidade cromossômica, instabilidade de microssatélites e alterações epigenéticas [16]. O resultado líquido é a ativação de oncogenes, inativação de genes supressores tumorais e desregulação de vias de sinalização [11, 12]. regulação e alterações na expressão de factores de crescimento e citocinas aberrante do ciclo celular regular a diferenciação e sobrevivência de células tumorais. Mutações de adesão celular e genes angiogénicos desempenham papéis importantes no comportamento invasivo e metastático de células de GC.
O objetivo do estudo foi identificar os genes mais diferencialmente regulados em adenocarcinoma gástrico cirurgicamente ressecado comparação à mucosa normal combinado, utilizando todo genoma perfis cDNA microarray. Nós também tentar identificar genes que influenciam o prognóstico GC e sobrevivência. Os resultados são comparados com a resposta de células epiteliais gástricas gene para H. pylori
infecção, a qual foi analisada num documento publicado anteriormente [17]. Este estudo adiciona suporte para a importância da IL-8 Comprar e CLDN1
na carcinogênese gástrica, bem como demonstra mudanças genéticas importantes no GC e sua possível relevância para a infecção por H. pylori
.
Métodos
tecido e as características do paciente
as biópsias foram obtidas a partir de pacientes diagnosticados com adenocarcinoma gástrico não-cárdia na clínica endoscopia ambulatório no Hospital Universitário Akershus, Noruega. tomografia computadorizada tóraco-abdominal foi realizada para excluir pacientes com doença metastática. 20 pacientes com ambos os tipos intestinal e difuso de GC foram incluídos. Pacientes e características clínico-patológicas são apresentados na Tabela 1. Na admissão para cirurgia eletiva, por escrito, o consentimento informado para participação no estudo foi obtido dos participantes. Dentro de 5 minutos após a remoção dos principais peça cirúrgica, foram retiradas amostras de ambos a fronteira do tumor e da mucosa gástrica corpal saudável dentro da mesma área do estômago, mas mais do que 5 cm de distância a partir do tumor, e armazenado em RNAlater
(Applied Biosystems , EUA). Todas as amostras foram armazenadas em + 4 ° C durante cerca de 1-2 semanas para permitir a penetração de tecidos completo de RNAlater
, antes de as amostras foram secas e armazenadas permanentemente em -80 ° C. Toda aquisição e manuseio da amostra foram realizadas pelo mesmo 1 As características dos pacientes individual.Table e características clínico-patológicas dos tumores gástricos 20 utilizadas no estudo Sexo seguro
Fêmeas n = 5, machos n = 15
Etnia
Europeu n = 18, Asian n = 2
idade na cirurgia
total de: 68,7 anos (± 12,5)
Mulheres: 65,7 anos (± 21,8)
machos: 69,7 anos (± 8,6)
sobrevivência pós-operatória (indivíduos falecidos)
total: 13,2 meses (± 8,8)
fêmeas (n = 4): 16,6 meses (± 6,4)
machos (n = 10): 12,0 meses (± 9,7 )
sobrevivência pós-operatória (indivíduos vivos no final do estudo)
total: 45,8 meses (± 7,9)
fêmeas (n = 1): 48.0 meses
sexo masculino (n = 5): 44,9 meses (± 8.8)
Tumor tamanho
49 mm (± 27)
estágio do tumor
T1 Página 2
T2
10
T3
5
T4
3
estágio Nodal
N0
10
N1
5
N2 Sims 3
N3 Página 2
histológica tipo
intestinal
5
difusa
12
Mixed Sims 3
características dos pacientes e características clínico-patológicas dos tumores gástricos 20 utilizadas no estudo. Os valores são a média mais /menos o desvio padrão.
Após ressecção do tumor, os principais espécime foi submetido a exame histolopathological por dois patologistas especialista sênior para confirmar o diagnóstico e classificar o tumor de acordo com a classificação Lauren [9]. mucosa gástrica antral e corpal foram examinadas para a gastrite, a atrofia e a metaplasia, e a presença ou ausência de H. pylori
foi examinada microscopicamente e, subsequentemente identificada por imuno-histoquímica. O Sistema de Sydney Atualizado foi usado para classificar e classificar o grau de gastrite [18, 19].
O estudo foi aprovado pelo Comitê Regional da Norwegian para Médicos e de Saúde de Ética em Pesquisa (REC Sudeste). Todas as amostras e os dados do paciente foi codificada e cegado antes da análise.
Isolamento de ARN, o controlo de qualidade e a síntese de ADNc
O ARN total foi isolado utilizando o RNeasy Kit de sangue e tecido (Qiagen GmbH, Alemanha) de acordo com o protocolo de preparação padrão do fabricante . A concentração de RNA e qualidade foram determinados utilizando um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, EUA) e Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, EUA). O número de integridade do ARN foi adequado para a síntese de cDNA. A
Ilumina TotalPrep estojo de amplificação de ARN (Ambion Inc., EUA) foi utilizado para amplificar ARN por hibridização em Illumina BeadChips. Para sintetizar a primeira cadeia de cDNA por transcrição inversa, utilizou-se ARN total de cada amostra recolhida acima. Após a síntese da segunda cadeia de ADNc e passos de purificação de ADNc, a transcrição in vitro para sintetizar
ARNc foi preparada durante a noite durante 12 horas.
Análise de cDNA microarray oligonucleótido
Os perfis de expressão de gene foram medidos usando Ilumina Humano HT-12 v3 expressão BeadChip (Illumina, EUA), que permite a análise de expressão de todo o genoma (48800 transcrições, correspondendo a aproximadamente 37.800 genes) de 12 amostras em paralelo em um único microarray. 35967 das sondas foram desenhadas usando a RefSeq (36,2 construir, Release 22) e 12.837 biblioteca sondas foram derivadas da UniGene (construir 199) do banco de dados [20, 21]. A imuno-histoquímica

a presença de H. pylori
nos espécimes cirúrgicos foram analisados ​​utilizando um anticorpo policlonal anti-Helicobacter
-antibody (Dako, Dinamarca, B0471 código, diluição 1: 200). 4 uM de secções, tecido embebido em parafina e fixado em formalina a partir de mucosa não-tumoral foram aplicadas em lâminas revestidas. A desparafinação, de recuperação de epítopo de reidratação e foram realizadas num PT Ligação da Dako (Dako, Dinamarca) a 97 ° C durante 20 min. O procedimento de imunocoloração foi realizada num Dako Autostainer Além disso, aplicando o ™ Flex Envision, sistema de pH elevado (Dako, Dinamarca).
Bioinformatics e estatísticas
R /BioConductor [22, 23] com o pacote Beadarray [24] foram utilizados para o pré-processamento dos dados de texto a partir de microarray BeadStudio. artefatos espaciais foram removidos usando bash [25] antes dos dados de expressão foram log 2-transformado e quantil normalizado. O registo de mudança 2 vezes (FC) de cada sonda no conjunto dentro de cada par de tecidos (tumorais vs mucosa normal combinado) foi então calculada, e os dados foram carregados para o pacote de software J-expressa [26]. Terminou testes produto [27], em seguida, foi realizada para testar se a expressão diferencial entre tumor e tecido de mucosa normal combinado foi significativa. A expressão diferencial significativa foi declarado se o valor de p ajustado, isto é, o valor de Q-FDR, era inferior a 0,05. agrupamento hierárquico foi realizada utilizando ligação média e medida de distância euclidiana. As análises foram realizadas utilizando o pacote de software J-express [26]
Para produzir uma lista de tamanho razoável dos genes mais diferencialmente expressos, genes menor expressas foram filtradas em um nível de corte de FC >.; 1.5, produzir uma lista dos 130 genes mais diferencialmente expressos. Este conjunto de dados foi importado para Onto-Express e Pathway expresso [28, 29], parte do conjunto de software em Ferramentas, para análise funcional e agrupados em Gene Ontology (GO) termos e KEGG (Enciclopédia Kyoto de genes e genomas celulares) vias de sinalização [30]. Caminho expresso calcula um fator de impacto (SE), que é utilizado para classificar as vias de sinalização afectadas, com base na mudança de dobragem, o número de genes envolvidos na via, e a quantidade de perturbação de genes a jusante [31].
o conjunto de dados foi celebrado Statistics PASW (SPSS versão 18.0.2) para realizar a análise de correlação bivariada para selecionar genes que associados com os parâmetros clínico. Ambos os coeficientes de correlação de Pearson e Spearman foram utilizados para identificar genes que correlacionam. Entre os genes que se correlacionaram, estamos particularmente interessados ​​em pessoas que mostrava uma expressão similar em nosso estudo publicado anteriormente de H. pylori
células epiteliais gástricas -exposed [17]. Os genes selecionados foram então submetidos a uma análise de regressão multivariada de Cox para investigar se algum dos genes foram preditores independentes de sobrevivência pós-operatória nos pacientes GC, independente do tipo histológico, estágio do tumor e tamanho, doença nodal e idade no momento da cirurgia. No gene de um preditor que foi identificado, diferentes níveis de corte foram aplicados para construir grupos de alto e baixo nível de expressão, antes de significância estatística entre os grupos foi avaliada utilizando um teste log-rank (Mantel-Cox). Um gráfico de sobrevida de Kaplan-Meier foi criado para demonstrar a diferença na sobrevivência entre os grupos de alto e baixo de expressão.
Estão disponíveis sob o número de acesso E-MTAB-1440 Os dados de microarranjos no banco de dados ArrayExpress [32].
resultados
expressão gênica
Whole profiling de 20 amostras de tumores gástricos combinados expressão genoma foi realizada utilizando microarrays de cDNA. testes estatísticos classificação dos produtos [27] do log 2 mudança vezes (FC) valores de cerca de 38 mil genes no chip de microarray de expressão revelou 2297 genes que foram significativamente up-regulada e 2259 genes que foram significativamente regulada no tumor tecido em comparação com a mucosa normal combinado (p < 0,01). Os 130 genes filtrados que foram diferencialmente regulados por um FC média > 1.5 estão listados na Tabela 2, e constituem o conjunto de dados em que é realizada uma análise mais aprofundada. Dos genes mais diferencialmente reguladas, 30 genes demonstrou-se-regulação e 100 genes foram regulados negativamente. IL-8
foi o único gene mais supra-regulados, regulados positivamente em 18 de 20 pares de tecido, com uma média de 2,6 FC (Figura 1), seguido por
COL1A1 e CLDN1
(Figura 2 ). O gene mais regulada foi PGA4
, sendo notavelmente baixo-regulamentada em 18 de 20 pares de tecido, seguido de GIF Comprar e ATP4A
. agrupamento hierárquico do conjunto de dados (Figura 3) mostrou que os tecidos de tumor e de controlo formado aglomerados de expressão de genes distintos. Dentro do cluster do tumor, as diferentes categorias histológicas difuso, cancro intestinal e misto formado aglomerados individuais quase exclusivos, demonstrando semelhança genética estreita em cada um dos subgrupos histológicos. Entre os tecidos de controle, e entre o H. pylori
indivíduos positivos, nenhum agrupamento particular foi seen.Table 2 Os genes mais diferencialmente regulados em tumor gástrico vs mucosa controle
-regulada genes (n = 30)
genes
regulada para baixo (n = 100)
Gene símbolo
Média FC
Gene símbolo
FC Média

símbolo do gene
Média FC
símbolo do gene
Média FC
IL-8
2,58
PGA4
-5.58
MAL
-2.22
AKR7A3
-1.79
COL1A1
2.18
GIF
-5.48
SCNN1B
-2.22
KIAA1324
-1,79
CLDN1
2,14
ATP4A
-5.28
SOX21
-2.22
CCDC121
-1.78
SPP1
2.09
PGA3
-4.72
CAPN9
-2.21
FBP2
-1.76
CLDN2
2.09
ATP4B
-4.71
AGXT2L1
-2.20
FCGBP
-1.75
CEACAM6
2.09
PGA5
-4.34
HDC
-2.18
ORM2
-1.75
SERPINB5
2.06
LIPF
-3.91
GSTA1
-2.18
FAM3B
-1.73
KRT17
2,00
CPA2
-3.78
KLK11
-2.12
TRIM50
-1.73
H19
1.94
GHRL
-3.75
APLP1
-2.12
DUOX1
-1.72
CLDN7
1,93
GKN2
-3.26
MT1H
-2.09
RAP1GAP
-1.70
TFF3
1.92
KCNE2
-3.19
ADH1C
-2.09
EEF1A2
-1.70
OLFM4
1.91
SST
-3.12
DPCR1
-2.06
ANGPTL3
-1.70
THBS2
1.91
CHGA
-3.02
AKR1B10
-2.03
B3GAT1
-1.69
PI3
1.90
PSCA
-3.00
MT1G
-2.03
C6ORF105
-1.68
SULF1
1.89
CHIA
-2.88
CKB
-2.01
FGG
-1.68
BGN
1.82
GKN1
-2.88
SH3GL2
-1.99
ADA
-1.65
KRT6B
1.80
KCNJ16
-2.82
REP15
-1.97
C6ORF58
-1.63
THY1
1.72
GC
-2.66
CKM
-1.95
ZNF533
-1.60
MMP11
1.70
CLIC6
-2.65
FGA
-1.95
RPESP
-1.59
KLK6
1.67
SOSTDC1
-2.53
SLC9A4
-1.92
MT1F
-1.58
SERPINA3
1.65
ESRRG
-2.52
MFSD4
-1.92
PNPLA7
-1.57
FNDC1
1.64
CCKBR
-2.51
ALDOB
-1.89
FUT9
-1.57
COL1A2
1.63
TMED6
-2.44
SCNN1G
-1.87
RPRM
-1.56
CST1
1.63
MT1M
-2.44
IRX2
-1.87
GUCA2B
-1.56
FAP
1.60
GPER
-2,43
SLC26A9
-1.87
TCN1
-1.55
COL6A3
1.60
CKMT2
-2.36
CLCNKA
-1.87
PKIB
-1.55
SFRP4
1.56
VSIG2
-2.36
CAPN13
-1.86
SLC9A2
-1,55
TMEM158
1,53
FLJ42875
-2,33
TTR
-1,86
Homer2
-1,53
MMP7
1,50
CXCL17
-2.32
GSTA2
-1.85
AKR1C4
-1.50
MMP10
1.50
CA9
-2.32
NKX6-2
-1.83
REG3A
-1.50
AKR1C2
-2,27
CA2
-1,83
PI16
-1.50
ALDH3A1
-2,24
FOLR1
-1,82
MAP7D2 viajantes - 1,50
SCGB2A1
-2,23
RDH12
-1,81
AQP4
-2,24
IRX3
-1,80
genes diferencialmente regulados com log2FC média de > 1,5 (n = 130). extraiu-se a partir da expressão do genoma inteiro. Os níveis médios log2FC correspondentes a cada gene são listados. Nove genes. mostradas em negrito. demonstrada regulamento semelhante, tanto no estudo atual e em um estudo anterior, em que as células epiteliais gástricas foram expostos a H. pylori
[17].
Figura 1 Interleukin-8 expressão de genes em tumores gástricos vs mucosa controle pareado. A linha a cheio representa a relação relativa de IL-8
expressão em tecido de tumor comparado com a mucosa gástrica de controlo combinados, como a mudança log2 dobra (tumor log2 /controlar os níveis de expressão). Uma contagem positiva indica uma expressão mais elevada no tumor em comparação com a mucosa gástrica normal. A IL-8 foi
o gene mais consistente sobre-regulada no estudo. O fundo cinza representa a expressão de cerca de 37 800 outros genes.
Figura 2 Claudin 1 a expressão do gene em tumores gástricos vs mucosa controle pareado. A linha sólida representa razão relativa de expressão CLDN1
no tecido de tumor comparado com a mucosa gástrica de controlo combinados, como a mudança log2 dobra (tumor log2 /controlar os níveis de expressão). Uma contagem positiva indica uma expressão mais elevada no tumor em comparação com a mucosa gástrica normal. O fundo cinza representa a expressão de cerca de 37 800 outros genes.
Figura 3 agrupamento hierárquico da expressão gênica de 20 tumores gástricos e mucosa controle. expressão do genoma inteiro de pares de tecido /controle de 20 tumores foram filtrados para produzir um conjunto de dados que contém os 130 genes mais diferencialmente regulados. A maior parte das amostras tumorais agrupado separada para as amostras de controlo. As amostras de tumores Tipo de difuso são destacados a cinzento claro, do tipo intestinal em cinzento médio e o tipo misto em cinzento-escuro para ilustrar a subclustering dos três tipos histológicos de cancro diferentes.
Genes do conjunto de dados de corrente cruzada foram comparados com o a maioria dos genes regulados diferencialmente identificados no nosso estudo anterior, onde as células epiteliais gástricas foram expostas a H. pylori
durante 24 horas in vitro
[17]. Ambos H. pylori
células epiteliais gástricas -exposed e as biópsias de tumores demonstraram significativo aumento da regulação de cinco genes comuns (IL-8, CLDN1, KRT17, CLDN7 Comprar e MMP7
) e a regulação negativa de quatro pessoas genes comuns (GPER, KIAA1324, ADA Comprar e SLC9A2
).
Gene ontologia
em seguida, o conjunto de dados dos 130 genes mais diferencialmente regulados foi analisado para anotação funcional usando termos GO (Tabela 3). Entre os 30 genes sobre-regulada, processos de adesão celular, e, em particular, a adesão célula-célula independente de cálcio, estão entre as condições mais altamente enriquecidos. Além disso, os processos sintéticos como morfogênese pele e desenvolvimento dos vasos sanguíneos, bem como os processos relacionados com o colágeno tanto catabólicos e sintéticos estavam entre os termos significativos identificados. Apenas uma pequena proporção dos genes regulados por baixo foram mapeados para ontologias específicas em comparação com os genes regulados positivamente, onde a digestão e excreção foram os termos mais enriquecidos. Vários processos metabólicos, regulação do pH e cobalamina e transporte de íons também foram enriquecidas significativamente termos GO entre os genes regulados por baixo (Tabela 4) .table associações ontologia 3 Gene em genes regulados positivamente
P-value
nenhum dos genes envolvidos
% de genes envolvidos
Gene ontologia
GO: número
0,00066 Sims 3
10,0
cálcio adesão célula-célula independente de
GO: 0016338
0,0007 Página 2
6,67
pele morfogênese
GO: 0.043.589
0,023
5
16,67
A adesão celular
GO: 0007155
0,023 Página 2
6,67
processo catabólico Collagen
GO: 0.030.574
0,023 Página 2
6,67
Collagen organização fibrilas
GO: navio 0030199
0,027 Página 2
6,67
sangue development
GO:0001568
0.042
1
3.33
Copulation
GO:0007620
0.042
1
3.33
Regulation da replicação do genoma retroviral
GO: 0045870
0,042
1

• papéis integrativos de factor de crescimento transformante-α nos mecanismos de citoprotecção de lesão da mucosa gástrica
• Associação das tiazolidinedionas com câncer gástrico em diabetes mellitus tipo 2: um estudo caso-controle de base populacional study