Baktericídne aktivity katiónových steroid CSA-13 a cathelicidin peptid LL-37 proti Helicobacter pylori v simulovanej žalúdočnej činnosti juice

baktericídne katiónového steroid CSA-13 a cathelicidin peptid LL-37 proti Helicobacter pylori
v simulovanej žalúdočnej šťave
abstraktné
pozadia
celosvetovom výskyte kmeňov rezistentných H. pylori
motivuje hľadanie nových látok s terapeutickým potenciálom proti tejto skupiny baktérií, ktoré kolonizuje žalúdok, a je spájaný s rozvojom adenokarcinóm , Táto štúdia bola navrhnutá tak, aby posúdiť in vitro
anti-H. pylori
potenciál cathelicidin LL-37 peptid, ktorý sa prirodzene vyskytuje v žalúdočnej šťave, optimalizovaným syntetického analógu WLBU2 a nepeptidový antibakteriálne činidlo ceragenin CSA-13.
Výsledky
V súlade s predchádzajúcimi štúdiami , zvýšená expresia HCAP-18 /LL-37 bola pozorovaná v žalúdočnej sliznici, získané z H. pylori
infikovaných pacientov. (Minimálna baktericídne koncentrácie) MBC určuje živín obsahujúcich rozsahu médií 100-800 ug /ml LL-37, 17.8-142 ug /ml pre WLBU2 a 0.275-8.9 ug /ml pre ceragenin CSA-13. Tieto dáta ukazujú, významné, ale veľmi rozdielne antibakteriálne účinky na klinické izoláty H. pylori
. Po inkubácii v simulovanej žalúdočnej šťave (nízkom pH s prítomnosti pepsínu) CSA-13, ale nie LL-37 alebo WLBU2, zachovaná antibakteriálnu aktivitu. V porovnaní s LL-37 a WLBU2 peptidov, CSA-13 aktivita bola tiež viac rezistentné na inhibíciu izolované hostiteľských žalúdočných mucínu.
Záver
Tieto dáta ukazujú, že cholánovej antimikrobiálne látky na báze kyseliny, ako je CSA-13 odolávať proteolytické degradácii a inhibícia mucínu a majú potenciál na liečbu H. pylori
infekcií, vrátane tých, spôsobených kmeňmi klaritromycínu a /alebo metronidazolom-rezistentné.
pozadí
Helicobacter pylori
je nesený viac ako polovica svetovej dospelej populácie [1]. To môže chronicky kolonizovať ľudský žalúdočnú sliznicu, kde je nájdený v hlienu vrstvy a je prilepená k epitelové bunky [2]. Hoci väčšina osôb infikovaných vírusom zostať asymptomatickej, infekcie H. pylori
môže podporovať ťažkú ​​gastritídu [3], a výrazne zvyšuje riziko žalúdočných malignít [4, 5]. V niektorých epidemiologických štúdiách, eradikácia H. pylori
bolo preukázané, že je účinný v žalúdku prevencia rakoviny [6, 7]. Ďalej bolo zistené, že H. pylori
eradikáciu znížiť výskyt a závažnosť lézií, ktoré majú karcinogénne potenciál na zvieracích modeloch [8, 9]. Prirodzené mechanizmy, ktoré chránia hostiteľa z H. pylori
infekcie závisí na funkciu vrodeného obranný systém, v ktorom antibakteriálne peptidy, ako cathelicidin LL-37 [10, 11] a O-glykány z žalúdočného hlienu [12] hrať kľúčovú úlohu.
LL-37 je proteolyticky spracované peptid odvodený od C-terminálny domény ľudského cathelicidin (HCAP-18 /LL-37), ktorý je konštitutívne uvoľní do extracelulárneho priestoru fagocytujúcich granulocytov a epitelové bunky, [13] , Funkcia pripisované LL-37 zahŕňajú prevencii rastu baktérií [14], neutralizácia bakteriálnej steny molekuly biologickú aktivitu [15], a aktivácia hostiteľských buniek naviazaním špecifické bunkové membránové receptory [16-18]. H. pylori
upregulates produkciu LL-37 /hCAP18 žalúdočné epitel, čo naznačuje, že cathelicidin alebo odvodená LL-37, prispieva k určovanie rovnováhy medzi hostiteľským slizničnej obrany a H. pylori
mechanizmy prežitia, ktorá sa spája chronická infekcie s týmto žalúdka patogénom [10, 11].
antibakteriálne peptidy Katiónové (Caps), vrátane LL-37 boli podrobne preskúmané ako potenciálny zdroj nových antibakteriálnych molekúl. Upravená WLBU2 peptid, ktorého zvyšky sú usporiadané na vytvorenie amfipatické helikální štruktúru s optimálnym nabitia a hydrofóbne hustote, prekonáva niektoré obmedzenia prirodzeného LL-37, ako je citlivosť na Mg 2+ alebo Ca 2+ a inaktiváciu krvi v sére [19]. Z tohto dôvodu by WLBU2 liečbu infekcií, kde LL-37 je neúčinný. Za účelom generovania molekúl schopných napodobniť schopnosť CAPS "ku kompromisu bakteriálne membránové integrity, nepeptidovej ceragenins s katiónovými, boli vyvinuté facially amfifilickej štruktúry charakteristické pre väčšinu antimikrobiálnych peptidov. Ceragenins ako je CSA-13 reprodukovať požadovanú morfológiu CAP pomocou žlčových kyselín lešenia a pripojené amínové skupiny [20]. Sú baktericídne proti gram-pozitívnym a gram-negatívnych organizmov, vrátane baktérií odolných voči liekom, ako je klinicky relevantný stafylokoky rezistentný Staphylococcus aureus
(MRSA), a predchádzajúce štúdia preukázala, že citlivosť CSA-13 má MIC 50 /MBC 50 pomer 1 [21, 22]. V tejto štúdii sme porovnať baktericídne účinnosť LL-37, WLBU2 a CSA-13 proti klinických izolátov H. pylori
. Výsledky naznačujú, že napodobňuje na báze kyseliny cholánovej antimikrobiálne peptid, ako je CSA-13 majú potenciál na liečbu infekcie baktériou H. pylori
, vrátane tých, spôsobených kmeňmi klaritromycínu a /alebo metronidazolom-rezistentné.
Výsledky
Imunohistochemické snímanie ľudskej žalúdočnej sliznice úseky s anti-HCAP-18 /LL-37 protilátky
mikroskopické obrazy slizníc biopsia po imunohistochemické vyhodnotení s anti-HCAP-18 /LL-37 protilátky sú uvedené na obrázku 1. DAB- pozitívne farbenie indikuje prítomnosť LL-37 peptidu a /alebo jeho materský proteínu HCAP-18. Vysoká intenzita DAB farbenie (označený hnedou farbou) na epitelové bunky hlien produkujúcich a fundusu žliaz naznačuje vysokú akumuláciu HCAP-18 /LL-37 peptidu s najväčšou pravdepodobnosťou poháňaným LL-37 špecifické interakcie s mucínu aký bol zaznamenaný v predchádzajúcich štúdiách [23, 24]. Distribúcia HCAP-18 /LL-37 v diferencovanejší populácie epitelu žalúdočnej sliznice sa líši od nájdené pre ľudský beta-defenzínov 2 [10] alebo lyzozýmu [25], ale je podobné ako u hrubého čreva [26 ]. Žalúdočnej sliznice biopsie z pacientov infikovaných H. pylori
vykazujú vyššiu intenzitu DAB farbenie v porovnaní s výsledkami získanými od neinfikovaných pacientov. Podľa predchádzajúcich správ, tento výsledok naznačuje hostiteľa obrannú odpoveď na H. pylori
[11], ktorá je čiastočne založený na zvýšenej expresiu HCAP-18 /LL-37 od žalúdočných buniek epitelu. Obrázok 1 Prítomnosť HCAP-18 /LL-37 peptidu vo slizničných biopsiách ľudskom žalúdku detekovaná pomocou imunohistochemické analýzou pomocou monoklonálnych protilátok proti ľudskému CAP-18 /LL-37. Vzorky A /B a C /D predstavujú vzorky získanej z nezasiahnutých a H. pylori
infikovaných pacientov, resp. Uvedené údaje sú reprezentatívne z piatich pokusov.
Baktericídne aktivity LL-37, WLBU-2 peptidy a ceragenin CSA-13 proti rôznym kmeňom H. pylori
k identifikácii rezistentné kmene, klinické izoláty H. pylori
boli podrobené vyhodnotenia MIC (tabuľka 1) s niekoľkými antibiotík v súčasnosti používajú v klinickej liečbe infekcie baktériou H. pylori
. Medzi siedmimi testovaných izolátov získaných z rôznych predmetov, kmeň 4 bol rezistentný na metronidazol a kmene 5, 6, 7 boli odolné ako metronidazol a klaritromycín. Všetky izoláty boli citlivé na amoxicilín a tetracyklín. V súlade s predchádzajúcimi správami o účinkoch HBD-1, H-BD-2 a LL-37 peptidy proti H. pylori
[10, 11] Všetky izolované kmene H. pylori
bolo zabitých po 6 hodinách inkubácie s LL-37, WLBU2 a CSA-13 s priemerným MBC (ng /ml) hodnoty 8,9 ± 4,03; 5,23 ± 2,7 a 0,31 ± 0,25, kedy bola hodnotená MBC v pufri HEPES alebo 300 ± 232 53 ± 41 a 2,98 ± 3,11, kedy bola hodnotená MBC v Brucella bujóne Bullion, respektíve (obrázok 2). Vyhodnotenie hodnôt MBC v HEPES s prídavkom 2 mM MgCl 2 pre H. pylori
ATCC 43504 odhalila osem násobné zvýšenie LL-37 a štyri násobný nárast ako pre WLBU2 a CSA-13 (dáta nevykazujú). Obrázok 2 Baktericídna účinnosť proti H. pylori. Minimálna baktericídne koncentrácie (MBC) LL-37 (biely stĺpec), WLBU2 (šedý stĺpec) a CSA-13 (čierny stĺpec) proti H. pylori
(ATCC 43504 kmeň a sedem klinické izoláty získané zo slizničných vzoriek z rôznych predmetov ) hodnotila v HEPES (panel a) alebo Brucella bujónu Bulion (panel B). MBC udáva koncentrácia, pri ktorej zlúčeniny úplne vykoreniť inokulum H. pylori
.
Tabuľka 1 Vyhodnotenie citlivosti klinických kmeňov H. pylori
voči antibiotikám.
H. pylori
kmene
Antibiotiká
AMX
CLR
Tet
metronidazol
ATCC 43504
0,016 0,094
0,25
64,0 ®
1
0.094
0.125
0.75
0.19
2
<0.016
0.19
0.125
0.094
3
0.016
0.25
3.0
0.5
4
0.032
0.047
2.0
32.0 ®
5
0,25
64,0 ® 1,0
96,0 ®
6
0,032
1,5 ®
1,5
32,0 ®
7
0,047
1,5 ®
2,0
48,0 ®
hodnoty MIC (ug /ml) (AMX-amoxicilín, klaritromycín CLR, TET-tetracyklín)
Antibakteriálne aktivita LL-37, WLBU2 a CSA-13 po pre-inkubácii pri nízkom pH s pepsínom alebo mucín
Vedľa známeho inhibícia CAP antibakteriálnej aktivity zo strany dvojmocné katióny, ako Mg 2+ a Ca 2+, proteolytickou aktivitu pepsínu môže ohroziť funkciu zakončenie v žalúdočnej šťavy prostredí s prítomnosťou mucínu a nízkym pH. Pre riešenie tejto možnosti sme hodnotili antibakteriálnu účinnosť proti Escherichia coli MG1655
po 3 hodinách predbežnej inkubácii LL-37, WLBU2 a CSA-13 v simulovanej žalúdočnej šťave v porovnaní s aktivitou po ich pre-inkubácie v PBS pri pH 7,4 , Pred vykonaním testu zabíjanie, pH vzoriek s nízkym pH a nízkym pH /pepsín bolo upravené na hodnotu 7,4. Antibakteriálny aktivita LL-37 a WLBU2 peptidov proti E. coli MG1655
sa významne nezmenila po pre-inkubácii pri pH ~ 1,5, ale bol stratený po pre-inkubácii pri pH ~ 1,5 v prítomnosti pepsínu (obrázok 3A a 3B). Naproti tomu, antibakteriálne účinnosť CSA-13 bol v nezmenenej forme pre-inkubácie pri pH ~ 1,5 s alebo bez pepsínu (obrázok 3C). Na druhej strane, baktericídne aktivity všetkých zložiek boli ohrozené v rôznej miere pri testovaní za použitia bakteriálnej zabíjanie testu v prítomnosti čisteného žalúdočného hlienu. V úzkej zhode s výsledkami získanými z tohto E. coli
štúdie MG1655, hodnoty MBC LL-37 peptidu vyhodnotené po 1H pre-inkubáciu s pufrom pri nízkom pH, obsahujúce pepsín alebo mucín bola zvýšená, ale tie CSA-13 boli takmer bez zmeny (obrázok 3D). Všetky hodnotené činidlá k strate antibakteriálnej aktivity v PBS doplnenom 10% ľudskej žlči (koncentráciu, ktorá neinterferuje s E. coli MG1655
rastu - dáta nie sú uvedené). Tento výsledok naznačuje, že fyzikálno-chemické vlastnosti antibakteriálnych molekúl podporovať ich vkladanie do žlče lipoproteín, čo obmedzuje ich interakciu s bakteriálnou steny. Nedošlo k žiadnej štúdia na vyhodnotenie antibakteriálnej aktivity krytky duodenálnej šťave, ale tieto výsledky naznačujú, že žlč reflux do žalúdka môže interferovať s krytkami aktivitou. Obrázok 3 Antibakteriálny aktivita proti E. coli MG1655 a H. pylori kmeňa ATCC 43504. antibakteriálnu účinnosť LL-37 (panel A) WLBU2 (panel B) a CSA-13 (panel C) proti E. coli MG1655
po pre-inkubácie (3 h pri 37 ° C) v PBS (prázdna kolieska), simulované žalúdočné šťavy pri pH ~ 1,5 (štvorčeky), simulované žalúdočné šťavy pepsínom (kosoštvorce), simulované žalúdočné šťavy s mucínu (trojuholníky) a PBS s človekom žlče (10%), získané zo žlčníka (naplnené kruh). Uvedené údaje sú priemer ± SD troch až štyroch pokusov. MBC o LL-37 (biely stĺpec) a CSA-13 (čierny stĺpec) (panel D) proti H. pylori
(ATCC 43504) po preinkubace (1 h pri 37 ° C) v simulovanej žalúdočnej šťave pri pH ~ 1,5 (a), simulované žalúdočné šťavy s pepsínom (B), a v prítomnosti mucínu (C)
Analytická charakterizácia LL-37 a CSA-13 po inkubácii s pepsínom
analýzou hmotnostnej spektrometrie (Obrázok 4) ukazuje, že tri hodiny inkubácie s výsledkami pepsínu v rozsiahlej degradácii LL-37. Avšak, pri nízkom pH, trávenie pepsín je vysoko špecifická a LL-37 peptid štiepenie sa obmedzila na miesto s hydrofóbnymi aminokyselinami. Potenciálne miesta štiepenia predpovedal PeptideCutter charakteristika softvér http: .. //Sk expasy org /tools /peptidecutter /naznačujú, že LL-37 trávenie pepsínom v našich experimentálnych podmienkach by mali uvoľniť 11 výrobkov, vrátane 3 kratších peptidov (RKSKEKIGKE, FKRIVQRIKD a LVPRTES). Tieto predpovede sú v súlade s hmotnostnej spektrálnej analýzy, ktorá nevykazuje prítomnosť akéhokoľvek intaktného LL-37 zostávajúceho po inkubácii s pepsínom pri nízkom pH, ale odhaliť vzniku mnohých nových vrcholov s rôznymi retenčnými časmi. Zostávajúce Antibakteriálny aktivita LL-37 po liečbe s pepsínom (obrázok 3A a 3D) v zabíjaní testoch pravdepodobne reprezentuje zvyškovú aktivitu týchto LL-37 fragmentov. Na rozdiel od pozorovanej degradácie LL-37, CSA-13 Analytická dáta nebol zmenený po inkubácii s pepsínom pri nízkom pH. Obrázok 4 Hmotnostná spektrometria analýzy. Hmotnostná spektrometria analýza LL-37 (panel A) a CSA-13 (panel B) v PBS (krivka 1) pufra s nízkym pH (krivka 2) a nízke pH pufer s prítomnosťou pepsínu (krivka 3). Celkový iónový chromatogram (TIC) sú pre každú vzorku stavu s vložkou hmoty na nabitie (m /z) spektra ukazujúci intenzitu pre orámovaných TIC vrcholy. Molekulová hmotnosť intaktné LL-37 je 4494, ktoré môžu byť pozorované s viacerými poplatkov (m /z = 4 MW = 1124, m /z = 5 MW = 900, atď) v pozitívnom iontovom móde. Molekulová hmotnosť CSA13 je 678, ktorý môže byť pozorovaný priamo a s viacerými nábojmi. sú zobrazené dáta z jedného experimentu.
Toxicita LL-37, WLBU2 a CSA-13 proti RBC a ľudské bunky adenokarcinóme
nešpecifických vloženie antibakteriálnych peptidov a ich napodobenín do bunkových membrán hostiteľských môžu vyvolať toxicitu. Hostiteľská bunková membrána permeabilizace možno merať uvoľňovanie proteínov, ako je hemoglobín a LDH z cytosolu do extracelulárneho priestoru. Vyhodnotením hemoglobínu a uvoľnenie LDH (obrázok 5A a 5B), ukazujeme žiadny významný membránové permeabilizaci akýmkoľvek testovaných molekúl v rozsahu, v ktorom sa majú baktericídne aktivitu vo fyziologickom roztoku vyrovnávacích pamätí (obrázok 2A, obrázok 3). Toto zistenie bolo potvrdené mikroskopickým hodnotením adenokarcinóm morfológiu buniek ukazuje žiadny viditeľný rozdiel medzi kontrolnými bunkami a pacientov liečených 10 ug /ml LL-37, WLBU2 alebo CSA-13 (obrázok 5C). Avšak zvýšenie hemoglobínu a LDH uvoľňovania sa pozorovala s rastúcou koncentráciou. Medzi tromi testovanými molekulami, WLBU2 bol najsilnejší hemolytická činidlá, ale všetky z nich vykazovali podobnú schopnosť ohroziť celistvosť adenokarcinóm bunkovej membrány (obrázok 5B a 5C). CSA-13 baktericídne koncentrácie proti H. pylori stroje a E. coli MG1655
(obrázkoch 2A, 2B a 3C) hodnotila vo fyziologickom roztoku, rovnako ako živiny obsahujúce vyrovnávacej pamäte boli nižšie ako jeho minimálna hemolytickú koncentráciu a nižšou koncentráciou spôsobujúcich dysfunkcii adenokarcinóm bunkové membrány. Obrázok 5 Vyhodnotenie bunkovej toxicity. Hemoglobín a LDH uvoľňovania z ľudských červených krviniek a ľudské bunky adenokarcinóme žalúdka (panel A a B v tomto poradí), po pridaní LL-37 (kruhy), WLBU2 (kosoštvorce) a CSA-13 (trojuholníky), s následnou inkubáciou počas 1 hodiny pri teplote 37 ° C. Uvedené údaje sú priemer ± SD z troch pokusov. Morfológia ľudských bunkách adenokarcinóme žalúdka pred (kontrola) a potom LL-37, WLBU2 a CSA-13 Liečba bola hodnotená fázovo kontrastné mikroskopie (panel C). sú zobrazené dáta z jedného reprezentatívneho experimentu. Dva ďalšie pokusy odhalili podobné výsledky.
Diskusia
miery úspešnej liečby H. pylori
žalúdočné infekcie, dosiahnutom v kombinačných terapiách dvoch antibiotík a inhibítorov protónovej pumpy sa znížil z viac ako 90% do asi 80 % počas posledného desaťročia [27]. Okrem toho sú náklady na tejto terapie je významný, a preto je potreba viac bežne dostupných prostriedkov na liečenie alebo predchádzanie Helicobacter pylori infekcie
stále existuje [28]. Nové látky na liečbu H. pylori
infekcie sú nevyhnutné tiež kvôli rastúce problémy s drogami valivým odporom spôsobené dlhodobým používaním antibiotík [29] a adaptačných mechanizmov prežitie patogénnych baktérií, aby čelila v súčasnosti používajú antimikrobiálne látky. Napríklad H. pylori
kmene odolné voči amoxicilínu, metronidazol a klaritromycínu boli [30, 31] hlásené. Metódy pre zlepšenie liečby H. pylori
by mohla byť vedená vhľad do prirodzených mechanizmov, ktoré sa u pacientov infikovaných reagovať na túto baktériu a dôvody, prečo normálny hostiteľskej obranné mechanizmy zlyhávajú.
Táto štúdia potvrdzuje predchádzajúce správu zvýšená HCAP-18 /LL-37 expresie v žalúdočnej sliznici pacientov infikovaných H. pylori
[11]. Toto zistenie naznačuje, že zvýšenie produkcie baktericídne peptidu LL-37 môže hrať kľúčovú úlohu v obrane hostiteľa proti H. pylori
[11]. Avšak, toto baktericídne reakcie v niektorých predmetoch je nedostatočná a H. pylori
infekcia môže ešte dosiahnuť chronického štádia. Nedostatok baktericídne funkciu LL-37 v tomto nastavení je navrhnuté, že zvýšená expresia HCAP-18 /LL-37 peptidu v žalúdočnej sliznice infikovaných jedincov môžu mať ďalšie funkcie, ako sú protizápalová a stimulujúce rast činidlá. V skutočnosti bolo nedávno ukázané, že liečenie žalúdočných vredov u krýs je podporovaný cathelicidin sprostredkované transaktivace epidermálneho rastového faktora receptora (EGFR) cez transformačný rastový faktor alfa (TGFa) signálne dráhy [32]. Alternatívne, strata obrany proti H. pylori
môže byť spôsobené stratou antibakteriálnej funkcie LL-37 v prostredí žalúdočnej sliznice. V dôsledku toho návrh antimikrobiálnych látok, ktoré sú účinnejšie pri tomto nastavení môže byť prínosom.
Motivovaný imunohistologických výsledkov aktivitu LL-37 proti klinických izolátov H. pylori stroje a E. coli MG1655
pod biologicky relevantné podmienky, bola porovnávaná s syntetického peptidu WLBU2 a ceragenin CSA-13. Táto štúdia ukazuje, že CSA-13, na rozdiel od LL-37 a WLBU2 peptidov, udržiava silný baktericídne účinnosti v prítomnosti mucínu a po preinkubace s pepsínom pri nízkom pH. Tieto podmienky predstavujú špecifické problémy spojené s Helicobacter pylori
liečbu, pretože tieto baktérie v žalúdku sú chránené pred kyslým prostredím hustú vrstvy slizu a účinnosť mnohých antimikrobiálnych látok je značne znížená v kyslom prostredí [31]. V súlade s tým sa prvý účinná terapia pre infekciu H. pylori
bola kombinácia antimikrobiálnych liekov relatívne necitlivé na pH, ako je bizmut, tetracyklín a metronidazol [33]. Okrem toho, ako je žalúdok pravidelne vyprázdni jej obsah (topická terapia tendenciu na zriedenie a vyprať) na zistenie, že CSA-13 má baktericídne aktivitu pri oveľa nižšej koncentrácii potom LL-37, počas rovnakej doby inkubácie (3-6 hodín) [11], naznačuje, že CSA-13 môže mať terapeutický potenciál pre liečbu infekcie baktériou H. pylori
. Antibakteriálny aktivita CSA-13, ktorý má menšiu náboj a jedinečnú distribúciu tohto náboja cez steroidu lešenia, kedy v porovnaní s LL-37 a WLBU2 peptidov, bolo tiež zistené, že menej inhibovaná mucínu izolované z žalúdočnej sliznice. Terapeutický potenciál na základe schopnosti CSA-13 k odstráneniu H. pylori
podporuje tiež oznámené predtým antibakteriálnu účinnosť proti iným kmeňom baktérií, vrátane klinických izolátov Pseudomonas aeruginosa
[21] a S. aureus
[22]. jedinečná schopnosť CSA-13, aby ohroziť bakteriálne membránové integrity a chemickú povahu tejto nízkej molekulovej hmotnosti zlúčeniny, ktorá sa premieta do zníženia nákladov na syntézu v porovnaní s katiónové antibakteriálne peptidy ukazujú, že CSA-13 alebo možno iná ceragenins mať potenciál pre liečenie H. pylori
infekcie, vrátane tých, spôsobené jeho rezistentným kmeňom.
Záver
baktericídne aktivity ceragenin CSA-13 je udržiavaná po predbežnej inkubácii v simulovanej žalúdočnej šťave, a v prítomnosti mucínu. Toto vyhodnotenie in vitro
znamená značný potenciál tejto molekuly v liečbe žalúdku slizničné infekcie.
Metódy
antibakteriálnych látok
LL-37 (NH 2-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-COOH) a WLBU2 ( NH 2-RRWVRRVRRWVRRVVRVVRRWVRR-COOH) peptidy boli získané od firmy Bachem (King of Prussia, PA). CSA-13 bol pripravený ako bolo opísané skôr [34]. Amoxicilín (AMX), klaritromycín (CLR), tetracyklínu (TET) a metronidazolu boli zakúpené od Sigma.
Kolekcia žalúdočnej sliznice a žlčových vzoriek
Počas gastroskopia, vykonáva sa buď GIF V2 alebo Q145 (Olympus) gastroskop, niekoľko žalúdočnej sliznice rezy boli prevzaté z prepyloric a korpusu oblasti žalúdka. H. pylori
infekcie bola založená v biopsiou pomocou testu Ureáza (CLO-test). Ľudské žlče bola získaná zo žlčníka u pacientov podstupujúcich cholecystektómii. Vzorky sa sterilizuje filtráciou cez 0,45 um membránu skôr, než sa riedi v PBS (1: 1) a zmieša sa s antibakteriálnymi látkami používanými v baktériách zabíjanie testoch. Štúdia bola schválená Lekárskej univerzite v Bialystoku etickou komisiou pre výskum človeka a zvierat, a všetci pacienti dal vedomý písomný súhlas k účasti v štúdii.
Imunohistochemické štúdie
Imunohistochemické štúdie boli vykonané na formalínu fixovaných, paraffin- vložené ľudskej žalúdočnej sliznice úseky pomocou králičie anti-LL-37 protilátky (H-075-06, ktorá je použitá v riedení 1: 100, Phoenix Pharamceuticals Inc.). Parafínových materiály boli narezané na hrúbku 5 um a plával na destilovanej vode pri teplote 45 ° C. Rezy potom boli namontované na sklíčka a umiestnené do 57 ° C sušiarni cez noc. Rezy boli zbavené parafínu podľa štandardných postupov a pridá sa 0,9% peroxidu vodíka v metanole po dobu 30 minút. Rezy boli inkubované s primárnou protilátkou pri teplote 37 ° C počas 60 minút, premyje sa 1% PBSA (1% BSA v PBS), a podrobí sa väzba so sekundárnou protilátkou (biotinylizované kozí anti-králičí IgG, 1: 400 riedenie). Amplifikácia bola vykonaná s súpravy Vectastain ABC, a systém pre detekciu HRP bol použitý pre colocalize peroxidázy sa DAB substrát. Rezy boli kontrastne hematoxylínom. Vzorky boli premietaný s Nikon Eclipse 80 mikroskopom pod 40 × zväčšenie.
Vyhodnotenie MIC a MBC
minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC) konvenčných antibiotík proti siedmich rôznych klinických izolátov H. pylori
(9 × 10 8 CFU /ml) bola stanovená za použitia Muller-Hinton agar (MH), obsahujúci 5% ovčej krvi. V inkubácii sa pokračuje počas 4 dní pri teplote 35 ° C v mikroaerofilní podmienkach udržiavaných s použitím plyn vyvíjajúceho sady BR60 plynu balenie-Campylobacter. Klinické izoláty H. pylori
boli považované za rezistentné k antibiotikám, keď príslušné MIC hodnoty boli vyššie ako 4 ug /ml pre AMX, 1 ug /ml pre CLR a 16 ug /ml pre TET a metronidazol. Minimálna baktericídne koncentrácie (MBC), antibakteriálnych látok bola vyhodnotená za použitia inokula na 10 8 CFU /ml. Po 6-hodinovej inkubácii pri 37 ° C, 10 ul alikvótne suspenzií boli nanesené na Columbia agaru doplnenom s ovčou krvou (5%).
Baktérie zabíjanie testu
baktericídne aktivity LL-37, WLBU2 peptidy a ceragenin CSA-13 proti E. coli MG1655
v prítomnosti mucínu alebo pepsínom z bravčového hlienu (Sigma) a ľudskej žlči boli merané ako bolo opísané skôr [35]. Baktérie boli pestované do mid-log fáze pri teplote 37 ° C (ovládaným vyhodnocovanie optickej hustoty pri 600 nm) a resuspendované v PBS pufri (pH = 7,4). Baktérie boli suspenzie zriedi 10 krát v 100 ul roztokov s obsahom antibiotík samy o sebe alebo hlienu (1000 ug /ml), alebo žlče (konečná 01:10 žlčové riedenie napodobňuje prostredie v hornej časti tenkého čreva, do ktorého je žlč vylučovaný [36] (pH = 7,4)). V ďalšej sade experimentov Antibakteriálny účinnosť týchto zložiek bola stanovená po ich predbežnej inkubácii v simulovanej žalúdočnej šťave [36, 37] pri pH ~ 1,5 s a bez pepsínu (0,5 mg /ml). Po inkubácii baktérií s antibakteriálnymi molekulami po dobu jednej hodiny pri teplote 37 ° C, bakteriálne suspenzie bola umiestnená na ľad a zriedi 10 až 1000- krát. Alikvótne z každého riedenia (10 ul) boli nanesené na LB agarové doštičky pre kultiváciu cez noc pri 37 ° C. Počet kolónií na každej riedenie bola počítaná nasledujúci deň ráno. Tieto jednotky tvoriace kolónie (CFU /ml) jednotlivých vzoriek boli stanovené z faktorom riedenia.
Hmotnostná spektrometria
Analytická dáta bola vykonaná na CSA-13 a LL-37 suspenzií Po 3 hodinách inkubácie s pepsínom (0,5 mg /ml) pri nízkom pH (~ 1,5) pri 37 ° C, za použitia Shimadzu (Columbia, MD), nástroj (systém LC-MS sa skladala z rozpúšťadlového systému poskytovania LC-20AB a SIL-20A auto-sampler spojený s duálny vlnovej dĺžky UV-Vis detektora a LCMS 2010EV jeden štvorpólový hmotnostný spektrometer), spojený na kolónu Shimadzu Premier C18 (150 mm x 4,6 mm vnútorný priemer, veľkosť častíc 5 um). Rýchlosť prietoku mobilnej fázy bol 1 ml /min s počiatočným pomerom 90% mobilnej fázy A (voda) a 10% mobilnej fázy B (acetonitril), oboje s 0,1% (objem /objem) kyseliny mravčej. Analytická metóda sa skladal z nasledujúcich krokov: (i) na nástrek vzorky a držanie pri 10% B po dobu 5 minút, (ii) lineárnym gradientom od 10% do 90% B v priebehu 15 minút, (iii) drží na 90% B po dobu 5 minút, (iv) izokratická krok do 10% B a držanie po dobu 5 minút pred ďalšou injekciou vzorky. Hmotnostná spektrometria bola vykonaná na eluentu za použitia ionizácie elektrosprejová (ESI) v pozitívnom iontovom módu s skenovaného rozmedzí m /z od 160-2000.
Lyžuje buniek červených krviniek
hemolytickej aktivity LL-37, WLBU-2 a CSA-13 (0-200 μ
g /ml), proti ľudskej červenej krvinky (RBC) bola testovaná za použitia erytrocytov suspendovaných v PBS. RBC pripravená z čerstvej krvi (hematokrit ~ 5%) boli inkubované po dobu 1 hodiny pri teplote 37 ° C po pridaní testovaných molekúl. Relatívny obsah hemoglobínu v supernatante po odstreďovaní pri 2000 x g bola monitorovaná meraním absorbancie pri 540 nm. 100% hemolýza odfotil zo vzoriek, v ktorých 2% sa pridá Triton X-100
bunkovej kultúre
ľudské bunky adenokarcinóme žalúdka. (ATCC, CRL-1739) boli udržiavané v DMEM (BioWhittaker) kultúry doplnenom 10% teplom -inactivated fetálnym hovädzím sérom (Hyclone) pri 37 ° C a 5% CO 2. Pre LDH test uvoľňovania a vyhodnotenie bunky mikroskopu boli nanesené na 24jamkové doštičky a pestované do zhlukovania. Vo všetkých experimentoch bolo médium zmenené na médium bez séra ~ 12 h pred buniek liečby LL-37, WLBU2 a CSA-13 v jednotlivých jamkách (0-200 ug /ml), po dobu 1 hodiny. Médium pre kultiváciu buniek bola oddelená, centrifugována (10 minút, 5000 rpm, RT) a podrobí sa hodnotiace LD (LDH-test cytotoxicity súpravy; BioVision Inc.)
deklarácia
Poďakovanie
Táto práca bola podporená NIH udeliť HL067286 a Lekárska univerzita Bialystok udeľuje 3-22458F a 3-18714L
Autori ďalej len "pôvodné predložený súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy na autorov pôvodnej predložených súborov pre obrázky. "Pôvodný súbor pre Obrázok 1 12866_2009_858_MOESM2_ESM.pdf autorského 12866_2009_858_MOESM1_ESM.pdf autorov pôvodného súboru na obrázku 2 12866_2009_858_MOESM3_ESM.pdf autorského pôvodného súboru pre obrázok 3 12866_2009_858_MOESM4_ESM.pdf autorov pôvodný súbor na Obrázok 4 pôvodného súboru 12866_2009_858_MOESM5_ESM.pdf autorského na obrázku 5 konkurenčných záujmov
Dr P. Savage je platený konzultant pre Ceragenix Pharmaceuticals, Inc. vrodené imunitný a WittyCell. Žiadny z výskumu uvedeného v tomto dokumente bola podporená Ceragenix Pharmaceuticals alebo akoukoľvek inou právnickou osobou. Ostatné autori: none vyhlásiť
.

• Vyhodnotenie priechodu Lactobacillus Gasser K7 a bifidobaktérií zo žalúdka do čreva za použitia jediného reaktora model
• Balloon-uzavreté retrográdna transvenózny vyhladenie pre žalúdočné varixy: vzťah medzi klinickým výsledkom a gastrorenal derivačný occlusion