Plos ONE: Bakterijski Mikrobiota profiliranje v gastritis brez Helicobacter pylori okužbe ali nesteroidna protivnetna zdravila Use

Povzetek

Zadnji 16S ribosomske RNA genom (rRNA) molekularna profiliranje želodčne sluznice je pokazala presenetljivo kompleksnost mikrobiota. Helicobacter pylori
okužbe in nesteroidno protivnetno zdravilo (NSAID) uporaba sta največ prispevajo k gastritis in čira na želodcu. Vendar pa je malo znanega o pridružitvi med drugimi člani želodca mikrobiote in želodčnih bolezni. V tej študiji, kloniranja in zaporedja na rRNA 16S je bila uporabljena za profil želodčne mikroorganizme iz normalnih in gastritis bolnikov. so bile ugotovljene sto trideset tri phylotypes iz osmih bakterijske debel. Želodec mikrobioto bilo ugotovljeno, da se tesno prilegajo k sluznico. Enajst Streptococcus
phylotypes so uspešno gojijo od biopsije. Eden od dveh rodov predstavljali večino klonov v katerega koli od ugotovljene debel. Dodatno smo razvili dva v realnem času, kvantitativna PCR količinsko relativno obilje na Firmicutes deblu in Streptococcus
rod. Znatno višja številčnost Firmicutes deblu in opazili Streptococcus
rod v Firmicutes deblu pri bolnikih z antralnih gastritis, v primerjavi z običajnimi kontrolami. Ta študija kaže, da lahko raven rod takson v veliki meri predstavljajo veliko višje taksonov kot deblu. Klinični pomen in mehanizem temelji spremenjeno mikrobiota sestavo gastritis zahtevajo nadaljnje funkcionalne študije

Navedba. Li XX, Wong GL-H, Za KF, Wong VW-S, Lai LH, Chow DK-L, et al. (2009) Bakterijska Mikrobiota Profiliranje v gastritis brez Helicobacter pylori
okužba ali nesteroidna protivnetna uživanju drog. PLoS ONE 4 (11): e7985. doi: 10,1371 /journal.pone.0007985

Urednik: Niyaz Ahmed, Univerza v Hyderabad, India

Prejeto: 4. junij, 2009; Sprejeto: 27. oktober 2009; Objavljeno: 24. november 2009

Copyright: © 2009 Li et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo podpira kitajski univerzi v Hong Kongu. Blagajnami imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

komenzalne mikrobioto je sestavni del človeškega bitja [1]. Velika večina mikrobov naseljujejo naša prebavila, z več kot 800 vrst, od devetih bakterij in en archaeal debel. Ta raznolika mikrobiota prispeva k črevesju zorenja [2] [3] [4], prehrana gostitelja in odpornost patogenov [5]. Mikrobi neposredno interakcijo s človeškega gostitelja, ki ga ureja črevesno proliferacijo epitelijskih, skladiščenje maščob in vnetne odzive [3] [6] [7]. Medtem ko se nekateri mikrobi z golimi rokami povzroči resno bolezen, mnogi kronični pogoji so verjetno posledica motenj v celotnem mikrobiote. Na primer, alergije in astma povezana z otroštvu uporabi antibiotikov, ki lahko vplivajo na črevesno mikrobioto [8]. Drugi pogoji, povezani z črevesne mikrobiote vključujejo pozen nastop avtizem [9], vnetne črevesne bolezni [10], in raka [11].

Tradicionalno metode, ki temeljijo na pridelovanje se uporabljajo za pridobivanje mikrobov izolatov za nadaljnjo karakterizacijo. Take študije so temelj naše razumevanje mikrobiologije. Vendar pa je gojenje pogosto delovno intenzivna in lahko ne za več mikrobov. Mikroskopsko opazovanje, se uporablja tudi za oceno številčnosti mikrobov, in v omejenem obsegu, dodeli mikrobov sistematskih skupin [12]. V zadnjem času se 16S ribosomske RNA genov (rRNA) zaporedja profili se uporabljajo za pojasnitev mikrobne raznolikosti, ki so pogosto na ravni phylotype. Uporaba 16S rRNK zaporedja, mikrobi iz ust [13], [14], požiralnik [15], v želodcu [16], tanko črevo [17], colon [18], [19] in vagina [20] so proučevali. Te študije raziskati mikrobne raznolikosti v človeškem telesu in je pokazala veliko populacijo neobdelanih in uncharacterized mikrobov, ki so bile nedosegljiva za metode, ki temelji na pridelavi. S pomočjo teh visoko pretočno 16S rRNA zaporedja in druge metagenomic prizadevanja zaporedja, je bilo ugotovljeno, mikrobiota perturbacije, da je povezana z parodontalne bolezni [21] in debelostjo [22] [23] [24].

V želodcu , želodčna kislost ubije veliko zaužitih mikrobov. splošno se je štelo, da je želodec ni za bivanje noben mikroba do odkritja Helicobacter pylori
in njegova povezava z gastritisom in čira na želodcu [25]. Razen nekaj drugih Helicobacter
vrst [26] [27] [28], ni bilo pričakovati, da bi se želodec vsebuje veliko drugih živih mikrobov. Zmanjšana kislost zaradi postopnega atrofični gastritis lahko poveča mikrobno raznolikost [29]. Študija, ki jo Monstein et al.
Uporabo časovna temperaturni gradient gel elektroforeza (TTGE) in malega 16S rRNA nukleotidov predlagal drugih mikrobov, kot so Enterococcus
, Pseudomonas
Streptococcus
, Staphylococcus
in Stomatococcus
so bili prisotni v želodcu [30] prav. Novejša obsežno 16S rRNA nukleotidov napor prepoznavanje 128 phylotypes od 8 debel v 23 ameriških bolnikih Severne [16]. Zanimivo je, da prisotnost H. pylori
v želodcu ni vplivala na celotno sestavo mikrobiote na ravni deblu.

V tej študiji smo šli še naprej, da razišče morebitne povezave med želodcem sprememb mikrobiota in neširjenju H. pylori
in non-NSAID (NHNN) gastritis. Domnevali smo, da je, ko je H. pylori
ni prisotna, z drugimi bakterijskimi skupinami /vrste lahko prispeva ali je povezana z razvojem gastritis. Na ravni mikrobiote, prav tako bi radi obravnavali ključno vprašanje na področju: na kateri takson globino (e) Ali mikrobiota appear razmeroma stabilno, tako da lahko perturbacije na teh ravneh, pomembni za zdravje ljudi? Uporabili smo 16S rRNK genov kloniranje in zaporedje za profil želodčne mikroorganizme iz normalno in NHNN gastritis bolnikov, in v realnem času kvantitativni PCR (qPCR) teste taksonomsko posebni količinsko relativno številčnost deblu Firmicutes in Streptococcus
genus.

Rezultati

taksona Pojavnost taksona tree analiza

smo analizirali tako telo in antruma biopsije iz 5 zdravih posameznikih in 5 NHNN antralnih gastritis posameznikov (vse ženske, starost ujema) . Vsi bolniki so bili H. pylori
negativen tako hitrim testom sečnine in 16S rRNA sekvenciranja. Nihče od bolnikov so jemali NSAID v 6 mesecih pred doživlja endoskopijo. Vsaj 60 klonov iz vsakega biopsije (telo ali antruma, torej vsaj 120 klonov iz vsakega posameznika) je bilo zaporedje z uporabo široko paleto 16S izdelkov rRNA PCR. Skupaj 1223 ne- H. pylori
mikrobiološke sekvence so bili pridobljeni. Ti mikrobi pripadajo 8 debel (133 phylotypes), od katerih so prisotni v veliki večini 5 debel (Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteia, Fusobacteria in Proteobacteria) (1211 od 1223, oziroma 99,0%). je bilo devet phylotypes s sekvenčno podobnost manjša od 97% do sekvenc, prisotnih v javnih zbirk podatkov. Šest od teh 9 phylotypes je zastopal posameznih klonov (Dodatna tabela S1).

Da bi raziskali splošno zastopanost različnih ravneh taksonomsko v želodcu živih organizmih, smo zgradili taksona drevo (slika 1 in dodatno Slika S1). Zanimivo je, da je bil vsak deblo prevladuje samo ena ali dve nižji ravni taksonomsko (razred, red, družine ali rodu). Kot Dejstvo je, da je bil vsak deblo prevladuje le 1-2 rodov. Na primer, je bil najbolj bogat deblu Firmicutes zastopa 383 klonov, za so ti 333 kloni iz razreda bacilov. Kasneje je bilo 273 kloni od naročila Lactobacillales. Dvesto petdeset štirje kloni so bili iz družine Streptococcaceae. In vsi 254 kloni so bili iz rodu Streptococcus
. Pet Najpogostejši rodovi vključno Streptococcus
(254 klonov), Prevotella
(243), Neisseria
(175), Haemophilus
(122) Porphyromonas
(68), predstavljala 70,5% vseh mikrobov klonov.

Vrste bogastvo in raznolikost

Ko je bil uporabljen celoten nabor podatkov (1223 kloni), je bilo dobro je pokritost 96%, kar pomeni, da se pričakuje štiri dodatne phylotypes za vsakih 100 dodatnih klone mora potekati. Ta stopnja pokritja je pokazala, da so bili prisotni v zaporedjih klonov večina bakterijskih sekvenc. Ocena raznolikost Po ocenah različici 8.0 je navedeno, da je lahko prisotna v vzorcih človeške želodčne biopsijo (Dodatni Slika S2) okoli 200 phylotypes. nadalje smo ocenili bogastvo vrst v štirih različnih biopsijo vzorcev (NMA (Normal antruma), NMB (Normal Body), AGA (antralnih gastritis antruma), AGB (antralnih gastritis Body); Dopolnilni Tabela S2). Vrste bogastvo ne razlikuje med antralnih gastritis biopsije in normalnih biopsije (p > 0,1, neparni t-test)

Bakterijska mikrobiota primerjave med dvema različnima anatomskih lokacijah (antruma in telesa) pri zdravih bolnikih
<. p> v normalnih bolnikih niso opazili pomembne razlike med dvema anatomskih lokacijah (antruma in telesa), za katerega koli od taksonomsko skupin, razen za družinske Prevotellaceae in rodu Prevotella
kjer so p vrednosti (chi Pearson kvadratne in pravokotne test) je bila od 0,01 do 0,05 (slika 1).

Firmicutes deblo in Streptococcus
rod so obogatili v želodcu bolniki antralnih gastritis

Glede na 1223 16S rRNA sekvenc, je Firmicutes deblo najbolj bogat deblo s 383 klonov. Proteobacteria deblo je bilo blizu drugega z 345 kloni. Zanimivo je, da je bil Firmicutes deblo bolj bogat v antralnih gastritis biopsije kot v normalnih biopsije (41% v primerjavi z 22%, tabela 1), medtem ko je bil Proteobacteria deblo bolj bogat v normalnih biopsije (37% v primerjavi z 20%). Ker 16S rRNA zaporedja je stroškovno previsoki za večje velikosti vzorca, smo razvili v realnem času kvantitativni PCR (qPCR) pristop takson posamezne količinsko obilo Firmicutes in Streptococcus
(slika 2). Podatki o taksonomsko posebni qPCR za Firmicutes so bili tesno povezani s podatki sekvenc 16S rRNA za omenjenih 20 biopsijo vzorcev (2 biopsije za vsako od 5 normalno in 5 bolnikov antralnih gastritis) (Dodatni Slika S3).

sedemnajst dodatnih parov antruma telesa in biopsijo vzorcih iz normalnih bolnikov in 18 dodatnih parov antruma telesa in biopsijo vzorcev iz bolnikov antralnih gastritis smo analizirali s Firmicutes specifične qPCR. Popolnoma je bilo 90 biopsije (46 vzorcev iz bolnikov gastritis 23 antralnih in 44 vzorcev iz 22 običajnih bolnikov) analizirali (tabela 2). Povprečna starost bolnikov antralnih gastritis je bila 67,6 ± 11,4 (mediana: 69, razpon: 46-86), medtem ko je bila povprečna starost kontrol 58,3 ± 14,7 (mediana: 52, razpon: 40 do 87). Povprečna starost normalne skupine bila mlajša kot je antralnih gastritis skupino. Toda statistična analiza je pokazala, da je bilo med starostjo in Firmicutes ali nobene povezave Streptococcus
številčnost (p > 0.1) (Dodatni Slika S4). Ti vzorci so bili razdeljeni v 4 skupine, antralnih gastritis antruma (AGA), antralnih gastritis telesa (AGB), normalno antruma (NMA), in normalno telesa (NMB). Številčnost Firmicutes bil AGA bistveno višja kot v NMA ali NMB (One-way ANOVA (analiza variance) test, p = 0,004 in p = 0,046, oziroma) in v AGB kot v NMA (v eno smer ANOVA, p = 0,039 ) (slika 3A). Ni bistvene razlike je opaziti med AGA in AGB (eden od načinov, ANOVA, p = 0,855), ali NMA in NMB (p = 0,832).

Iz istih biopsijo vzorcev, rod Streptococcus
analizirali smo tudi Streptococcus
-specifična qPCR. Streptococcus
številčnost je bila 72% in AGA vs NMA ali NMB, oziroma 76% višja, in 66% in 70% višji v AGB vs. NMA ali NMB, v tem zaporedju (slika 3B). Vrednosti p za test ANOVA so prikazani na sliki 3B. Podobno kot pri testu Firmicutes niso opazili pomembne razlike med AGA in AGB (eden od načinov, ANOVA, p = 0,999), ali NMA in NMB (p = 0,999).

Streptococcus
gojenje in biopsija pralni

sama detekcija 16S rRNA zaporedij genov ne pomeni, da žive bakterije so prisotne ali bakterije so dejansko prebivališče namesto mimoidoče v želodcu. Tako smo izvedli dve dodatni poskuse.

Najprej smo poskušali gojenje bakterije iz biopsije. Kultura pogoj primeren za Streptococcus
je bila uporabljena, saj se je zdelo, da je preveč zastopani pri bolnikih antralnih gastritis. Šestnajst parov (antruma in telo) iz biopsije so bili uporabljeni za kulturo na krvni agar plošč. Kolonije smo sekvencirali za 16S rRNA gena za identifikacijo. Enajst phylotypes za Streptococcus
so izolirane (Dodatni Tabela S3). Ti 11 phylotypes predstavljal 93,3% (ali 237 iz 254 klonov) vseh klonov, opredeljenih v široko paleto 16S rRNA sekvenciranje, kar kaže, da večino Streptococcus
phylotypes živi v želodcu biopsije.

Po drugi strani je bilo 14 biopsije vzorci tako antralnih gastritis in običajnih bolnikih opere v fosfatnim pufrom (PBS), s tremi bolj težkih pogojih. Če ostre pralni pogoji ne odstrani bakterije iz biopsije, pa kažeta, da te bakterije tesno pritrdite na želodčno sluznico. Več kot 90% vseh bakterij ostala pritrjena na biopsije po treh zaporednih izpiranjem z vse bolj zaostrenih razmer (Dodatni Slika S5A). Zadnji pralni korak je bila narejena na visoki moči na namizju vrtinca stroj. Prav tako večina Streptococcus
bakterije ostala pritrjena na biopsije po 3 korakih spiranja (Dodatna slika S5B).

Pogovor

V tej študiji smo profilirana the bakterijska mikrobiota v parnih želodca biopsije (antruma in telesa) od običajnih in antralnih bolnikov gastritis. Vsi bolniki so H. pylori
negativna in brez uporabe nesteroidnih protivnetnih zdravil. Skozi široko paleto 16S rRNA zaporedja genov, smo ugotovili 1.223 ne- H pylori
bakterije klonov, podobno kot prejšnje študije (bik študijo 1056 ne- H pylori
bakterije kloni) [16 ]. Čeprav sta dve študiji analizirali dva geografsko (Hong Kong proti Kaliforniji) in etnično (kitajski vs. kavkaških, Latinoameričanih in African American) različnih populacij, splošne mikrobiota zapletenost so presenetljivo podobni (tabela 3). Obe študiji opredeljen približno 130 (133 in 127 za to in študija Bik, v tem zaporedju) phylotypes od sedem do osem debel. Večina klonov (77,4% te študije in 79,8% od bik študije) so v skupni rabi. Dve najpogostejši rodovi ( Streptococcus
in Prevotella
) so tudi enaki. Ta dva rodova predstavljala 40,6% in 41,5% vseh klonov v tej študiji in študije bik. Obe študiji so pokazali, da so lahko prisotne v želodčne sluznice približno 200 različnih phylotypes. Takšna dramatično podobnost med obema študij opozarja na selektivni pritisk mikroorganizmov pod kruto želodcu okolje. Poleg tega smo našli majhno razliko v bakterijskih mikrobiote med anatomskih mestih (antruma in telesa) pri zdravih bolnikih, kljub kliničnega pomena za vzorčenje biopsijo na različnih anatomskih mestih [31].

Glede na to, da stroga pralni koraki niso mogli ločiti mikroorganizme iz biopsije, smo hipotezo, da se večina ugotovljenih bakterij tesno povezana z želodčno sluznico. Poleg tega smo lahko gojiti večino Streptococcus
phylotypes identificirati s pomočjo širokega dosega 16S rRNA sekvenciranje, kar pomeni, da lahko te bakterije dejansko pravi prebivalci v želodčne sluznice.

Da bi še bolj cenili celotna kompleksnost želodčne mikrobiote, smo zgradili taksona drevo, ki temelji na ugotovljenih klonov pogledati v vsaki ravni sistematske skupine, vključno z deblo, razred, red, družine in rodu. Zanimivo je, da smo ugotovili, da so za vsak deblu eno ali dve rodovi pretežno prisoten. Pet Najpogostejši rodovi vključno Streptococcus
(deblo Firmicutes), Prevotella
in Porphyromonas
(Bacteroidetes), kakor tudi Neisseria
in Haemophilus
(Proteobacteria), predstavljala 70,5% vseh mikrobov klonov.

Zanimivo je, da 16S rRNA profiliranje pokazala veliko previsoka, zastopanje Firmicutes deblu (predvsem zaradi prevelike zastopanosti od Streptococcus
rod v deblu) in zastopanosti deblu Proteobacteria v biopsijah od bolnikov antralnih gastritis. Razvili smo qPCR pristop taksonomsko specifični za analizo obilo v Firmicutes in streptococcus
taksoni 90 biopsije (46 vzorcev iz 23 bolnikov antralnih gastritis in 44 vzorcev iz 22 običajnih bolnikov) in je potrdil preko zastopanosti teh dveh taksonov v antralnih gastritis želodcu za 42% in 71%, v tem zaporedju. Večina Streptococcus
phylotypes identificirane sekvenciranje so alfa-hemolitični bakterije, ki so potencialni povzročitelji bolezni (npr Streptococcus pneumoniae
, Streptococcus mitis
in Streptococcus salivarius
). Nekatere Streptococcus
vrste so odporne na nizke pH pogoji in lahko preživijo v želodcu [32]. Naši podatki o pridelavi in ​​pranje eksperiment je tudi predlagal, da so to res živi, ​​živi organizmi, s stalnim prebivališčem v želodcu.

Ali je povečanje Streptococcus
številčnost je povzročitelj za antralnih gastritis ali zaradi lokalnih okoljskih sprememb zaradi antralnih gastritis ostalo je treba odgovoriti. Ena od možnih pristop uporablja kalčkov brez modela miške [33]. Še en zanimiv vprašanje je, da če določeni mikrobiote kompozicije zaščito, ali pa, senzibilizirati želodčno sluznico pred napadom patogenov, kot so H. pylori
. Nazadnje, nove tehnologije za določanje zaporedja visoko zmogljivimi verjetno, da zagotovi bolj izčrpne podatke o mikrobiote iz različnih anatomskih lokacijah ob človeškem prebavnem traktu in v različnih časovnih točkah [34].

Materiali in metode

želodcu biopsije vzorci

Ta študija je bila odobrena s kitajske univerze v Hongkongu klinične raziskave etika odbora. Vsi bolniki so dali pisno privolitev za pridobitev študijskih primerkov. Dve želodca biopsije sluznice (antruma in telo želodca) so bili zbrani iz vsakega bolnika v času rednega endoskopijo na princa bolnišnice Wales, Hong Kong. Da bi se izognili kontaminaciji, je nov sterilizirani endoskopijo klešče pri sprejemanju drugega biopsijo iz istega bolnik. Biopsije sta zaskočni zamrznjene na suhem ledu in shranimo pri -80 ° C. Bolniki, ki jemljejo antibiotike ali nesteroidna protivnetna zdravila (opredeljeno kot kakršno koli uporabo NSAID za vsaj en teden v zadnjih 3 mesecih pred endoskopija) ali testiranih pozitiven H. pylori
s hitrim testom ureaze (kolesnice) ali histološko testu so bili izključeni. demografija bolnik je prikazano v tabeli 2.

Gradnja 16S rRNA klon knjižnicam in zaporedja

Skupaj genomske DNA smo izolirali iz biopsije s pomočjo DNA mini kit (Qiagen, Valencia, CA, ZDA ) s steklom sredini metodo udarne kot je opisano predhodno [16]. Dva negativne kontrole s samo sterilno vodo ekstrahiramo tudi z uporabo istega protokola. Ekstrahirane koncentracije DNA smo merili z NanoDrop 1000 spektrometra (Thermo Scientific, Minneapolis, MN, ZDA). Dva univerzalne bakterijske 16S rRNA primerji, B8F20 [35] (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') in B806R20 [36] (5'GGACTACCAGGGTATCTAAT-3') so bili uporabljeni za pomnoževanje regijo, ki ustreza položaju od 8 do 806 od Escherichia coli
16S rRNA gena. 25 xl PCR mešanice vključena 1 x PCR pufra vključno 1,5 mM MgCl _{2 (Qiagen), 20 mM tetrametilamonijevega klorida, 0,1 mM vsakega dNTP, 0,4 uM vsakega temeljnega premaza, 1 enoto polimeraze Hotstar Taq DNA (Qiagen), in 2 xl ekstrahirali DNK. PCR trideset cikla je bila izvedena za pomnoževanje 799 bp fragment. PCR produkt smo preverili z agarozno gelsko elektroforezo. Za vsak izdelek se lahko vsaka skupina se opazuje pod UV svetlobo, medtem ko ni bilo glasbenega opazili za negativne kontrole. Izdelke 16S rRNA smo očistili z Sephadex G-50 koloni (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA), ligiranem z vektorji T spremenjen v E. coli
JM109 celice z uporabo preprost vektorske sistem pGEM-T (Promega, Madison, WI, ZDA). Izbrali smo 5 bolnikov (10 biopsije vzorcev) z antralnih gastritis in 5 običajnih kontrol (10 biopsije vzorcev) za gradnjo 20 16S rRNA genov knjižnice. Za vsako želodca biopsijo knjižnico, je bilo izbranih najmanj 60 kolonij za sekvenciranje. PCR produkt so sekvenco s pomočjo BigDye terminator V3.1 cikla zaporedja komplet (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA). Glede na zaporedje reakcij, ki uporabljajo B8F20 kot zaporedja temeljni premaz so bile opravljene na ABI 3730xl sekvencer (Applied Biosystems)}

filogenetsko analizo in mikrobna raznolikost ocena

Himerni test z uporabo s strežnikom Belerofont (http.: //foo.maths.uq.edu.au/~huber/bellerophon.pl) [37] je bila uporabljena za testiranje potencialnih kimerne sekvence. En klon bilo ugotovljeno, da je himerni in nato izključen. Nato so bile 1223 nonchimeric sequences analizirali s PRP II (ribosomne ​​Database Project II) klasifikator (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp), ki temelji na naivni Bayesov rRNA razvrščanje [38]. Temeljna lokalna orodje tudi za usklajevanje (BLAST), ki jih zelene genov (http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-blast_interface.cgi) je bila izvedena, da bi našli najbolj podobne posnetkov v zbirki podatkov. Uporabili smo 97% sekvenčno identiteto kot cutoff za opredeljujejo phylotypes [39]. Sequences with identitete < 97% na obstoječih sekvenc v zbirki podatkov so bile upoštevane roman. Taksona drevo je bila zgrajena s pomočjo rezultata tajnosti razvrščevalec RPD II. Chao1 cenilko od 8 programa ocen (http://viceroy.eeb.uconn.edu/estimates~~HEAD=pobj) je bila uporabljena za oceno mikrobne raznolikosti. Dobra metoda je bila uporabljena za izračun zaporedja pokritosti [40].

Sprotna kvantitativne PCR (qPCR)

primerji in sonde Q-PCR so bili oblikovani na podlagi zaporedij pridobljenih iz kloniranih knjižnic. Najprej smo uskladiti vse klonirane sekvence po ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) s privzetimi parametri. Je qPCR primerji so bili B8F20 in B801R21 (5'ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3 '). zaporedja MGB sond so: splošno sonda (VIC) 5'CAGCAGCCGCGGTAA-3 ', Firmicutes sonda (FAM) 5'AAGATTCCCTACTGCTGCCT-3' in Streptococcus
sonda (FAM) 5'TACACATGGAATTCCAC-3 ' . Za merjenje obilo določenega taksona, dve sondi (ena posebna za taksona obresti in druge splošne za vse bakterije), ki so bile uporabljene v isti PCR pomnožkov. (Slika 2). Mešanica 25 xl PCR vključen 1 x Buffer A, 3,5 mM MgCl _{2, 200 uM dNTP z dUTP namesto DTTP, 400 nM vsakega temeljni premaz, 100 Nm vsake sonde, 0.01 U /xl uracil-N-glikozilazo, in 0.05 U /xl TaqGold (Applied Biosystems). Za Firmicutes specifične testu je bila kolesarske pogoj: 1) 50 ° C za 2 min; 2) 95 ° C za 10 minut; 3) 40 ciklov 95 ° C za 20 sekund, 58 ° C za 15 sekund, 70 ° C za 80 sekund. Za Streptococcus
-specifične test, je bil kolesarski pogoj: 1) 50 ° C za 2 min; 2) 95 ° C za 10 minut; 3) 40 ciklov 95 ° C za 20 sekund, 57 ° C, 1 minuto, 70 ° C za 1 minuto. Streptococcus
16S rRNA del (DQ346438) klonirali v enostavno vektor pGEM-T je bila uporabljena kot standard za qPCR (tako za Firmicutes in Streptococcus
testi) v ABI 7500 realno -time sistem PCR (Applied Biosystems). Predvsem zaradi majhne razlike med generičnimi in taksonomsko specifičnih sond, je delta delta prag cikel (ddCt) uporablja za označevanje obilo posebnega taksona v celotnem populacije bakterij (Ct TSU. Ct taksonomsko specifično sondo iz neznani vzorci, Ct BUU: Ct bakterijske univerzalne sonde iz neznanih vzorcev, Ct TSS: Ct taksonomsko specifično sondo iz standarda plazmida, Ct BSS: Ct bakterijske univerzalne sonde od standarda plazmida)}

Teoretično številčnost taksona 2 ^-ddCt.

Streptococcus
Gojenje

smo pridobili 32 dodatnih biopsije od 16 bolnikov za bakterijske kulture. Biopsije so bili dani v fosfatnim pufrom (PBS, pH = 7,2) in narežemo na manjše kose s skalpelom. Vzorci so bili nato razširil na krvni agar plošče (CM331, Oxoid, Basingstoke, Velika Britanija) s 5% konjske krvi. Ploščice smo dali v 5% CO _{2 inkubator pri 37 ° C 24 ur. Kolonije z hemolize na krvnem agarju so pobrali za 16S rRNA sekvenciranje.}

Biopsija pralni

Za biopsija pralni testu, smo zbrali 14 dodatnih vzorcev iz obeh antralnih bolnikov gastritis in normalni ljudje. Vsak vzorec damo v ml epruveto 2,0 in speremo 3-krat (200 u.l PBS za vsako pranje) pod bolj težkih pogojih. Prvo pranje je bilo izvedeno z nežno roko stresanjem. Supernatant smo prenesli ven. Novi PBS dodamo k biopsije za nadaljnje pranje. Za drugo in tretje pranje, so cevi vrtinčimo s cev mešalnika Trio TM-2F (All-lab znanstveni, AU), ki velja ob 3. stopnje in stopnje 6 močjo, oziroma, v grobem ustreza nežno in živahno vortexing. Potem je duplex PCR v realnem času izvedli preizkusiti skupno bakterije in Streptococcus
količine v supernatantih PBS iz treh korakih spiranja in opranih biopsij.

Statistika analiza

Pearsonov hi-kvadrat test je bil uporabljen za primerjavo števila klon različnih taksonov med različnimi vzorčnimi skupinami (NMA: normalno antruma, NMB: normalno telo, AGA: antralnih gastritis antruma, AGB: antralnih gastritis telo) iz zaporedja rezultata 16S rRNA, ko je bilo število klon za vsako skupino vzorca vsaj 10 je ANOVA preizkus se uporablja za primerjavo podatkov bakterijske številčnost qPCR testih. Vse analize so bile opravljene z uporabo SPSS za Windows, različice 11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P < 0,05 štelo statistično značilne. Za primerjavo vrstno bogastvo med normalnimi in antralnih bolnikov gastritis, je dejansko število phylotype za vsakega bolnika šteje prvi. Neparni t-test je bil nato uporabljen za primerjavo dveh skupin bolnikov.

Podpora Informacije
Slika S1.
Podroben takson tree
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s001
(2,00 MB TIF)
Slika S2.
vrste bogastvo ocena
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s002
(0,97 MB TIF)
Slika S3.
Korelacija med qPCR in 16S rRNA kloniranja in sekvenciranja
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s003
(0,98 MB IOD)
Slika S4.
Pomanjkanje povezanosti med starostjo bolnika in Firmicutes ali Streptococcus izobilju
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s004
(2,01 MB IOD)
sliki S5.
Harsh pranje ne odstrani bakterije iz biopsije
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s005
(1,90 MB TIF)
Tabela S1.
Novel phyltoypes
doi: 10.1371 /journal.pone.0007985.s006
(0,03 MB XLS)
Tabela S2.
vrste bogastvo ocena v različnih biopsijo vzorcih
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s007
(0,02 MB XLS)
Tabela S3.
doi: 10,1371 /journal.pone.0007985.s008
(0,02 MB XLS)

• Plos ONE: Okrepljeno M1 makrofagne Polarizacija v Human Helicobacter pylori, pridruženi atrofični gastritis in cepljenimi miši
• Plos ONE: Izocitrat dehidrogenaza Helicobacter pylori Morebitno povzroča humoralnega imunskega odziva pri osebah z peptičnega in gastritis