Identifiering av giltiga referens gener för genuttryck studier av human magcancer genom omvänd transkription-qPCR

Identifiering av giltiga referens gener för genuttryck studier av human magcancer genom omvänd transkription-qPCR Bild Sammanfattning
Bakgrund
Omvänd transkription kvantitativ realtids-polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) är en kraftfull metod för analys av genuttryck. Målgenuttryck nivåer är vanligtvis normaliserad till en konsekvent uttryckt referens gen också känd som intern standard, i samma prov. Dock har stora ansträngningar inte lagts ned så långt i sökandet efter referens gener som är lämpliga för studier av magcancer med hjälp av RT-qPCR, även om val av optimala referens gener är avgörande för tolkningen av resultaten.
Metoder
Vi bedömde lämpligheten av sex möjliga referens gener, beta-aktin (ACTB), glyceraldehydes-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH), hypoxantinfosforibosyltransferas en (HPRT1), beta-2-mikroglobulin (B2M), ribosomala subenheten L29 (RPL29) och 18S ribosomalt RNA (18S rRNA) i 20 normala och tumör magen vävnad par cancerpatienter magen och 6 magen cancercellinjer genom RT-qPCR. . Användning av uttrycket stabilitetsanalyser använder NormFinder och geNorm algoritmer vi bestämde ordning prestanda hos dessa referens gener och deras variationsvärden
Resultat Review, är detta RT-qPCR studie visade att det finns statistiskt signifikant (p Hotel < 0,05 ) skillnader i uttrycksnivåer av HPRT1 och 18S rRNA i "normal-" kontra "tumör magen vävnader". Stabiliteten analyser av geNorm föreslår B2M-GAPDH, som bäst referens gen kombination för "magen cancercellinjer"; RPL29-HPRT1, för "alla magen vävnader"; och ACTB-18S rRNA, för "alla magen cellinjer och vävnader. NormFinder identifierade också B2M som den bästa referens genen för "magen cancercellinjer", RPL29-B2M för "alla magen vävnader" och 18S rRNA-ACTB för "alla magen cellinjer och vävnader". Jämförelserna av normaliserade uttryck av målgenen, GPNMB visade annan tolkning av målgenuttryck beror på bästa enda referens gen eller kombination.
Slutsats
Denna studie validerade RPL29 och RPL29-B2M som den bästa enskilda referensgener och kombination, för RT-qPCR analys av "alla magen vävnader", och B2M och B2M-GAPDH som den bästa enda referens genen och kombination, för "magen cancercellinjer". Användning av dessa validerade referensgener bör ge mer exakta tolkningen av differential genuttryck på transkriptionsnivå i magcancer.
Bakgrund
Omvänd transkription kvantitativ realtids-polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) är ett kraftfullt verktyg för att validera observerade genuttryck skillnader, på grund av dess större känslighet och specificitet. I traditionella genuttryck studier, är en "referens gen", även kallad "intern standard" eller "housekeepinggen" som används för normalisering. Uttrycket av beta-aktin (ACTB) och glyceraldehydes-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH), som används i de flesta studier [1], rapporterades variera med experimentella betingelser [2] och klinisk status av vävnaden studerade (t.ex.
astma), vilket gör dessa gener olämpliga som interna standarder för användning i normaliseringen av genuttryck [3]. . Således är avgörande för att undvika risken att misstolka data och ogiltiga slutsatser giltigheten av referensgenen valdes för statistisk analys [4]
Det föreslogs att åtminstone tre aspekter bör beaktas vid valet av en referens gen: 1) beständigheten i dess uttryck genom hela ingripande, 2) dess förstärkning effektivitet och 3) dess överflöd, som bör vara liknande den för generna av intresse [5]. Dessutom, för att säkerställa relevans, noggrannhet och korrekta tolkningar av RT-qPCR, rekommenderas det att de exakta riktlinjer för RT-qPCR MIQE (Minimum Information för publicering av kvantitativ realtids-PCR-experiment) bör följas [6] . Flera verktyg för statistisk analys såsom NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] har utvecklats för att hjälpa till i valet av lämpliga referensgener. Dessa verktyg bedöma variationer i uttrycket av ett antal potentiella referens gener och föreslå vilka referens gen (er) är lämplig för normalisering av genuttryck data i en given studie.
Stomachcancer är den fjärde vanligaste cancerformen i världen, med en rapporterade 934,000 fall i 2002 [10]. Överlevnad av magcancer är dålig eftersom patienterna ofta diagnostiseras först när sjukdomen redan har ökat betydligt [11], vilket gör tidig upptäckt mycket viktig. Screening syftar till tidig upptäckt innebär endoskopisk undersökning. För att bekräfta närvaron av cancer, är biopsier tas från misstänkta vävnader och utsattes för RT-qPCR att bekräfta onormalt uttryck av cancerrelaterade gener. Men lämpliga referensgener måste identifieras för meningsfulla jämförelser mellan uttryck av normal kontra cancergener. Referens gener har beskrivits för RT-qPCR studier i olika cancer i andra vävnader [1, 12-21]. Men det verkar inte finnas någon enighet om referensgener för genuttryck studier i magcancer. Vi sökte därför PubMed med MeSH-termer "magcancer", "realtid", och "PCR". I en utvärdering av 115 artiklar publicerade från maj 2007 till november 2009, fann vi att GAPDH (53 fall, 46,1%) och ACTB (41 fall, 35,7%) var de mest använda referens gener i gastriska cancerstudier; följt av 18S rRNA (8 fall, 7,0%), beta-2-mikroglobulin (B2M, 3 fall, 2,6%), hypoxantinfosforibosyltransferas 1 (HPRT1, 2cases, 1,7%), TATA-bindande protein (TBP, ett fall; 0,9 %), och beta-tubulin (Tubb, ett fall, 0,9%). I fem fall (4,3%), var standardkurva extern används för absolut kvantifiering (AQ) i stället för normaliserat värde genom referens gen.
Aktuella studien har därför utformats för att hitta de bästa referens gener för genuttryck studier i magcancer . I denna studie undersökte vi de fem referens gener som har gener som oftast används i magen cancerstudier (ACTB, GAPDH, B2M, 18S rRNA, och HPRT1) och för jämförelse, RPL29, en referens gen som används i andra studier cancerpatienter, i "icke-magcancer cellinjer", "magcancer cellinjer", "normala magen vävnader" och "tumör magen vävnader" (tabell 1). För att välja den mest lämpliga referensgenen från ovanstående lista, vi jämförde uttryck för glykoprotein NMB (GPNMB), vår målgenen, med de i ovan nämnda lista över möjliga "referens" genes.Table 1 Potentiella referens gener utvärderades i denna studie.
Gene symbol
GenBank tillgänglighetsnummer
Gene namn
Genomisk lokalisering

Beskrivning
ACTB
NM_001101
Beta-aktin
7p15-12
cytoskelettala strukturprotein
GAPDH
NM_002046
glyceraldehyd-3- fosfatdehydrogenas
12p13
oxidoreduktas i glykolys och glukoneogenes
HPRT1
NM_000194
hypoxantinfosforibosyltransferas en
Xq26
Metabolic bärgning av puriner
B2M
NM_004048
Beta-2-mikroglobulin
15q21.1
Beta-kedjan av MHC-klass i-molekyler
18S rRNA
NR_003286
18S ribosomalt RNA
22p12
ribosom-subenheten
RPL29
NM_00992
Ribosomalt protein L29
3p21.3-p21.2
Strukturell beståndsdel i ribosomen
GPNMB
NM_001005340
glykoprotein (transmembran) nmb
7p15

• In silico analys av magcancer serieanalys av genuttryck bibliotek avslöjar olika profiler i samband med ethnicity
• Adjuvant chemo-strålning för adenocarcinom: en institutionell experience