PLoS ONE: Histone Deacetylase HDAC4 fördert Magenkrebs SGC-7901-Zellen Progression über p21 Repressions

Abstrakt

Magenkrebs (GC) ist eine der führenden Ursachen von Krebs Tod in der Welt. Die Rolle der Histon-Deacetylase 4 (HDAC4) in spezifischer Zell- und Gewebetypen identifiziert worden. Jedoch bleiben seine biologische Rolle bei der Entwicklung von Magenkrebs weitgehend unerforscht. Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) und Western-Blot wurden verwendet, um die Expression von HDAC4 in den klinischen Proben zu analysieren. siRNA und Überexpression von HDAC4 und siRNA p21 wurden verwendet funktionellen Effekte in einer Proliferation zu untersuchen, wurde eine Koloniebildung, ein Adenosin-5'-triphosphat (ATP) -Assay und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Generation, Zellzyklus, Zellapoptose Raten und autophagy Assays. HDAC4 wurde hochreguliert bei Magenkrebs Gewebe und mehrere Magenkrebs-Zelllinien. Die Proliferation, Koloniebildungsfähigkeit und ATP-Spiegel wurden in HDAC4 Überexpression SGC-7901-Zellen verbessert, aber in HDAC4 SGC-7901-Knockdown-Zellen gehemmt. HDAC4 Knockdown führte zu G0 /G1-Phase Zellarrest und verursachte Apoptose und ROS Anstieg. Darüber hinaus wurde HDAC4 gefunden p21-Expression in Magenkrebs SGC-7901-Zellen hemmen. p21 Knockdown dramatisch Zellproliferationshemmung, Zellzyklusarrest, Zell-Apoptose Förderung und Autophagie Hochregulation in HDAC4-siRNA SGC-7901-Zellen abgeschwächt. Wir haben gezeigt, dass HDAC4 Magenkrebszellprogression fördert durch die Repression von p21 vermittelt. Unsere Ergebnisse liefern eine experimentelle Grundlage für das Verständnis der pro-Tumormechanismus HDAC4 als Behandlung für Magenkrebs

Citation. Kang Z-H, Wang C-Y, Zhang W-L, Zhang J-T, Yuan C-H, Zhao P-W, et al. (2014) Histone Deacetylase HDAC4 fördert Magenkrebs SGC-7901-Zellen Progression über p21 Repression. PLoS ONE 9 (6): e98894. doi: 10.1371 /journal.pone.0098894

Editor: Wei-Guo Zhu, der Universität Peking Health Science Center, China

Empfangen: 12. Februar 2014; Akzeptiert: 8. Mai 2014; Veröffentlicht am: 4. Juni 2014

Copyright: © 2014 Kang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Gesundheitsamt der Provinz Jilin (Nr 2012z119) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die vierthäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste Ursache für Krebstod weltweit [1]. Asiatischen und südamerikanischen Ländern haben eine höhere Inzidenz von GC als die Vereinigten Staaten und Westeuropa [2]. Die meisten zielgerichtete Therapien konzentrieren sich auf den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) bezogenen Angaben in fortgeschrittenen GC. Verbindungen gegen neue Ziele, wie mTOR [3], c-Met (Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor) [4], und HDACs sind ebenfalls untersucht.

Histone Deacetylase 4 (HDAC4), die eine Klasse IIa HDAC, ist bekannt, in verschiedenen Transkriptions corepressor Komplexe existieren. HDAC4 ist eine kritische Komponente der DNA-Schädigung Reaktionsweges, der durch 53BP1 wirkt [5]. HDAC4 reprimiert die Expression des Cyclin-abhängigen Kinaseinhibitors p21 (auch bekannt als p21WAF1 /Cip1) in menschlichen Krebszellen durch eine Sp1-abhängige, p53-unabhängigen Mechanismus [6]. HDAC4 fördert das Wachstum von Dickdarmkrebszellen über Repression von p21 [7]. Die Inaktivierung von HDAC4 von small interfering RNA oder HDAC-Inhibitoren unterdrückt neuronalen Zelltod [8].

Die Rolle der HDAC4 in bestimmten Zellen (HeLa (Gebärmutterhalskrebs), U373 (Gliom), OVCAR (Eierstockkrebs), T98G ( Gliom), HCT116 (kolorektalen), NHA (astrozytären) und SKBR3 (Brust)) und Geweben (Hirnrinde, Hoden, Prostata, und die epidermalen Schicht der Haut) wird immer klarer [9]. Allerdings hat sich der genaue Mechanismus der HDAC4 bei Magenkrebs nicht bestimmt worden. Daher war das Ziel dieser Studie zunächst die Expressionsniveaus von HDAC4 in menschlichen Magenkrebsgewebe und Zelllinien zu bewerten. Zweitens wurde die Wirkung von HDAC4 auf Magenkrebszelllinien unter Verwendung von Überexpression und Zuschlagssucht. Schließlich untersuchten wir, ob HDAC4 eine Beziehung mit p21 in Magenkrebszellen hatten. Gemeinsam war unser Ziel, festzustellen, ob HDAC4 eine biologische Rolle bei der GC Entwicklung hat und den zugrundeliegenden Mechanismus aufzuklären.

Materialien und Methoden

Gewebeproben

Neunundzwanzig gepaart während der Routine therapeutischen Chirurgie in der Abteilung für Magen-Darm-Chirurgie, das erste Krankenhaus der Universität Jilin: primäre Magenkarzinom Gewebe und entfernten normalen Magen-Gewebe wurden von Patienten (58,46 ± 9,17 Jahre alt) gesammelt. Alle Proben wurden mit informierte Zustimmung erhalten nach der Deklaration von Helsinki und von der Human-Ethikkommission des ersten Krankenhaus der Universität Jilin und Jilin University, VR China genehmigt. Eine schriftliche Einverständniserklärung von allen Teilnehmern erhalten.

Zelllinien und Kultur

Die menschlichen Magenkrebszelllinien SGC-7901, AGS und BGC-823 und die normale Magen-Epithel-Zelllinie GES waren erhalten von der American Type Culture Collection (Manassas, VA) und kultiviert in RPMI-1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _{2 bei 37 ° C.}

Stable transfizierte Zelllinie und transiente Transfektion

Das HDAC4 Fragment voller Länge wurde durch reverse Transkriptions-PCR von GES Zellen amplifiziert, die spezifischen Primern, wie zuvor beschrieben [10] und in die BamH I und Hind III-Stellen von pcDNA3.1 (+ ) (Clontech, Hampshire, UK). Der pcDNA3.1 (+) - HDAC4 Plasmid wurde durch Sequenzanalyse verifiziert die Abwesenheit von Mutationen zu bestätigen. SGC-7901-Zellen wurden in 6-well Platten ausgesät und transfiziert mit dem pcDNA3.1 (+) - HDAC4 und pcDNA3.1 (+) - Vektoren, die jeweils unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) nach den Anweisungen bereitgestellt vom Hersteller für 24 h ohne antibiotische Selektion. Dann wurden die Zellen, die in Medium, enthaltend 400 ug /ml G418 (Sigma, St. Louis, MO), bis alle Zellen in der nicht-transfizierten Kontrollkultur wurden getötet.

SGC-7901-Zellen wurden ausgesät auf 6-Well-Platten und dann mit nicht-Targeting-siRNA oder siRNA gegen menschliche HDAC4 oder p21 (Santa Cruz) unter Verwendung von Lipofectamin 2000 gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Stretch-Experimente wurden an Zellen 48 oder 72 h nach der Transfektion durchgeführt.

RNA-Isolierung und quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)

Gesamt-RNA wurde isoliert aus Geweben oder Zellen durch Trizolreagenz ( Invitrogen) und Reverse Transkriptionen wurden mit dem Takara RNA-PCR-Kits (Takara, Dalian, China durchgeführt) nach den Anweisungen des Herstellers. Quantitative PCR wurde unter Verwendung eines SYBR Green Premix Ex Taq (Takara, Japan) in einem Echtzeit-PCR-System (Eppendorf, Deutschland) durchgeführt. Die relative Expressionsverhältnis in jedem gepaart Tumor und Nicht-Tumorgewebe durch den 2 ^{-ΔΔCT-Methode berechnet wurde.}

Zellzählung Kit-8 (CCK-8) Assay

Die Wucherungen der SGC-7901-Zellen wurden unter Verwendung eines CCK-8-Assay (Beyotime, Jiangsu, China) nach dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll bewertet. Kurz gesagt wurden die Zellen pro Vertiefung in einer Konzentration von 2000 Zellen in einer 96-Well-Platte kultiviert. Bei 0, 1, 2 und 3 Tage nach der Transfektion wurde die Zellproliferationsassay durch die Zugabe von 10 ul CCK8-Lösung zu jeder Vertiefung, gefolgt von Inkubation bei 37 ° C für 2 h durchgeführt. Die Extinktion wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem ELISA-Lesegerät gemessen.

Koloniebildungstest

Kurz gesagt, die HDAC4-überexprimierende und -knockdown SGC-7901-Zellen wurden in dreifacher Ausführung ausgesät (1000 Zellen pro 60 mm-Kulturschale) und zwei Wochen lang bei 37 ° C inkubiert, um Klone zu bilden. Die Zellen wurden für 15 min mit PBS, mit 4% Paraformaldehyd gewaschen und mit Kristallviolett (0,5% Kristallviolett, 1% Paraformaldehyd und 20% Methanol in PBS) für 30 min gefärbt. Die Kolonien auf jeder Platte wurden gezählt, und das Überleben der Zellen wurde als prozentualer Anteil der Anzahl der überlebenden Kolonien, die auf den Kontrollplatten ausgedrückt.

Zellzyklusanalyse

wurden die Zellen geerntet und sanft resuspendiert in Einzelzellsuspensionen in Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Puffer (PBS 2% FBS enthält). Die Zellen wurden mit PBS zweimal gewaschen und in kaltem 70% igem Ethanol über Nacht fixiert. Die Zellen wurden gewaschen, dann zweimal mit kaltem PBS, wurde eine Lösung in RNase resuspendiert und für 30 min bei 4 ° C inkubiert. Die Suspension wurde zu 0,05 mg /ml Propidiumiodid (Beyotime) bei 4 ° C gefolgt von einer Inkubation für 30 min und Analyse unter Verwendung FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA).

Zell-Apoptose-Assay

Propidiumiodid (PI, 1 &mgr; g /ml) und Annexin V-FITC (1 ug /ml) wurden zur Bestimmung der Zellapoptose verwendet. Kurz gesagt, wurden die Zellen mit PI und Annexin V-FITC 15 min bei 37 ° C mit Trypsin behandelt und inkubiert. Die Proben wurden unter Verwendung eines FACS-Calibur Durchflusszytometers erfasst wird. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

intrazelluläres Adenosin-5'-Triphosphat (ATP) Ebenen Assay

Die intrazellulären ATP-Spiegel getestet wurden unter Verwendung von Biolumineszenz [11]. Kurz gesagt, wurden die Zellen bei etwa 15.000 g für 10 min bei 4 ° C lysiert und zentrifugiert. Die Überstände wurden dann mit einem ATP-Assay-Mix-Arbeitslösung (Sigma), und die Lichtmenge, gemischt emittiert wurde sofort mit einem Luminometer (Luminoskan Thermo Scientific Ascent, Walthan, MA) gemessen. Die Lumineszenz-Daten wurden von der Probe Proteinmengen normiert (gemessen mit einem BCA-Assay verwendet wird).

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Messung

Erzeugung von intrazellulären ROS wurde untersucht unter Verwendung von 6-Carboxy-2 ' , 7'-Dichlorofluorescein Diacetat (H _{2DCFDA). Kurz gesagt, 5 x 10 ^{4-Zellen wurden in 60-mm-Schalen plattiert und über Nacht anheften gelassen. Die Zellen wurden mit 5 uM H 2DCFDA für 30 min bei 37 ° C gefärbt und anschließend gesammelt und die Fluoreszenz wurde mit einem Fluoreszenz-Spektrometer analysiert (Flex StationII 384 Devices Molecular) bei 485 nm (Anregung) und 538 nm ( Emission). Cellular Oxidationsstufen wurden als relative Fluoreszenz DCF pro Probe Proteinmengen (BCA-Verfahren) ausgedrückt. In einigen Experimenten wurden mit 10 mM vorbehandelten Zellen N
-acetylcysteine ​​(NAC) vor der Analyse von ROS Generation.}}

Western-Blot-Analyse

Die Zellen wurden in IP lysiert Lysepuffer (Beyotime), denaturierte für 10 min bei 95 ° C, mit einer Insulinspritze geschert und auf SDS /PAGE-Gelen aufgelöst. Nach Immunoblotting wurden die Membranen blockiert und mit primären Antikörpern in PBS inkubiert /0,1% Tween-20 mit 5% fettfreier Trockenmilch. Antikörper, die gegen HDAC4, p21, LC3, Beclin 1, Atg 7, Caspase 3, 9, Bcl-2, Bax und anti-β-Actin wurden alle von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz) erworben. Chemilumineszenznachweis wurde unter Verwendung eines ECL-Nachweis-Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) getestet. Die Ergebnisse wurden mit Quantity One Software zu erhalten, um die optische Dichte-Verhältnis von Zielprotein analysiert, um ß-Aktin.

Immunofluoreszenz

Die Zellen wurden auf Deckgläser plattiert, mit 4% Paraformaldehyd (Sigma- Aldrich) während 10 min permeabilisiert und mit 0,1% Triton X-100 /PBS. Die Zellen wurden mit 1% BSA für 1 h blockiert, für die über Nacht mit anti-LC3-Antikörper bei 4 ° C inkubiert, und dann wurden die Zellen mit FITC-konjugierten Sekundärantikörper (Beyotime) für 1 h inkubiert. Die Kerne wurden mit 4,6-Diamidino-2-phenylindol (; Sigma DAPI) gefärbt. Die Fluoreszenz-Bildgebung wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) sichtbar gemacht.

Die statistische Analyse

Alle Daten sind repräsentativ für mindestens drei unabhängigen Experimenten. Die Daten werden als Mittel ± S.E.M. präsentiert statistische Signifikanz wurde durch Einwegvarianzanalyse (ANOVA) oder durch den Student-t-Test zwischen den beiden Gruppen mit GraphPad Prism 5 Statistik-Software berechnet. P
Werte. ≪ 0,05 wurden als signifikant betrachtet

Ergebnisse

• PLoS ONE: zirkulierenden Tumorzellen (CTC) Erkannt von RT-PCR und ihre prognostische Rolle in Magenkrebs: Eine Meta-Analyse der veröffentlichten Literature
• PLoS ONE: MUC5AC Upstream Complex Repetitive Region Länge Polymorphismen assoziiert sind mit Empfänglichkeit und klinischen Stadium von Magen Cancer