PLoS ONE: Metabolomics Gekoppelt mit Multivariate Daten und Pathway-Analyse auf potentielle Biomarker in Magengeschwür und Intervention Auswirkungen von Corydalis yanhusuo Alkaloid

Abstrakt

Metabolomik, die systematische Analyse von potentiellen Metaboliten in einer biologischen Probe, zunehmend gewesen angewendet Biomarker zu entdecken, die Identifizierung gestörter Wege, therapeutische Ziele zu messen und neue Medikamente zu entdecken. Durch die Analyse und den signifikanten Unterschied in der metabolischen Profile und Veränderungen der Metaboliten Biomarker Überprüfung ermöglicht es uns, Metabolomik besser Substanz Stoffwechselwege zu verstehen, die den Mechanismus der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) klären können. Corydalis yanhusuo
Alkaloid (CA) ist ein wichtiger Bestandteil der Qizhiweitong (QZWT) Rezept, das für die Behandlung von Magengeschwür seit Jahrhunderten verwendet worden ist, und der Mechanismus bleibt völlig unklar. Metabolit Profilierung wurde durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit time-of-flight-Massenspektrometrie (HPLC /ESI-TOF-MS) und in Verbindung mit der multivariaten Datenanalyse und Pfadanalyse kombiniert durchgeführt. Die Statistik-Software Massenprofiller Prossional (MPP) und statistische Verfahren einschließlich ANOVA und Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurden für die Entdeckung neuartiger potentielle Biomarker verwendet bei der Behandlung von Säure injizierten Ratten mit Magengeschwür Mechanismus von CA zu klären. Die Veränderungen der metabolischen Profils wurden in ihre Ausgangswerten nach CA Behandlung wieder nach den PCA-Score Plots. Zehn verschiedene potentielle Biomarker und sieben wichtigsten Stoffwechselwege zur Behandlung von Magengeschwüren beitrugen, wurden entdeckt und identifiziert. Unter den Wegen, waren Sphingophospholipid Stoffwechsel und Fettsäuremetabolismus bezogenen Netzwerk akut beunruhigt. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) -Analyse wurden durchgeführt, um die Expression von Genen zu den beiden Bahnen zur Überprüfung der obigen Ergebnisse mit Bezug zu bewerten. Die Ergebnisse zeigen, dass veränderte Biomarker und Wege Beweise Einblick in Drogenaktionsmechanismen bereitstellen kann und es uns ermöglichen, Forschungsproduktivität in Richtung Metabolomik Wirkstoffforschung zu erhöhen

Citation. Tianjiao L, Shuai W, Xiansheng M, Yongrui B, Shanshan G, Bo L, et al. (2014) Metabolomics Gekoppelt mit Multivariate Daten und Pathway-Analyse auf potentielle Biomarker in Magengeschwür und Intervention Auswirkungen von Corydalis yanhusuo
Alkaloid. PLoS ONE 9 (1): e82499. doi: 10.1371 /journal.pone.0082499

Editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 15. Mai 2013; Akzeptiert: 24. Oktober 2013 beginnen; Veröffentlicht: 15. Januar 2014

Copyright: © 2014 Tianjiao et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Key-Programm der Natural Science Foundation des Staates (Nr 81241111) unterstützt. Die Aglient und die Geldgeber hatte keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:. Die Autoren erklären, dass ihr Manuskript keine Beziehungen mit Agilent Technologies Co hat, Ltd., die Beschäftigung im Zusammenhang, Beratung, Patente, Produkte in der Entwicklung oder in Verkehr gebrachten Produkten etc. Dies ist Teil eines master~s Projekt und hebt sich von jedem internen Projekt. Einer der entsprechenden Autoren, Xiaorong Ran, wird von Agilent Technologies Co, Ltd. eingesetzt, die in den Studiendesign, Experimente und /oder Analysen geholfen. Lei Wang wird auch durch Agilent Technologies Co, Ltd. eingesetzt, der die Studie und half überwacht hat die Grammatikfehler in dem Manuskript bei der Modifizierung. Die Autoren bestätigen, dass die Beschäftigung von Agilent Technologoies ändert nichts an ihrer Zugehörigkeit zu einem der PLoS ONE Politik auf den Austausch von Daten und Materialien.

Einführung

Magengeschwür ist eine weit verbreitete Krankheit, die alle viele Menschen befällt auf der Welt aufgrund seiner höheren und höheren Morbidität. Nach der Statistik des Jahres 2005 war die Häufigkeit von Magengeschwüren bis zu 80%, vor allem westlichen Welt. Es hat 40-80% der wiederkehrenden Frequenz auf der ganzen Welt. Magengeschwür beim Menschen treten häufig wegen verschiedener endogener und exogener Faktoren wie Stress, Rauchen, Ernährungsmängel, Salzsäure, Pepsin, Helicobacter pylori
, nicht-steroidale entzündungshemmende Drogen (NSAIDs), Alkohol und Infektion [1]. Während diese Faktoren gedacht, wurden in der Pathogenese von Magengeschwüren beteiligt zu sein, ist der Mechanismus der Bildung von Geschwüren noch nicht genau verstanden, [2], [3]. TCM hat die Akzeptanz weltweit in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen zu erhöhen und wird allgemein als so natürlich und harmlos ist [4], [5]. Therapien kollektiv TCM sind allgemein zur Behandlung von Magengeschwüren, verwendet, die chinesische Kräutermedizin und Rezept enthält usw.

QZWT Verschreibung von zusammengesetzt Corydalis yanhusuo
, Radix Glycyrrhizae
und Radix Bupleuri
ect. extensiv verwendet, um Magengeschwür seit Jahrhunderten in China auszuhärten wurden, auf ihre bedeutenden therapeutischen Leistung in der klinischen Anwendung wegen [8] - [10]. Wir reinigten CA von Pflanzen "Corydalis yanhusuo W. T. Wang" mit der Reinheit von 92%. Die chemischen Bestandteile von Corydalis yanhusuo
wurden in unserer früheren Studie untersucht. Tetrahydropalmatine, corydaline, protopine et al wurden die biologischen Aktivitäten von Corydalis yanhusuo
. Die Strukturen der Bestandteile wurden untersucht. CA wird anerkannt, der wichtigste aktive Komponente in Corydalis yanhusuo
[6] und demonstrierte sein antiulcer Wirkung haben seit vielen Jahren in der chinesischen klinischen Praxis verwendet werden [7]. Es wurde auch berichtet, dass CA besitzt entzündungshemmende Wirkung [8], [9]. die detaillierten molekularen Mechanismus der CA jedoch versteht sich nicht gut Magengeschwür bei der Behandlung.

, um den Wirkungsmechanismus von Medikamenten zu erklären, hat Metabolomik Methodik weit verbreitet [10]. Metabolomics ist ein wichtiger Bestandteil der Systembiologie, vor allem in den globalen Stoffwechselprofil Bestimmung von Tausenden von kleinen und großen Molekülen in verschiedenen Medien, von Zellkulturen menschlichen biologischen Flüssigkeiten wie Urin, Speichel und Blut [11], [12] Erfassen [13]. Es hat einen großen Einfluss bei der Untersuchung von Biomarkern die Entdeckung und Identifizierung gestörter Wege infolge von Krankheiten oder medikamentöse Behandlung [14]. Durch die Analyse und die spezifischen frühen Biomarker einer Krankheit zu überprüfen, ermöglicht es uns, Metabolomik besser Substanz Stoffwechselwege zu verstehen, die den Wirkmechanismus klären kann [15].

Die jüngsten Fortschritte der Instrumentierung und Berechnung aktiviert haben die gleichzeitige Analyse von eine große Anzahl von Metaboliten. HPLC gekoppelt mit MS ist nachgewiesen worden, dass die Metaboliten Identifikationen und Quantifizierungen eine effektive Kombination zu sein, wegen seiner guten Auflösung und Empfindlichkeit. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, eine systematische Ansicht zu erhalten, um den Mechanismus der CA als eine wirksame Behandlung für Magengeschwüre zu sezieren. Die spezifischen und einzigartigen biochemischen Wege der Wirksamkeit von Medikamenten kann identifiziert werden, wenn sie mit der multivariaten Datenanalysetechniken gekoppelt. Der Zweck dieser Studie ist es, mehrere Metaboliten zu identifizieren, die das Verständnis des Wirkungsmechanismus von CA erleichtern könnten und unterstützen ihre Einbindung in zukünftige Verbesserung der TCM-Therapie.

Materialien und Methoden

2.1 Ethische Erklärung

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den genehmigten Tier Protokolle und Leitlinien, die Medizin Ethikkommission für Tierversuche von Liaoning Universität für Traditionelle chinesische Medizin durchgeführt.

2.2 Tier Handhabung und Probenvorbereitung

Sieben Wochen alte männliche SD-Ratten mit einem Gewicht von 200-250 g, wurden durch das Versuchstier Zentrum von Dalian Medical University zur Verfügung gestellt. Die Pflege und Handhabung von Ratten wurden in Übereinstimmung mit dem Standard der spezifischen Pathogen Free. Magengeschwüren wurde in den Ratten nach der Methode in einem früheren Bericht mit einer geringfügigen Änderung [16], [17] induziert. Drei Tage nach der Produktion von Magengeschwüren, die Ratten wurden in fünf Gruppen randomisiert: Steuerung, Modell, CA Gruppe mit hoher Dosis (32,4 mg /ml), CA mittleren Dosisgruppe (10,8 mg /ml) und CA Gruppe mit niedriger Dosis (3,6 mg /ml). Alle Ratten, die in Gruppen wurden oral der aktiven Gruppe Lösung verabreicht 1,5 ml einmal täglich (Modell und Kontrollgruppen mit Kochsalzlösung) für 7 Tage. Die Ratten verboten wurden alle Lebensmittel für 12 h vor den Versuchen, wurden aber Zugang zu Wasser frei gelassen.

Am letzten Tag wurden die Ratten tief anästhesiert und dann getötet. Blut wurde gesammelt, Plasma und Serum durch Zentrifugation für 15 min bei 4 ° C bei 3000 rpm getrennt wurden. Die Plasmaproben wurden gesammelt und gelagert bei -80 ° C in flüssigem Stickstoff bis zur Metabolomics-Analyse eingefroren wurden durchgeführt. Dann wurden die Mägen entlang der großen Krümmung geschnitten, mit Kochsalzlösung gewaschen. Der Bereich der Geschwür wurde durch einen Kompass gemessen Ulkus-Index zu messen. Der Bereich des Geschwürs gleich der Breite der Ulcus-fache der Länge des Geschwürs. Für die histologische Bewertung, Magengewebeproben wurden für 24 h in neutral gepuffertem Formalin fixiert. Magen Schnitte wurden dehydriert mit abgestufter Ethanol, durch Xylol geführt und in Paraffin eingebettet. Paraffinschnitte (5 mm Dicke) wurden mit Hämatoxylin /Eosin (HE) gefärbt. Die anderen Magen vereitert Gewebe wurden schnell entfernt und in flüssigem Stickstoff bis zur Extraktion der Gesamt-RNA Gewebe eingefroren.

2.3 Metabolic Profilieren

2.3.1 Chromatographie.

Die Chromatographie wurde durchgeführt Verwendung einer Serie HPLC-System Agilent 1100 mit quaternären Pumpe, Degasser, Autosampler und thermostatisierten Säulenraum. Das Injektionsvolumen wurde bei 4 &mgr; L fixiert. Alle Proben wurden bei 4 ° C während der Analyse gehalten. Die Trennung wurde durchgeführt auf einer 4,6 · 100 mm, ZORBAX SB-C18-Säule (Agilent, USA). Die Säulentemperatur wurde auf 45 ° C eingestellt. Die mobilen Phasen wurden zusammengesetzt aus 0,1% Ameisensäure in Wasser (Lösungsmittel B) und 0,1% Ameisensäure in Acetonitril (Lösungsmittel A), die Strömungsrate als 1 ml /min mit Teilungsverhältnis 1.03 eingestellt war, wurde der Gradient verwendet, wie folgt: eines linearen Gradienten von 70- 33% B über 5,0 min initialisiert, 33 -98% B über 5,0 bis 12,0 min. Das Eluat wurde direkt in das Massenspektrometer eingeführt. Nach jeweils 10 Proben Injektion wurde, um die Stabilität und Wiederholbarkeit der LC-MS-Systeme zu gewährleisten.

2.3.2 Mass Spectrometry injiziert gefolgt von einem Leerzeichen ein Sammelprobe als QC Probe.

Für die Massenspektrometrie, die Agilent 6220 TOF-MS mit einer Elektrospray-Ionisations-Quelle (ESI) im negativen Modus verwendet wurde. Die Strömungsgeschwindigkeit des Sterbens Gas (N2) wurde bei 9 l /min eingestellt. Der Zerstäuber wurde auf 45 psi eingestellt. Die anderen optimalen Bedingungen waren wie folgt: sterbenden Gastemperatur von 350 ° C, fragment Spannung von 120 V. Die Daten wurden in die Full-Scan-Modus von m /z 50 bis 1050 amu über 0-12 min gesammelt. Die MS-Daten wurden im Schwerpunkt-Modus gesammelt.

2.3.3 Multivariate Datenanalyse.

Datenanalyseverfahren ist in Abb. 1. Der Molecular Eigenschaft Extractor (MFE) -Algorithmus in der Massen Hunter Qualitative Analyse-Software wurde verwendet, um molekulare Merkmale nicht identifizierte, ungezielte Verbindungen extrahieren - in jedem der Daten. Der MFE Algorithmus sucht nach Massensignale (Ionen), die kovariante in der Zeit sind, hält mögliche chemische Beziehungen (Isotope, Addukte, Dimere, mehrere Ladungszustände) und erzeugt eine extrahierte Verbindung Chromatogramm und Verbindung Massenspektrum für jede molekulare Funktion. Die extrahierte Verbindung Liste für jede Datei wurde als Verbindung Exchange Format (. CEF) Datei zur weiteren Massen Profiler Professional (Version B.2.00, Agilent) statistische Analyse exportiert. Die resultierenden Merkmals Dateien für jede Probe wurden durch ANOVA und PCA-Analyse verarbeitet, um die MPP-Software verwendet, die ausgerichtet sind, normiert, visualisiert und filtriert, um die molekularen Eigenschaften (MFS), zur Weiterverarbeitung [18], [19], [20], [ ,,,0],21]. Anschließend wurde auf die Datendateien angewendet hierarchisches Clustern (Bedingung Baum). Hierarchische Clusteranalyse ist eine statistische Methode zur Gruppe in verschiedenen Clustern oder Zweige der hierarchischen Baum unbeaufsichtigt Proben. Auf diese Weise werden die Beziehungen zwischen den verschiedenen Gruppen gezeigt. Der Zustand Baum wurde als Wärme Karte angezeigt. Die Identität von Biomarkern mit signifikanten Veränderungen in den Gruppen wurde von ID-Browser-Funktionen von MPP bestimmt.

2.3.4 Biomarkers Identification.

Die Identifizierung von Biomarkern durch Q-TOF (Xevo bestimmt G2). Die MS Kollisionsenergie ist 35ev, und die Daten wurden im negativen Ionenmodus erhalten x (V4. MassLn1) Software wurde zur Datenanalyse verwendet. Die Identitäten der spezifischen Metaboliten wurden durch Elemente Informationen Vergleich ihrer Massenspektren mit der elementaren Zusammensetzung Informationen von der Software zur Verfügung gestellt bestätigt.

2.3.5 Netzwerk- und Pathway-Analyse.

MPP-Software wurde eingesetzt, zu allen bedeutenden (Ordner Änderung > 2) nach oben reguliert und nach unten geregelt Metaboliten und damit verbundene biologische Pfade. Die potenziellen Marker identifiziert wurden mit der genauen Massenladungsverhältnis in einigen Datenbanken verglichen, darunter HMDB, KEGG, METLIN, LIPID MAPS und PubChem, um verwandte Wege zu entdecken. T-Test und Fold alter wurden verwendet, um die statistische Signifikanz in die Wege zu bestimmen. P-Wert < 0,05 und Ordnerwechsel > 2 wurde als statistisch signifikanten Kriterien zu sein und würde ausgewählt werden

2.6 Molekulare Daten

Gesamt-RNA wurde von Magengewebe, einschließlich Steuerung, Modell und CA extrahiert. Gruppen ein Trizolreagenz mit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. cDNA wurde aus Gesamt-RNA synthetisiert (1 ug) unter Verwendung von Transscript Erste-cDNA-Synthese SuperMix Kit (Beijing TransGen Biotech, China). Quantitative Echtzeit-PCR (CFX96, BIO-RAD, USA) durchgeführt, eine TransStart ™ Top Green qPCR SuperMix Kit (Beijing TransGen Biotech, China). verwendet Grundierungen S1Pr1, S1Pr3, SphK1, GOT2 und Fabp1 waren von Invitrogen (S1Pr1 zu verstärken: GenBank acc kein NM_017301, S1Pr3:.. GenBank acc kein XM_225216, SphK1:.. GenBank acc kein NM_133386, GOT2:... GenBank acc Nein . NM_013177.2, Fabp1:.. GenBank acc kein NM_012556.2) und Expression dieser Transkripte wurde gegen das Housekeeping-Gen β-Actin quantifiziert, die 5'-TGGCACCACACTTTCTACAATGA-3 'und 5'-AGGGACAACACAGCCTGGAT- unter Verwendung der Primer amplifiziert 3'. Expression von Zielgenen wurden unter Verwendung des CFX-Manager-System (BIO-RAD, USA) analysiert.

2.7 Statistische Analyse

Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. SPSS 19.0 für Windows wurde für die statistische Analyse verwendet. Die Daten wurden unter Verwendung der ANOVA analysiert, mit p < 0,05 als das Niveau der statistischen Signifikanz gesetzt

Ergebnis

3.1 Wirkung von CA auf der Essigsäure Magengeschwür Modell
injiziert-induziert.

Das experimentelle Modell von Essigsäure injiziert induzierten Schäden der Magenschleimhaut bei Ratten wird häufig verwendet, um die Verbindungen für die Anti-Ulcus-Aktivität zu screenen, dass sie als die führende Ursache von Magengeschwüren beim Menschen dient [22]. Essigsäure intensive Magenschleimhaut Schäden bei der Bildung von Geschwüren in der Modellgruppe (Abb. 2A) Ratten injiziert induzierte, die einen deutlich Unterschied hat im Vergleich mit der Kontrollgruppe (Abb. 2B). Pathologische Beobachtung wurde verwendet, um die Beschädigung der Essigsäure-induzierten confirme ulteriorly in den oberflächlichen Schichten der Magenschleimhaut. Essigsäure-induzierten Magengeschwüren (Fig. 2C) eine Erosionswirkung auf die Schleimhaut, die durch Muskelbruch und entzündlichen Zellinfiltration in den Schichten im Vergleich zur Kontrolle (Fig. 2D) begleitet wurde. Die Ergebnisse beweisen, dass das Modell von Magengeschwüren erfolgreich reproduziert wurde. Die Ergebnisse der Zeitverlauf zeigte in Abb. 2E zeigen, dass das Gebiet von Geschwüren bei Ratten mit CA behandelt blieb deutlich kleiner als bei siebten Tag auf die jeweiligen Werte in den Modell Ratten verglichen, so wählten wir den Proben des siebten Tag für die Analyse. Um die Auswirkungen von CA zu bewerten, wie es in Fig demonstriert. 2F wurde das Gebiet von Magengeschwüren in CA Dosisgruppen signifikant verringert mit der Modellgruppe (p < 0,01) verglichen. Unsere experimentellen Ergebnisse deuten darauf hin, dass CA kann effektiv das Magengeschwür zu heilen, vor allem die mittlere Dosisgruppe. Es scheint, dass es eine deutliche Überlappung zwischen den neuronalen pathogenetischen Bahnen in Geschwür Genese und Depression beteiligt ist. Daher ist es nicht verwunderlich, dass Medikamente für die Behandlung von depressiven Episoden auch starke Schutzwirkung gegen Magengeschwür [23] ausüben kann. Der Grund, warum CA mittleren Dosisgruppe eine bessere therapeutische Wirkung als die hohe Dosis-Gruppe aufweisen kann CA sein Hochdosisgruppe eine Rolle Nerven zu hemmen. Die Wirkung von CA wurde der Mechanismus weiter zu untersuchen, untersucht.

3.2 Metabolomische Studie

3.2.1 Erfassung und Verarbeitung von metabolischen Profildaten.

Die repräsentativen Gesamt Ionenchromatogrammen ( TIC) von Plasmaproben von Kontroll abgeleitet, das Modell und CA-Dosisgruppen in negativ Modi sind in Fig. 3 durch die optimale LC-MS oben beschriebenen Bedingungen verwendet. Niedermolekulare Stoffwechselprodukte abgetrennt und in der kurzen Zeit von 15 min werden konnte. Um besser zu visualisieren, wurden die subtilen Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen diesen komplexen Datensätzen, mehrere Mustererkennungsverfahren eingesetzt, um die Plasma-Metabolom von Ratten zu Phänotyp. Hier wurden hierarchische Clusteranalyse und PCA verwendet, um die metabolische Phänotypen zu klassifizieren und die differenting Metaboliten zu identifizieren. Hierarchical Clustering-Analyse von Metabolomics-Daten zeigten deutliche Trennung zwischen der Steuerung, Modellgruppe und CA-Dosisgruppe (Abb. 4). In den PCA-Scores stellt jeder Punkt eine einzelne Probe. Die PCA Ergebnisse werden als Punktzahl Plots, welche die Streuung der Proben, die ähnliche Metabolomik zeigen Zusammensetzungen angezeigt, wenn sie zusammen und kompositorisch unterschiedliche Metabolomen gruppierten beim Dispergieren. Die PCA Scores-Plot konnte die verschiedenen Plasmaproben in verschiedene Blöcke unterteilen, die jeweils darauf hindeutet, dass die Stoffwechselprofile verändert haben. Im Hinblick auf die Informationen Analyst von PCA in unserem Experiment zeigte in Abb. 5, die Steuer- und Modellgruppen waren signifikant in zwei Klassen eingeteilt, was darauf hinweist, dass das Modell von Essigsäure-induzierten Magengeschwüren wurde erfolgreich wiedergegeben. Weitere subtile Veränderungen können durch die Mustererkennung Ansatz-Score Plots von PCA gefunden werden. PCA Ergebnisse zeigen, dass die Modellgruppe von den übrigen vier Gruppen weit entfernt war, was darauf hinweist, dass veränderte Stoffwechselmuster von Essigsäure-induzierten resultierte aus anderen deutlich unterscheiden können. Die Position der Behandlungsgruppe war in der Nähe der Kontrollgruppe, was darauf hindeutet, dass veränderte Stoffwechselmuster von CA verursacht wurde Die Ergebnisse offensichtlich, dass CA könnte die abnorme metabolischen Status ändern und eine andere Behandlung Mechanismus von Essigsäure-induzierten Magengeschwüren haben.

3.2.2 Identifizierung von Biomarkern.

Der niedermolekulare Metaboliten von signifikanten Unterschiede (T-Test, p < 0,05) wurden durch die Software von MPP gesucht. Die potentielle Marker wurden unter Verwendung des "ID-Browser" identifiziert in METLIN Datenbank zu suchen (http://metlin.scripps.edu/) und im Vergleich mit der genauen Massenladungsverhältnis in einigen Datenbanken, einschließlich HMDB (http: //www. hmdb.org/), KEGG (http://www.genome.jp/kegg/), LIPID MAPS (http://dev.lipidmaps.org:25424/) und PubChem (http: //pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/). Wir können die wahrscheinliche Namen von potentiellen Biomarkern durch den ersten Schritt kennen. In der vorliegenden Studie wurden 10 potenzielle Biomarker identifiziert werden (Tabelle 1). Die genaue Molekülmasse von Verbindungen mit signifikanten Veränderungen in den Gruppen wurde innerhalb von Messfehlern bestimmt (< 5 ppm) von Waters Xevo G2 QTOF, und in der Zwischenzeit wird das Potential elementare Zusammensetzung, der Grad der Ungesättigtheit und fraktionierte Isotopenhäufigkeit von Verbindungen erhalten wurden. Die angenommene Molekularformel wurde in ChemSpider (http://www.chemspider.com/) HMDB und anderen Datenbanken zu identifizieren, die mögliche chemische Konstitutionen und MS /MS-Daten wurden die möglichen Strukturen der Ionen zu bestimmen, gescreent gesucht. Sphingosin-1-phosphat (S1P) und Stearinsäure wurden als Beispiele Fragmente der Struktur und der Beurteilungsprozess zu veranschaulichen. Die primären und sekundären Massenspektrometrie Informationen wurden von Masslynx (Vision 4.1, Gewässer) analysiert Software, verglichen mit Datenbank und Ionenfragmente von 379,2488 (C _{18H 38NO 5P) wurden in Fig. 6 A. Die Hauptfragmentionen analysiert durch MS /MS-Screening waren m /z 224,080, 165,1254 und 82,0238, die verloren C 7H 15NO 5P, C 11H entsprechen könnte 17O, C 4H 4 NO beziehungsweise. Schließlich wurde es als S1P spekuliert nach beziehe und entsprechend ihrer Polarität Größe. Inzwischen Ionenfragmente von Stearinsäure 284.2715 (C 18H 36O 2) (Abb. 6 B) waren 212,2419 (C 15H 32), 143,1359 (C 9H 19O), 117,0962 (C 6H 13O 2) und 83,0962 (C 6H 11).}

Die Biomarker oben beschrieben nachgewiesen wurden, haben nahe Beziehung mit der Entstehung und Behandlung von Magengeschwüren. Die signifikant hochreguliert D-Glucose, Lysin, Harnsäure, Brenztraubensäure, Corticosteron, Sphingosin-1-Phosphat und die nach unten reguliert Tryptophan, glykocholsaure, Hexadecandisäure, Stearinsäure wurden in der Modellgruppe beobachtet, verglichen mit der Kontrollgruppe (Abb. 7 ). Dieser Unterschied von Metaboliten können ihr Potenzial als gezielte Biomarker bezeichnen für Magengeschwür und normale Zustände zu unterscheiden. Überwachung von Änderungen dieser Metaboliten kann die Entwicklung von Magengeschwür vorhersagen. Die Biomarker 1, 2, 3, 4, 7, 8 nach der Behandlung der CA verringert wurden, im Gegenteil, wurden die anderen Biomarker erhöht. Zusätzlich wird, um antiulcer Wirkung von CA deutlicher, Änderungen in den relativen Konzentrationen von Ziel Metaboliten identifiziert in verschiedenen Gruppen zu charakterisieren analysiert wurde, haben wir, dass der Inhalt dieser Schlüsselmarker gefunden näher an normalen Gruppe. Die Ergebnisse zeigen den Mechanismus für die Behandlung von Magengeschwüren kann durch die Regulierung dieser signifikant Markern und ihrer Wechselwirkung wie Fig erreicht werden. 8. Zum Beispiel, die Stearinsäure 17FA genannt, hat Beziehung zu Thapsiasäure Säure obwohl das Protein Fabp1 (Fettsäure-bindendes Protein 1). Das Netzwerk ist nicht nur auf die Interaktion zwischen Biomarkern, sondern liefert auch Informationen an potentiellen Protein, Gene, Enzyme und biologische Prozesse. Es trägt zur Entdeckung von Ziel während des Auftretens und der Behandlung von Magengeschwüren und zur Entwicklung neuer Arzneimittel leitfähigen Magengeschwüren zu heilen.

3.3 Bestimmung der mRNA-Spiegel der Biomarker zu bestätigen

um unsere Metabolomik Ergebnisse bestätigen, müssen wir einige molekulare Daten, so identifizierten wir 5 mRNAs, die zu den vier potentielle Biomarker und 2 Stoffwechselwege mit RT-PCR verwandt sind. Sphingolipidstoffwechsels, einschließlich S1Pr1, S1Pr3 und SphK1 wurden wie in Abb zeigte untersucht. 8. Die Ergebnisse sind in Fig zusammengefasst. 9. Die mRNA-Ebene von S1Pr1, SIPr3 und SphK1 deutlich in der Modellgruppe upregulated wurden, waren die Expressionsniveaus 5,21, 2,54, 6,57 mal im Vergleich zu der Kontrollgruppe, die in Übereinstimmung mit unseren bisherigen Erkenntnissen und Daten war. Nach CA Behandlung waren die Expressionsniveaus von S1Pr1, S1Pr3 und SphK1 zurück auf Basisniveau. S1P wird durch zwei Kinasen, Sphingosin-Kinase 1 und 2 (SphK1 und SphK2) gebildet, jedoch wurden keine Unterschiede in SphK2 Expression unter allen Gruppen (Daten nicht gezeigt), war das Ergebnis im Einklang mit unseren Netzwerk Befunde beobachtet. Hier können wir einen potentiellen Mechanismus der CA in der Behandlung von Magengeschwüren durch Blockieren S1P Erhöhung erklären. Wir fanden auch eine verminderte Expression von Fabp1 und GOT2 in Modellgruppe (Abb. 9), im Vergleich mit der Kontrollgruppe. Aber CA tut Gruppen in der Nähe der Kontrollgruppe waren, die bestätigt, dass die therapeutische Wirkung von CA zu Fettsäuremetabolismus von molekularer Ebene verbunden war.

3.4 Pathway Analysis

Weitere detaillierte Analyse der Wege und Netzwerke von Magengeschwür beeinflusst wurde von MPP durchgeführt. Die Wege erhalten wurde, zeigt in der Tabelle 2 Wir verwenden die qualitativ hochwertige KEGG Stoffwechselwege als Backend-Wissensbasis, die wichtigsten Wege, wie Sphingolipidstoffwechsels, tricarboxylicacidcycle-Zyklus, Biotin Stoffwechsel und so weiter, in denen 7 einzigartige Wege zu identifizieren ( in Tabelle 1) für die Modellgruppe identifiziert wurde. Potenzielle Biomarker im Zusammenhang mit Folsäure-Stoffwechsel, Fettsäure-Stoffwechsel und Sphingolipidstoffwechsels Wege wurden ebenfalls angepasst. Von den sechs verschiedene Metaboliten von diesen Wegen identifiziert, sind viele in verschiedenen Stadien der Entwicklung des Magengeschwür. Einige signifikant verändert Metaboliten wie glykocholsaure, Hexadecandisäure und Stearinsäure wurden gefunden und verwendet, um die Fettsäure-Mechanismus erklären. Diese Ergebnisse legen nahe, dass diese Zielpfade die markierten Störungen über die Bildung von Magengeschwür zeigt und zur Entwicklung von Magengeschwüren beitragen könnte.

Discussion

Magengeschwüren beim Menschen häufig wiederkehren und die Schwierigkeit bei der Behandlung wird sie durch das Sprichwort "Wenn ein Geschwür, immer ein Geschwür" [24] angegeben. Viele Faktoren können das Auftreten von Magengeschwüren zu erhöhen, aber der Mechanismus ist eindeutig nicht verstanden. Daher hängt die Wirksamkeit der Arzneimittelbehandlung nicht nur auf die Verringerung der schädlichen Faktoren, sondern auch von den Metaboliten verändert, die den Stoffwechselweg regulieren. Insbesondere die Entdeckung von Biomarkern, die das Risiko von Magengeschwüren vorhersagen, wird Gelegenheit bieten, zu diagnostizieren und rechtzeitig pharmakologische Behandlung ermöglichen. QZWT wurde verwendet, Magengeschwür seit vielen Jahren in Asien zu heilen, obwohl der Mechanismus unklar bleibt. Metabolomics gekoppelt mit multivariaten Datentools, die gleichzeitig Tausende von Metaboliten in einem lebenden Organismus zu quantifizieren wurde verwendet, um die Biomarker in Magengeschwür [25] zu analysieren. Darüber hinaus hat das Verständnis von Biomarkern neues Interesse in den Bereichen Medikamentenentdeckungsprogramme und die Überwachung der Krankheiten, die wertvolle in-Sehenswürdigkeiten über komplexe Krankheitsmechanismen [26] ausgelöst. Diese Studie wurde daher die zugrunde liegende Mechanismus der CA weiter zu erläutern entworfen, um auf Magengeschwür Regulation von Stoffwechselwegen in einer globalen Sicht.

Das Modell von Magengeschwüren bei Ratten wurde erfolgreich wiedergegeben. Plasmaproben wurden durch HPLC /ESI-TOF-MS und multivariate statistische Analyse analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass der Bereich des Geschwürs und dynamischen metabolischen Profile nach CA Behandlung der Kontrollgruppe waren geschlossen, was zeigt, dass CA therapeutische Wirksamkeit hatte. Nach Metabolomics-Analyse, 10 potenzielle Biomarker und 7 verwandte Stoffwechselwege wurden in unserer Studie identifiziert. Die deutlich herunterreguliert D-Glucose, Lysin, Harnsäure, Brenztraubensäure, Corticosteron, Sphingosin-1-Phosphat und die hochreguliert Tryptophan, glykocholsaure, Hexadecandisäure, Stearinsäure wurden in der CA-Gruppe beobachtet, verglichen mit Modellgruppe. Zusätzlich wurden Folsäuremetabolismus, Fettsäurestoffwechsels und Sphingolipid-Metabolismus und vielen anderen Stoffwechsels bestätigt Auswirkungen auf Magengeschwüren haben. Wir haben die Expression von mRNAs bestimmen im Zusammenhang mit den Stoffwechsel und die Fettsäure zu Sphingolipidstoffwechsels den Mechanismus zu validieren. Viele andere potenzielle Proteine, Gene, Enzyme und Bioprozess auf andere Wege geschlossen zukünftige Experimente müssen zu validieren.

Durch die Analyse und die spezifischen frühen Biomarker einer Krankheit zu überprüfen, Metabolomik uns besser ermöglicht, pathologische Prozesse und Substanz Stoffwechselwege zu verstehen . Wir glauben, dass der Biomarker und Pathway haben ein großes Potenzial analysiert die therapeutische Wirkung der TCM zu erforschen und zu klären. In aktuellen Studie haben wir biomarker Interaktion gekennzeichnet Netzwerke beinhalten Proteine, Gene, Enzyme und Bioprozess, wie in Fig. 8. S1P act extrazellulär als Ligand für spezifische Rezeptoren-S1PRs, wird nun als Regulator von vielen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen erkannt wird, einschließlich entzündlicher Erkrankungen, wie rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmerkrankung, Sepsis und [27], [28]. Entzündung, die in der Schleimhaut des Magen-Darm-Trakt auftritt, wodurch bewirkt gastrointestinalen Geschwürs [29]. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die CA die Expression von S1P und seine Rezeptoren verringern kann, einschließlich S1Pr1 und S1Pr3, Entzündung Probleme der Bildung von Magengeschwüren zu lindern [30] zu erleichtern. S1P wird durch SphK1 und SphK2 [31] gebildet. SphK1 kann aktiv die NF-kappaB Signalweg, der von den großen entzündlichen Signalmolekül TNF-α ausgelöst. Kurz gesagt, NF &kgr; B und TNF-α ist eng mit Magengeschwüren zu bilden und zu heilen, [32], [33]. Wir fanden auch, dass der Mangel an SphK1 (nicht SphK2) deutlich Magengeschwür hemmt, was darauf hinweist, dass SphK1 eine entscheidende Rolle bei Magengeschwür spielen können. Somit kann der Sphingolipid-Metabolismus ein brauchbares Ziel für die Behandlung von Magengeschwüren sein.

Stearinsäure, Glycocholat und Hexadecandisäure veränderte Fettsäurestoffwechselstörung Schließ zur Einfalls und Rehabilitation von Magengeschwüren [34] bewirken, [35] . Fettsäuren, einschließlich etc Stearinsäure, die gemeinhin als die Energiequelle betrachtet, haben das Interesse für die Forschung und die öffentliche Gesundheit angezogen, die aufgrund ihrer Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und Krankheiten. Fettsäuren sind vorteilhaft für die gesundheitsfördernden. Stearinsäure, glykocholsaure und Hexadecandisäure werden durch Fabp1 geregelt, das Enzym Fettsäure-bindendes Protein 1. Analyse der RT-PCR, schlägt die geringe Expression von Fabp1 in Modellgruppe, dass die Hemmung Fabp1 Aktivität Stearinsäure reduzieren kann, glykocholsaure und Hexadecandisäure und Fettsäurestoffwechselstörung führen. Daher erhöht die Entzündungsreaktion und mitochondriale Dysfunktion und Geschwürbildung zu fördern. Allerdings kann CA diese Störung ausgleichen durch die Expression von Fabp1 Erhöhung [36]. Glutamat-Oxalacetat-Transaminase 2 (GOT2) ist ein wichtiges Enzym im tricarboxylicacidcycle-Zyklus (TCA-Zyklus). Die stark Hemmung der TCA durch die verminderte von GOT2 verursacht werden zur Bildung von Magengeschwüren bei. Die Metaboliten von Aminosäuren, wie Tryptophan und seinen Metaboliten in vivo haben eine umfangreiche Rolle in Tryptophanstoffwechsels. Das wichtigste ist, dass Tryptophan-Stoffwechselstörungen TCA Störung verursachen können. TCA spielen eine Rolle bei der Heilung von Magengeschwür [37]. Down-Regulation der GOT2 mRNA-Expression in Modellgruppe und Hochregulation in CA-Gruppen wurden bereits zuvor in unserem Ergebnis demonstriert. Alle diese Daten zeigen deutlich, dass der molekulare Mechanismus der CA Behandlung von Magengeschwür war eng mit seiner Balance Auswirkungen auf die TCA korreliert. Diese Ergebnisse implizieren die CA-Effekte durch Protein vermittelt werden können, Enzyme und Stoffwechselweg.

• PLoS ONE: Die Verminderte Expression von Proangiogene Wachstumsfaktoren und ihre Rezeptoren bei Magengeschwüren von Patienten mit Leberzirrhose
• PLoS ONE: In Vivo Antioxidant und Antiulkuswirksamkeit von Parkia speciosa Ethanolisches Blattextrakt gegen Ethanol-induzierten Magengeschwüren bei Ratten