Änderungen von E-Cadherin und β-Catenin in Magen cancer

Änderungen von E-Cadherin und β-Catenin bei Magenkrebs
Zusammenfassung
Hintergrund
Der E-Cadherin-Catenin-Komplex spielt eine entscheidende Rolle bei der epithelialen zell- Zelladhäsion und bei der Aufrechterhaltung der Gewebearchitektur. Eine Störung in der Expression oder Funktion dieses Komplexes führt zu einem Verlust von intercellular adhesion mit möglichen Folgezelltransformation und Tumorprogression.
Methoden
Wir haben die Veränderungen von E-Cadherin und β-Catenin in einem Satz von 50 untersuchten primären Tumoren des Magens durch den Verlust der Heterozygotie (LOH) Analyse unter Verwendung von Gen-Mutation-Screening, Detektion von aberrante Transkripte und Immunhistochemie (IHC).
Ergebnisse
eine Hochfrequenz (75%) von LOH wurde bei 16q22.1 erkannt enthält E -cadherin Locus. Drei Fällen (6%) zeigten die gleiche Missense-Mutation, A592T. Diese Mutation ist nicht wahrscheinlich, stark an der Karzinogenese von Magenkrebs beitragen, weil eine niedrige Frequenz (1,6%) dieser Mutation auch in 187 normalen Individuen gefunden. Wir haben festgestellt auch eine niedrige Frequenz (0,36%, 0%) dieser Mutation in 280 Brusttumoren und 444 andere Tumore, einschließlich Kolon und Rektum, der Lunge, des Endometriums, der Eierstöcke, Hoden, Niere, Schilddrüsenkarzinome und Sarkome, respectively. Wir analysierten auch die aberrant E-Cadherin-mRNAs in den Magentumoren und finden, dass 7-Tumoren (18%) aberrant mRNAs zusätzlich zu der normalen mRNA hatte. Diese anomale mRNAs produzieren können abnormal E-Cadherin-Moleküle, was zu einer schwachen Zell-Zell-Adhäsion und invasive Verhalten von Karzinomzellen. Verminderte Expression von E-Cadherin und β-Catenin wurde bei der Frequenz von 42% und 28% gekennzeichnet sind. Speziell zeigten 11 Tumoren (22%) positive zytoplasmatische Färbung für β-Catenin IHC. Eine Assoziation zwischen einer verminderten Expression von E-Cadherin und β-Catenin gefunden. Darüber hinaus wurde ein Zusammenhang zwischen einer verminderten Expression von E-Cadherin und diffuse histotype erkannt.
Fazit
Unsere Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass Veränderungen von E-Cadherin und β-Catenin eine Rolle bei der Initiierung und Progression von Magenkrebs spielen .
Hintergrund
E-Cadherin (120 kDa; Chromosom 16q) ist ein klassisches Cadherin und bildet die wichtigsten Funktionskomponente der Adhärenz Verbindungen zwischen Epithelzellen [1]. Es ist über eine Reihe von Unterproteine ​​gebunden, die catenins (α, β und γ) mit dem Aktin-Zytoskelett [1]. Diese Verknüpfung zwischen transmembranären cadherins und Aktinfilamente des Zytoskeletts ist notwendig, starke Zell-Zell-Adhäsion zu bilden. Eine intakte E-Cadherin - Catenin-Komplexes ist für die Aufrechterhaltung der normalen intercellular adhesion erforderlich. In Anbetracht dieser Tatsache haben mehrere Gruppen vorgeschlagen, dass in Karzinomen, E-Cadherin-Funktionen als invasion suppressor-Molekül, so daß der Verlust erlaubt oder die Invasion der angrenzenden normalen Geweben verbessert. Immunhistochemische Studien in menschlichen Krebserkrankungen, einschließlich Magenkrebs, haben häufig gezeigt, dass ein Anteil von invasiven Karzinomen und Karzinome in situ anomale Mengen an E-Cadherin und /oder Catenin Expression im Vergleich zu den damit verbundenen normalem Gewebe zeigen
[2-4] . In der Regel E-Cadherin und Catenin-Färbung in gut differenzierten Krebsarten stark ist, die ihre Zelle Haft halten und sind weniger invasive, wird aber in schlecht differenzierten Tumoren reduziert, die ihre Zell-Zell-Adhäsion und zeigen eine starke invasive Verhalten verloren haben [2, 3].
E-cadherin in Kontakt Hemmung des Zellwachstums beteiligt durch Zellzyklus-Arrest induziert [5]. Es hat die Fähigkeit, die Zellproliferation durch die Hochregulierung von p27 in der Zellzyklusregulation [5], obwohl der Mechanismus, durch den reguliert E-cadherin p27 unklar ist noch beteiligt zu hemmen. Deshalb E-Cadherin, in der Regel als eine Invasion Suppressor [6] beschrieben, als ein wichtiges Wachstum /Proliferation Suppressor wirken kann.
Eine wichtige Funktion von β-Catenin in Zellsignalisierung, ist aufgeklärt worden [7]. In Abwesenheit eines mitotischen Signal von außerhalb der Zelle, β-Catenin in einem Komplex mit dem adenomatösen Polyposis coli (APC) -Gen-Produkt, ein Serin-Threonin-Glykogen-Synthetase-Kinase (GSK-3β) und einem Adapterprotein axin sequestriert (oder eine Homolog conductin), so dass die Phosphorylierung und den Abbau von freien β-Catenin durch das Ubiquitin-Proteasom-System [8]. Wenn ein mitotischen Signal durch den Wnt-Signalweg geliefert wird, die durch den Kontakt der Wg /Wnt-Familie von sekretierten Glykoproteinen und deren Membranrezeptor gekräuselt, führt es zu einer Aktivierung der zerzaust (DSH) Protein, das an der Zellmembran rekrutiert wird. Die aktivierte Dsh downregulates den Proteinkomplex, so dass es nicht mehr β-Catenin zu phosphorylieren kann, die dann nicht verschlechtert. Die Freisetzung von β-Catenin aus der Phosphorylierung und Abbau komplexer fördert β-Catenin Stabilisierung und Signalisierung. Dies führt zu einer Erhöhung der freien cytosolische β-Catenin, die in den Zellkern transloziert und bindet direkt an die Transkriptionsfaktoren Lef und Tcf, zur Aktivierung der Genexpression führt. Daher β-Catenin führt verschiedene Funktionen in E-Cadherin-vermittelte Zell-Zell-Adhäsion und in Wnt signal [8].
Verlust der E-Cadherin-Locus auf dem langen Arm von Chromosom 16 (16q22) tritt in Magen (24 %), hepatozellulären (50%), lobular Brust (50-100%) und der Speiseröhre (66%) Karzinome [4, 9-12]. Es wurden in menschlichen Krebserkrankungen mehrere Berichte über E-Cadherin-Gen-Mutationen war [13]. In schlecht differenzierten Tumoren, wie lobulären Brustkrebs und diffusen Typ von Magenkrebs, E-Cadherin-Mutationen spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung [14, 15]. Mehrere Studien haben in Familien mit einer vererbten diffuse Art von Magenkrebs [16, 17] Keimbahnmutationen im E-Cadherin-Gens berichtet. Nur eine Minderheit von Magenkrebs durch E-Cadherin-Mutationen berücksichtigt werden. Häufige somatische Mutationen von β-Catenin-Gen in kleinen kolorektalen Adenomen und Darm-Typ Magenkrebs [18, 19] gefunden. Die meisten der Mutationen beteiligt, den Verlust von Serine oder Threonine von der GSK-3β-Phosphorylierung Region. Genetische Veränderungen in β-Catenin Abschaffung Zell-Zell-Haft wurden in zwei Magenkrebszelllinien, HSC39 und 40A beobachtet; beide stammen aus der gleichen Zellkarzinom des Magens Siegelring und zeigen ein diffuses Wachstumsmuster [20, 21]. Diese Mutation führt zu einem verkürzten β-Catenin, die die Region für die Interaktion mit β-Catenin fehlt. Die Transfektion dieser Zelllinien mit Wildtyp-β-Catenin zelluläre Haft wieder [21].
Hier führten wir E-Cadherin und Beta-Catenin-Gen-Mutation und Expressionsanalyse in einer Reihe von 50 primären Tumoren des Magens, um zu verstehen, besser ist die Einbeziehung der Veränderungen von E-Cadherin und β-Catenin in der Karzinogenese von Magenkrebs.
Materialien und Methoden
Proben
in die Studie eingeschlossen waren 50 Tumoren und entsprechenden normalen Proben, von denen zwei Tumoren (17 und 23) waren aus der gleichen Familie, der Rest sporadische (Tabelle 1). Diese Fälle wurden von der Abteilung für Pathologie, Universitätsklinikum Island diagnostiziert. Gewebe erhalten wurde frisch am Tag der Operation oder aus in Paraffin eingebettetem Material. Angaben zur Tumorstadium, histotype und Klasse wurde ebenfalls aus der gleichen Abteilung erworben. DNA für die PCR wurde durch das Proteinase-K-Behandlung isoliert [22]. RNA für die RT-PCR wurde unter Verwendung von Tri-Reagenz (Molecular Research Center, INC. USA) extrahiert. Für die A592T-Mutation, abgeschirmt wir 187 normalen Individuen, 280 Brust und 444 andere Krebspatienten mit Kolon und Rektum, Lunge, Endometrium, Ovar, Hoden, Niere, Schilddrüsenkarzinome und Sarkome. Alle individuellen Kennungen wurden aus den Kontrollproben vor der Analyse entfernt und Ermittler wurden somit zur Identifizierung von Proben verblendet, die nicht mehr auf bestimmte Personen verfolgt werden kann. Die Zustimmung wurde für die Patientenproben vermutet. Für die Fälle, 294 und 728 mit A592T-Mutation haben wir analysiert, ihre Abstammungen und festgestellt, dass es im Stammbaum von Fall keine anderen Krebsfälle waren 294, aber es gab auch andere 5 Krebsfälle im Stammbaum von Fall 728, davon 2 Prostatakrebs, 1 Haut Krebs, Lungenkrebs und 1 1 Krebs unklarer origin.Table 1 Zusammenfassung der Veränderungen von E-Cadherin und β-Catenin in einer Reihe von 50 Magentumoren.
Tumour

Stage

Type

Grade

LOH

E-cad Genmutationen
Aberrant mRNA
E-cad
β-cat
Probe



bei 16q22.1 bei
und Polymorphismen
von E-CAD
IHC
IHC

1 | T3N3
diff
+
IVS1+6T→C
-
+/-
++/-∇
3
T3N1
squ
G1
+
IVS4+10C→G
ND
-
+/-
17
T3N1
diff
ND | GTG (Val) → GTC (Val) bei cd832
ND | -
- 23
erfüllt
+
GCC (Ala) → ACC (Thr bei cd592) *
ND | +++ /-
+++ /-
43
T3N2
diff
+
- -
-
+++ /-
50
T3N1
diff
-
IVS1+6T→C
-
++/-
++/-
165
T3N1
int
G3
ND
-
-
+++/-
+++/-∇
174
T3N2
int
G3
-
-
ND
+++/-
++/-
193
T3N2
int
G3
+
-
ND
-/+++
-/++
200
T3N1
int
G2
-
IVS4+10C→G
-
++/-
+++/-
231
T3N0
mi
G3
+
-
-
++/-
++/-∇
283
T3N0
int
G3
ND
-
ND
++/-
++/-
287
T3N1
int
G2
+
-
-
-/+
++/-
294
T3N1M1
mi
G4
+
GCC(Ala)→ACC(Thr) beim cd592♦
-
++/-
++/-∇
304
T3N3
int
G2
-
-
-
-/+++
+/-
308
T3N1
int
G2
+
-
-
+++/-
++/-
314
T3N1
diff
-
CAC (His) → CAT (His) bei cd632
- +++ /-
++ /- ∇
GGC (Gly) → GGT (Gly) bei cd865
360
T2N1
int
G3
+
IVS4 + 10C → G
+ ♣
++ /-
+/-
369
traf
+
-
+♣
+++/-
++/-
433
T3N1
mi
G3
-
IVS4+10C→G
-
-/++
-/+
435
T2N0
int
G3
+
-
-
-/+++
-/++
443
T2N0
int
G4
-
-
-
+++/-
+++/-
451
T4N0
int
G2
ND
-
ND
+++/-
++/-
474
T3N1
int
G3
ND
-
ND
-
+/-
493
T3N1
int
G3
+
-
-
-/+++
+/-
503
T3N1
int
G3
ND
-
-
-
+++/-
556
T3N2
int
G2
-
IVS1+6T→C
ND
++/-
+/-
5'-UTR-71C → G
568
T3N2
mi
G3
+
-
+♣
++/-
++/-
612
T3N0
int
G2
ND
IVS4+10C→G
-
+++/-
+/-
AAC (ASN) → AAT (ASN) bei cd751
636
T3N1
diff
+
IVS4+10C→G
ND
+++/-
+++/-∇
650
T2N0M1
int
G2
+
-
ND
-/+
++/-
675
T2N0
mi
G3
+
IVS4+10C→G
-
+/-
++/-∇
676
T3N1
int
G2
+
-
-
+++/-
-∇
680
T3N1
mi
G3
+
IVS1+6T→C
-
++/-
++/-
AAC (ASN) → AAT (ASN) bei cd751
694
T3N1
int
G1
+
-
-
+++/-
+++/-
717
T3N1
int
G3
+
-
+♣
-/+++
+++/-
726
T2N1
int
G2
+
IVS4+10C→G
-
-/+++
++/-
728
T3N0
int
G2
+
GCC(Ala)→ACC(Thr) beim cd592♦
-
-/+++
++/-
729
T3N1
int
G1
-
IVS1+6T→C
-
-/+++
+++/-
732
T2N1
int
G3
+
-
-
-/+++
+++/-
735
T4N3
diff
ND | AAC (ASN) → AAT (ASN) bei cd751
- +++ /-
+++ /- ∇
738
T3N2
diff

- -
- -∇
750
ND | AAC (ASN) → AAT (ASN) trafen sich auf cd751
+♣
++/-
+++/-
755
T2N1
int
G2
ND
-
+♥
+++/-
++/-
808
T3N0
int
G1
+
ACG(Thr)→ACA(Thr) beim cd251
+♠
+++/-
++/-
811
T2N1
int
G2
+
-
-
+++/-
-/+
832
T3N2
int
G2
+
-
-
+++/-
+++/-∇
855
T3N2
int
G2
+
-
-
+++/-
+++/-
875
T3N2
int
G2
-
IVS4+10C→G
ND
+++/-
+++/-
904
T2N0
int
G3
+
IVS4+10C→G
-
-/+++
++/-
Useful
30
3
7
21
14
Insgesamt
40
50
38
50
50
%
75
6
18
42
28
T, Tumor (Größe und Invasivität); N, Knoten (Grad der Metastasierung); M, Metastasierung; G1, gut differenziert; G2, mäßig differenziert; G3, schlecht differenziert; G4, nicht unterschieden; diff, diffuse (Grad der G4 Differenzierung =); mi, gemischt; int, Darm; traf, wahrscheinlich Metastase von Magentumor; squ, Plattenepithelzellen; LOH, Verlust der Heterozygotie; E-CAD, E-Cadherin; β-Katze, β-Catenin; IHC, Immunhistochemie; cd, Codon; UTR, nicht-translatierte Region; +, Positive LOH, anomale E-CAD-mRNA, E-CAD und β-cat IHC; - negative LOH, E-Cadherin-Gen-Mutation, aberrante E-CAD-mRNA, E-CAD und β-cat IHC; ND, nicht bestimmt oder nicht getan; +/-, ++ /- Und +++ /- mehr als 50% der Zellen positiv; - /+ - /++ Und - /+++, mehr als 50% der Zellen negativ; *, Somatische Mutation; ♦, Keimbahnmutation; ♣, Einfügung von Intron 7 zwischen den Exons 7 und 8, Stopp-Codon 374; ♥, Löschen von letzten 72 Basen von Exon 7, Exon 8 und den ersten 124 Basen von Exon 9, Stopp-Codon 322; ♠, Deletion der Exons 8 und 9; Streichung der letzten 84 Basen von Exon 8, Stopp-Codon 358; ∇, diese Proben zeigten auch zytoplasmatische Färbung für β-Catenin IHC
LOH Bestimmung
Mikrosatelliten-Marker für LOH Analyse von Chromosom 16q verwendet wurden. D16S503, D16S496, D16S421, D16S545 und D16S512 für die 16q22.1 Region enthält E -cadherin Locus (Genome Database). Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Produkte in einem Acrylamid Sequenziergel getrennt wurden, und auf eine positiv geladene Nylonmembran, Hybond-N + (Amersham, Aylesbury, UK) und bei 80 ° C für mindestens 2 h gebacken. Die nicht-radioaktive Nachweisverfahren verwendet, um die PCR-Produkte sichtbar zu machen wurde zuvor beschrieben [23]. Autoradiogramme wurden visuell durch mindestens zwei Gutachter inspiziert, DNA, die Intensität von Allelen von normalen und Tumor vergleicht. Das Fehlen oder eine signifikante Abnahme eines Allels im Tumor im Vergleich zu der normalen Referenzprobe wurde als LOH betrachtet.
Mutationsscreening
alle 16 Exons von E-Cadherin-Gens und Exon 3 des β-Catenin-Gen wurden gescreent Inaktivierung Mutationen mit einem PCR-SSCP (SSCP) Analyse auf genomischer DNA-Vorlagen. Die Primer, die für E-Cadherin und β-Catenin in der SSCP-Analyse verwendet wurden in unserem vorangegangenen Artikel [4] und Park et al. [1999] bzw. und von Pharmacia Biotech oder TAG Kopenhagen A /S angeordnet. Genomische DNA wurde bei 30 ng pro 25 ul Reaktionsmischung, die 5 pmol der Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 2.5 nmol jedes dNTP, 0,5 Einheiten DyNAzyme Polymerase verwendet. bestehend aus 30 s Denaturierung bei 72 ° C bei 94 ° C, 30 s Annealing bei 55-70 ° C und schließlich 60 s Erstreckungs Die Proben wurden in 35 Zyklen amplifiziert. Es wurde ein Warmstart durch Zugabe des Enzyms in erster Zyklus bei etwa 70 ° C nach einer Vorinkubationszeit von 5 min bei 94 ° C verwendet. Eine 4 ul-Aliquot der PCR-Produkte wurden mit 7 &mgr; l Formamid-Farbstoff gemischt (95% Formamid, 0,05% Bromphenolblau und 0,05% Xylencyanol) 10 min bei 94 ° C denaturiert und auf Eis snapcooled. Aliquots von 2 &mgr; l wurden gleichzeitig auf zwei nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen (5% Acrylamid mit 2% Vernetzung) entweder mit 5% Glycerin oder fehlt Glycerin analysiert. Die Elektrophorese wurde in 1 x TBE-Gele auf vertikalen bei 6W über Nacht oder für 6 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden als die Mikrosatelliten-Marker sichtbar gemacht. Proben mit abnormal Mobilitäts Banden wurden für 35 Zyklen wieder wie oben beschrieben amplifiziert. Ein 5-ul-Aliquot der PCR-Produkte dann mit 10 inkubiert U exonulease I und 2 U Garnelen alkalische Phosphatase übermäßige Primer und dNTPs (US70995, Amersham) zu entfernen. Die Sequenzen beider Stränge wurden durch Thermo Sequenase-DNA-Polymerase (Thermo Sequenase Radiolabeled Terminator Cycle Sequencing Kit, Amersham) unter Verwendung der beiden ursprünglichen PCR-Primer bestimmt. Wir führten die Analyse A592T-Mutation an diesen Krebsarten, mit Ausnahme der Krebs unklarer Herkunft, in der Familie der Fall 728 direkte Sequenzierung verwendet.
Aberrant mRNA
1-5 &mgr; g der Gesamt-RNA-Screening wurde in umgekehrter Richtung in cDNA transkribiert unter Verwendung von Erststrang-cDNA-Synthese-Kits (Amersham Pharmacia Biotech). Alle Proben wurden für die E-Cadherin-cDNA Deletionen und Insertionen untersucht. E-Cadherin-cDNA wurde unter Verwendung von Primerpaaren Ex7-ReX10 /2 und Ex9 /2a-rEx11 für die Region der Exons 7-10 kodiert, Calcium-Bindungsstellen [24] amplifiziert. PCR-Produkte wurden durch Agarose-Gelelektrophorese sichtbar gemacht. Abnormal Fragmente wurden ausgeschnitten und sequenziert unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimer die Grenzen der Deletionen und Insertionen zu bestimmen. Hier verwendeten wir BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Foster City, CA) und automatischen Sequenziergerät ABI PRISM ™ 3100 (Perkin-Elmer) für die Sequenzierung
Immunhistochemische Färbung
Immunhistochemie für E-Cadherin und β Catenin wurde auf 5 &mgr; m-Schnitte aus in Paraffin eingebetteten Tumorgewebeblöcke mit monoklonalen Antikörpern, E-Cadherin-5H9 und Goat Anti-Catenin Beta (Research Diagnostic, Inc. NJ, USA) durchgeführt, jeweils unter Verwendung des Antigen-Retrieval-Protokoll, das von Hazelbag beschrieben et al. [1995]. Die Tumore wurden durch Intensität der Färbung als negativ eingestuft (-), schwach positiv (+), mäßig positiv (++) und stark positiv (+++)
statistische Analyse
A Χ 2-Test oder. Fisher-Exact-Test wurde verwendet, um die Beziehung zwischen den oben genannten Parameter zu bewerten.
Ergebnisse
die Häufigkeit von LOH auf 16q22.1 Region betrug 75% (Tabelle 1). Drei
Tumoren (6%) zeigten die gleiche Missense-Mutation A592T von Exon 12, davon 2 Fälle Keimbahnmutation hatte, und in einem Fall hatte die somatische Mutation. Informationen für erkannte Polymorphismen in Tabelle 1 Drei von 187 (1,6%) normalen Personen und 1 von 280 (0,36%) Brusttumoren zeigte diese Keimbahnmutation enthalten. Die Mutation wurde nicht in 444 anderen Tumoren (Tabelle 2) .Tabelle 2 Häufigkeit der A592T Missense-Mutation bei Magenkrebs, andere Krebs und normalen Individuen
Variablen
A592T gefunden /Gesamt
%
Magenkrebs
3/50
6 Brustkrebs
1/280
0,36
Andere Krebs *
0/444
0
Normalbevölkerung
3/187
1.6
* einschließlich Kolon und Rektum, Lunge, Endometrium, Ovar, Hoden, Niere, Schilddrüsenkarzinome und Sarkome.
Zusätzlich 3 von 280 Brusttumoren zeigte eine andere Missense-Mutation GCC (Ala) → TCC (Ser) an der identischen Codon 592, von denen zwei Fälle Keimbahnmutation waren; der dritte war unklar, da das normale Gewebe nicht verfügbar war. Die histologischen Typ der 4 Brusttumoren war duktalen. In der Familie der Fall 728,
fanden wir, dass der Patient mit Hautkrebs und einer der Patienten mit Prostatakrebs zeigten die gleiche Keimbahnmutation als Fall 728. Interessanterweise keine Mutationen wurden in den Tumorproben dieser beiden Fälle nachgewiesen. Wahrscheinlich wurden die mutierten Allele während der Tumorentwicklung verloren. Der Beginn Alter für die Fälle mit Keimbahnmutationen im Stammbaum waren 78 Jahre für Fall 728, 73 Jahre für die Hautkrebs und 76 Jahren für die Prostatakrebs.
Wir haben nicht Mutation von SSCP und DNA-Sequenzierung in Exon erkennen 3 von die β-Catenin-Gens in den 50 Tumoren des Magens.
Sieben Magentumoren aberrante Transkripte des E-Cadherin zeigte. 360 Geschwülste, 369, 568, 717 und 750 angezeigt Einfügung von Intron 7 zwischen den Exons 7 und 8 Tumor 755 zeigte Löschung letzten 72 Basen von Exon 7, Exon 8 und den ersten 124 Basen von Exon 9. Tumor 808 zwei anomale mRNAs angezeigt, Schließlich davon hatte eine Deletion der Exons 8 und 9, und in einem Fall mit einer Deletion von letzten 84 Basen von Exon 8 (Tabelle 1).
, führten wir immunhistochemische Färbung von E-Cadherin und β-Catenin. Eine regionale Variation der Färbung wurde in den Tumoren nachgewiesen. Die Ritzungen +/-, ++ /- und +++ /- beziehen sich auf mehr als 50% der Zellen positiv und Ritzungen - /+, - /++ und - /+++ angibt, mehr als 50% der Zellen negativ. Negativ (-) oder reduziert (- /+ - /++, - /+++ und +/-) Expression von E-Cadherin und β-Catenin wurde in 21/50 (42%) festgestellt und 14/50 ( 28%) Fälle beobachtet. Ferner ist für β-Catenin IHC, 11 Tumoren zeigten auch positive zytoplasmatische Färbung (Tabelle 1). Ein signifikanter Zusammenhang wurde zwischen negativen oder verminderte Expression von E-Cadherin und β-Catenin (p = 0,048, Χ 2-Test) gefunden. Auch eine Assoziation zwischen einer verminderten Expression von E-Cadherin und diffuse histotype (p = 0,04, Fisher-Test).
Diskussion
die hohe Frequenz der LOH bei 16q22.1 Region stark darauf hin, dass es eine oder mehrere Tumorsuppressor-Gene in dieser Region, deren Verlust Karzinogenese von Magenkrebs auslösen könnte. Die E-Cadherin-Gen wurde auf Chromosom 16q22.1 kartiert [26]. Die reduzierte Expression und Genmutationen von E-cadherin in verschiedenen Arten von Krebs, einschließlich Magen- und lobulären Brustkrebs identifiziert wurden, was darauf hinweist, dass das E-Cadherin-Gen ein Tumorsuppressorgen ist [2-4], [13-17, 27] . In dieser Studie drei Fällen (6%) zeigte die gleiche Missense-Mutation A592T. Die Calcium-Bindungsmotive in den extrazellulären Domänen 1-5 angeordnet sind, als Schlüsselelement für die Funktion der E-cadherin angesehen, da ein synthetisches Molekül mit einer einzigen Aminosäure-Substitution in einem Calcium-Bindungsmotiv keine Klebrigkeit zeigte, [28] . Auch in humanen Zellinie MKN45 von Magenkrebs, die enge Zell-Zell-Adhäsion fehlte, eine 4-Amino-Säure-Deletion wurde an der Grenze zwischen den Exons 6 und 7, gefunden, die in Betracht gezogen wurde, die Konformation umgebenden der Schlüssel calciumbindenden zu verändern Motive und die Hafteigenschaft der E-Cadherin-Moleküle [29] abzuschaffen. Die einzelne Aminosäuresubstitution in der vorliegenden Studie wird in der fünften extrazelluläre Domäne von E-Cadherin befindet, wobei ein Calcium-Bindungsmotiv existieren könnte. Denkbar ist daher, dass die Mutationen in den drei Fällen auch in Abhängigkeit von der E-cadherin zerstört. Interessanterweise auch die drei Fälle zeigten bei 16q22.1 LOH die E-Cadherin-Locus enthält. So kann davon ausgegangen werden, dass zwei genetische Ereignisse in Inaktivierung des Gens resultierenden trat bei den beiden Allelen von E-Cadherin-Gens, respectively. Die Ergebnisse zeigten, dass das oben E-Cadherin-Gen ein Tumor-Suppressor-Gen ist, weil es in Übereinstimmung mit der klassischen Zwei hit Theorie Tumorsuppressorgene [30] ist. Frühere Studien in lobulären Brustkrebs unterstützen auch diese Stellungnahme [4, 14]. In Zelllinie MKN45 oben erwähnt (schlecht differenzierten Adenokarzinom) mit schwachen Zell-Zell-Adhäsion, eine 12-bp Rahmen Löschen von E-Cadherin-Gen und den Verlust des Wildtyp-Allels nachgewiesen wurden [29]. Aber diese Zellinie zeigte noch eine starke Expression der mRNAs und Proteine, was darauf hindeutet, dass nicht nur eine verminderte Expression, sondern auch strukturelle Anomalien sich in Inaktivierung des E-Cadherin-vermittelte Zelladhäsion System führen kann [29]. Daher ist eine einzelne Aminosäure in dieser Studie gefundene Substitutions verursachen strukturelle Veränderungen von E-Cadherin und führen zu einer begrenzten Zell-Zell-Adhäsion, obwohl zwei der Fälle (23 und 294) eine ausreichende Proteinexpression zeigten.
, Die Interessanter gleiche Sequenzvariante der somatischen und Keimbahnmutation wurde gleichzeitig in unterschiedlichen Magen-Patienten gefunden. Fall 23 mit somatische Mutation hatte einen Ausbruch Alter von 56 Jahren, aber Fälle 294 und 728 mit Keimbahnmutation hatte Ausbruch im Alter von 71 und 78 Jahren sind. Eine Erklärung für dieses Phänomen könnte sein, dass der Verlust des zweiten Allels von E-Cadherin bei 23 sehr früh aufgetreten, wodurch Karzinogenese triggerring relativ früh bei 23 aber es gibt eine andere Möglichkeit, dass diese Mutation bei 23 nur eine Rolle in der Progressions der Tumor, jedoch nicht in der Einleitung, wo andere genetische Ereignisse wahrscheinlich verantwortlich für die Einleitung des Magenkrebs sein könnte. Aber Fälle 294 und 728 mit Keimbahnmutationen hatten spät einsetzenden Alter. Dies kann, weil die Inaktivierung eines anderen Allels sehr spät aufgetreten. Ein Artikel berichtet, dass die obligatorische Träger mit abgestumpften Mutationen in E-Cadherin-Gen in ihren 80er und 90er Jahren nicht betroffen [31] blieb. Daher weitere Identifizierung von genetischen und /oder Umwelt-Modifikatoren, die für die variable Alter des Einsetzens erklären könnte durchgeführt werden soll. Speziell Fall 294 hatte drei Tumoren im Magen, die in der Regel mit genetischen Tumoren in Linie ist, mehrere zu sein [30]. Die Frequenz (6%) der Mutation A592T in 50 Magentumoren
ist fast, dass in der normalen Bevölkerung das Vierfache , was darauf hindeutet, dass diese Mutation wieder der Tat auf die Tumorgenese in einer Untergruppe von Magentumoren trugen. Futhermore, 0,36% der Brusttumoren, und keine anderen Tumoren zeigten identische Keimbahnmutation, was darauf hinweist, dass es eine histologische Unterschied für diese Mutation bei Magenkrebs und anderen Krebs sein könnte.
Beiden anderen Fällen von A592T-Mutation in der Familie ausgestellt 728. Speziell Fall wurde diese Mutation nur in entsprechenden normalen Gewebe nachgewiesen, aber nicht in dem Tumorgewebe, was darauf hindeutet, dass die mutierten Allele in der Tumorigenese verloren. Von diesen können wir, dass diese Mutation spielen keine Rolle bei der Tumorentstehung von Prostata- und Hautkrebs schließen, aber es könnte Magen-Krebs-spezifisch sein.
Wir schließen daraus, dass die A592T-Mutation, die Lebensdauer Risiko der Entwicklung von Magenkrebs erhöhen kann, aber ist eindeutig eine Sequenzvariante geringer Penetranz. Unsere Ergebnisse von zwei verschiedenen Sequenzvarianten bei Codon 592 (A592T und A592S), als Keimbahn und somatischen Mutationen, deuten darauf hin, dass dieses Codon ein Hotspot von Mutationen in Tumor Pathogenese ist., Die Grenzwerte für Einfügungen von Intron 7 und Deletion der Exons 8 und 9 sind an Spleißstellen, in Übereinstimmung mit der "GU-AG-Regel" für die mRNA-Spleißen. Es kann spekuliert werden, dass diese Veränderungen nicht durch alternatives Spleißen erzeugt wurden, da keine Beweise für alternative Splicing innerhalb Maus E-Cadherin-Gen [32] und keine anomale mRNAs nachgewiesen in noncancerous Geweben gefunden wurden. Die Mutationen an Spleißstellen sollten für die Veränderungen von E-Cadherin-mRNAs verantwortlich zu sein, obwohl keine Mutationen auf DNA-Ebene in dieser Studie gefunden wurden, vermutlich weil die SSCP für Mutationsscreening verwendet, um eine geringe Effizienz aufweist. Weitere 2 Deletionen zeigten Haltepunkte an nicht-Spleißstellen, deren Spleißen ist nicht mit "GU-AG-Regel" in der Linie, möglicherweise darauf hinweist, dass eine Umlagerung in genomischer Ebene die anomale mRNAs führen kann. Überspringen von Exon 8 oder 9 in Magenkrebs Frühere Studien haben gezeigt, [24, 33]. Diese Aberrationen können zu E-Cadherine verlieren Calcium-Bindungsmotive aufgrund des Fehlens von Exons 8 und 9 und trunkierte Moleküle wegen Rasterverschiebungsmutationen hervorgerufen durch Insertionen und Deletionen, schließlich erleichtert Streuung von Karzinomzellen.
Verminderte Expression von E- Cadherin und β-Catenin wurde in einigen Krebsarten wie Magenkrebs [8] gefunden. Heterogene oder instabile Expression sowohl für E-Cadherin und β-Catenin über wurde die Tumoren gefunden. Es wurde in 40% der Adenokarzinome E-cadherin-Spiegel wurden in ihren intravaskulären Tumor-Komponenten im Vergleich zu ihren Extravasalraum erhöht [34] gezeigt, dass. Eine Erklärung könnte sein, dass Eingang eines Karzinoms in einem intravaskulären Raum ist mit einer Hochregulation von E-Cadherin-Expression verbunden sind, und dass nachfolgende Ausfahrt in extravaskulärem Gewebe ist im Zusammenhang mit Herabregulation [35]. Da E-Cadherin und β-Catenin die entscheidenden Komponenten sind Zell-Zell-Adhäsion-Komplex zu bilden, der Verlust von ihnen können in der Unterbrechung der Funktion des Komplexes zur Folge haben, die schwache Zell-Zell-Adhäsion verursachen und invasive Eigenschaften auf einer Tumor verleihen . Weiterhin reduziert Zell-Zell-Adhäsion wird im Zusammenhang mit Kontaktverlust Hemmung der Proliferation, wodurch Entweichen von Wachstumssteuersignal schließlich Karzinogenese von menschlichem Krebs auslösende [8]. In dieser Studie wurde eine Assoziation zwischen abnormale Expression von E-Cadherin und β-Catenin gefunden, dass der Verlust der E-Cadherin-Bindungs ​​darauf hindeutet, kann eine Umverteilung von β-Catenin von der Zellmembran in das Cytoplasma führen. Die erhöhte freie β-Catenin im Zytoplasma in den Zellkern transloziert konnte und zur Aktivierung der Genexpression führen. Dies wird durch die Ergebnisse gestützt, dass zwei Fällen (676 und 738) zeigten negative Färbung in der inneren Oberfläche der Membran, und positive Färbung in Cytoplasma, gleichzeitig. Aber auch andere 9 Tumoren (Tabelle 1) zeigt, moderate oder starke Färbung in Membran auch positive Färbung im Zytoplasma zeigte, was darauf hindeutet, daß die normale Zersetzung des freien β-Catenin in Zytoplasma inhibiert wird. Auch fanden wir einen Zusammenhang zwischen abnormale Expression von E-Cadherin und diffuse histotype, was darauf hinweist, dass die Änderungen des E-Cadherin kann eine Rolle bei schlecht differenzierten Magentumoren spielen. Interessanterweise anomale Expression von E-Cadherin und /oder der catenins wurde für kurze Überleben bei Patienten mit Magenkrebs [8] ein unabhängiger prognostischer Marker erwiesen. Von besonderem Interesse ist der Befund, dass E-Cadherin ist ein unabhängiger Prädiktor für okkulten Lymphknoten und Mikrometastasierung in Knoten als No durch Routine histopathologischen Methoden klassifiziert [8].
Schlussfolgerungen Unsere Ergebnisse
unterstützen, dass Veränderungen von E-Cadherin und β-Catenin eine Rolle bei der Initiierung und dem Fortschreiten von Magenkrebs spielen. Expression beider Gene in Magenkrebs reduziert, aber der Mechanismus der Herunterregulierung ist nicht klar. LOH, Mutationen und Veränderungen in der RNA-Splicing einen Teil der Herunterregulierung der E-Cadherin bei Magenkrebs erklären könnte.
Erklärungen
Danksagung
Diese Arbeit wurde von der isländischen Research Council, der University of Iceland Wissenschaft unterstützt wurde Fonds und die isländische Cancer Society.
Konkurrierende Interessen
Keine erklärt

• Eine Fall-Kontroll-Studie über die Wirkung von Apolipoprotein E Genotypen auf die Magenkrebsrisiko und progression
• Support-Vektor-Maschine-Modell für die Diagnose von Lymphknotenmetastasen bei Magenkrebs mit Multidetektor-Computertomographie: eine Vorstudie