PLoS ONE: espressione condizionale di Wnt9b in cellule SIX2-positivi Distrugge stomaco e funzione renale

Astratto

Durante lo sviluppo del rene, canonica Wnt attiva la differenziazione, mentre il fattore di trascrizione SIX2 mantiene la piscina progenitore. Questi segnali opposti aiutano a regolare la formazione nefrone e garantire la serie completa di nefroni si formano. Dal momento che questi due fattori di controllo destini diversi per mesenchima renale, abbiamo ipotizzato che la sovraespressione di Wnt9b
in SIX2
esprimente cellule sarebbero interrompere la formazione del rene e possono alterare le decisioni di differenziazione cellulare in altri tessuti. Abbiamo creato un topo transgenico che condizionalmente espresso la canonica ligando Wnt nel rene in via di sviluppo, Wnt9b
. Il transgene è attivato da cre ricombinasi ed esprime GFP. In primo luogo abbiamo testato la sua attività biologica con Hoxb7-cre
verificando che transgenici Wnt9b era in grado di indurre i geni di differenziazione e di salvataggio dello sviluppo del rene in Wnt9b ^{- /- mice
omozigote carente. Al contrario, l'espressione di Wnt9b
nelle cellule utilizzando SIX2-cre
causato disturbi gastrointestinali e insufficienza renale grave nei topi adulti. reni transgenici hanno avuto numerosi tubuli cistica e valori di creatinina elevati (0,652 ± 0,044) rispetto ai topi wild-type (0.119 ± 0.002). Questi animali esposti anche uno sfintere valido pilorica, reflusso duodenogastric, e una trasformazione dello stomaco distale in destino prossimale. I cambiamenti di espressione genica osservati per il Wnt9b: EGFP
transgene sono stati confrontati con un stabilizzato allele β-catenina per determinare che Wnt9b sta attivando la via canonica Wnt nei tessuti analizzati. Questi risultati dimostrano che l'espressione di Wnt9b
in SIX2
cellule -positive sconvolge decisioni destino cellulare nel rene e del tratto gastrointestinale}

Visto:. Kiefer SM, Robbins L, Rauchman M (2012) espressione condizionale di Wnt9b in SIX2
celle -positivo Distrugge stomaco e funzione renale. PLoS ONE 7 (8): e43098. doi: 10.1371 /journal.pone.0043098

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Giappone

Ricevuto: February 29, 2012; Accettato: 17 luglio 2012; Pubblicato: 17 ago 2012

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Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzione R01 DK067222 (http://nih.gov/) e l'American Heart Association Fondata Investigator 0840117N (http://www.heart.org) per MR. SK è stato sostenuto da una sovvenzione del Fondo di Saint Louis University presidenziale Research (www.slu.edu). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

La via canonica Wnt è un regolatore chiave del destino delle cellule, la proliferazione cellulare, e l'adesione delle cellule durante lo sviluppo e per tutta l'età adulta. Numerosi mediatori positivi e negativi sono stati identificati che lavorano insieme per raggiungere stretta regolazione della segnalazione β-catenina. Il paradigma centrale è che citoplasmatica β-catenina è sequestrato in un complesso di distruzione, fosforilata da GSK3β, e mirata alla via distruzione ubiquitina in assenza di un segnale Wnt. inibisce Wnt vincolante fosforilazione e la distruzione di β-catenina, permettendogli di traslocare al nucleo di influenzare l'espressione genica bersaglio con fattori TCF /LEF (recensito da MacDonald et al. [1]). Numerosi modelli di topo sono stati creati per studiare questo percorso che comprende sia il guadagno e la perdita di alleli funzionali di Wnts, recettori Wnt, β-catenina, e le TCF /LEF trascrizionali regolatori. Questi modelli hanno scoperto un ruolo essenziale per la canonica segnalazione Wnt nelle ossa, capelli, intestino, il sangue, e il cancro [2]. Un tema che emerge da questi studi è che molti processi biologici sono molto sensibili alla forza della canonica Wnt.

Questa stretta regolamentazione della canonica Wnt è essenziale per lo sviluppo del rene. Durante le fasi iniziali della formazione dei reni, Wnt9b è secreto dalla gemma ureterale e segnali alle cellule progenitrici del mesenchima tappo di indurre il differenziamento nefrone. Il trattamento con cloruro di litio o attivazione di β-catenina può indurre il differenziamento nephron in assenza della gemma ureterale e Wnt9b, suggerendo che un aumento canonica Wnt è sufficiente per questo evento induttiva [3], [4]. Alcune cellule tappo mesenchima proliferano per mantenere le cellule progenitrici che sono necessari per le successive iterazioni di questo processo [5]. Questo equilibrio tra manutenzione progenitore e l'induzione della differenziazione è di fondamentale importanza garantire che il rene costituisce la serie completa di nefroni [5], [6], [7], [8], [9].

Diversi fattori espressi nel mesenchima tappo hanno dimostrato di antagonizzare differenziazione Wnt-stimolata tra cui il fattore di trascrizione SIX2
. Soppressione di SIX2
risultati nella differenziazione ectopica, l'esaurimento dei progenitori tappo mesenchima, e agenesia renale [9]. Sebbene l'esatto meccanismo non è ancora noto, una ipotesi è stata proposta per cui alti livelli di canonica Wnt guidare l'impegno per la differenziazione, mentre elevata attività SIX2 nelle stesse cellule mantiene il destino progenitore [7]. Abbiamo creato un nuovo modello di topo per iperespressione condizionale Wnt9b di attivare il canonico percorso di segnalazione Wnt. Abbiamo utilizzato questo modello per verificare se una maggiore attività Wnt9b è sufficiente a rompere l'equilibrio tra i progenitori e differenziazione nel mesenchima tappo.

Un secondo sito in cui sia l'attività SIX2 e Wnt segnalazione giocano un ruolo importante è lo sfintere piloro . Lo sfintere pilorico è formata all'estremità distale dello stomaco e funziona come una valvola per consentire una corretta digestione del cibo prima del suo ingresso nel duodeno. La disfunzione dello sfintere può causare reflusso del contenuto duodenale nello stomaco che presentano un aumentato rischio di metaplasia gastrica e cancro [10], [11]. Questa regione è anche il sito di anomalie congenite, tra cui la rara malattia da reflusso primario duodenogastric e il più comune difetto di nascita stenosi pilorica [12]. carenza SIX2
porta ad agenesia dello sfintere piloro e antagonizzare l'attività Wnt con Sfrp1 e SFRP2 è necessario per modello stomaco [13], [14]. Questo ci ha portato a ipotizzare che l'attività canonica Wnt deve essere strettamente regolata in piloro simile a ciò che è stato proposto nel rene. Per verificare questa abbiamo usato SIX2
-cre per attivare il Wnt9b
transgene in SIX2
esprimere domini nel rene e stomaco.

Il condizionale Wnt9b
allele transgenico riportato qui esprime Wnt9b
e GFP quando attivato da cre ricombinasi. E 'biologicamente attiva e in grado di salvare la formazione di rene in Wnt9b ^{- /-
embrioni. Sovraespressione di Wnt9b
sul nascere ureterale rene è in grado di indurre geni associati con la differenziazione di tappo mesenchima, ma non subisce mesenchimali-to-epiteliali di transizione (TEM) per la produzione di strutture vescicolari morfologicamente distinte. Wnt9b
attivazione del transgene in SIX2
cellule -positive causa cisti renali e una trasformazione delle regioni dello stomaco distale in prossimale destino stomaco. Confronto di Wnt9b
transgenici per un allele che produce stabilizzati proteine ​​β-catenina dimostra variazioni geniche dose-reattivi e suggerisce che questi ceppi rappresentano una serie allelica che dovrebbe essere utile per modulare canonica Wnt in altri tessuti.}

Risultati

topi transgenici esprimono Wnt9b quando attivato da ricombinasi cre

Il transgene Wnt9b è stato costruito con una cassetta LOX-STOP [15] per creare un Wnt9b condizionalmente attivo che dipende da cre ricombinasi per l'espressione (Fig. 1A). Una volta attivato, il transgene-espresso Wnt9b è distinguibile da endogena Wnt9b perché contiene un tag influenza emoagglutinina epitopi C-terminale e cellule transgeniche esporrà fluorescenza GFP a causa della cassetta IRES-EGFP. Per testare la fedeltà del transgene, abbiamo esaminato l'espressione cre-dipendente in cellule in coltura e in vivo in embrioni (Fig. 1B). Epitopo-tagged Wnt9b era rilevabile nei lisati di cellule co-trasfettate con il transgene e un plasmide cre, e non in trasfezioni del solo transgene. Allo stesso modo, lisati da embrioni che sono stati positivi sia per Wnt9b e β-actina-CRE transgeni contenevano Wnt9b-FLU mentre singoli transgenici Wnt9b no. Fluorescenza GFP è stata osservata in Wnt9b /β-actina-cre embrioni doppie positivi e non in Wnt9b cucciolata (Fig. 1C-F). Il livello di espressione di transgenici Wnt9b correlato con l'intensità di fluorescenza GFP per ogni linea fondatore. (Fig. 1D). Quattro linee fondatore indipendenti sono stati in grado di produrre in diretta β-actina-cre ^{tg /+, Wnt9b TG /+ doppio cuccioli eterozigoti, dimostrando che onnipresente espressione elevata Wnt9b è embrionale letale. Analisi degli stadi embrionali ha rivelato che il β-actina-cre tg /+, Wnt9b TG /+ doppi embrioni eterozigoti sono stati rilevati in meno del previsto frequenze mendeliana a E11-E12. Una singola doppia embrione eterozigote è stato osservato da uno dei fondatori ad altissima espressione (Fig. 1A, n = 23, frequenza attesa del 25%) e il 16% è stato osservato da uno dei fondatori diverso (n = 25). Wnt9b /ß-actina-Cre doppie embrioni transgenici hanno avuto piccoli cuori con il pool di sangue, suggerendo insufficienza cardiaca come la causa della morte.}

transgenico Wnt9b è biologicamente attivo

Per determinare se transgenico Wnt9b è biologicamente attiva, abbiamo testato se fosse in grado di sostituire wild-type Wnt9b
durante lo sviluppo del rene. Wnt9b <sup>- /-
embrioni mostrano alta penetranza palatoschisi e fenotipi agenesia renale (Fig. 2). L'attivazione del transgenico Wnt9b sul nascere ureterale con Hoxb7
-cre salvato formazione di rene, ma non palato chiusura a E14.5 in tutta la Hoxb7
-cre tg /+, Wnt9b
- /-, Wnt
9 ter TG /+ embrioni (n = 7). Questo salvataggio specifici rene conferma che l'espressione transgenica Wnt9b dipende attivazione cre, perché il palato non esprime Hoxb7
-cre. PCR quantitativa di wild-type, Wnt9b - /- Comprare e Wnt9b - /-
, Wnt9b tg /+ reni transgenici hanno rivelato che transgenici Wnt9b
era espresso a livelli 2.3- volte superiori rispetto il gene wild-type, mentre l'espressione di Ret
è rimasto invariato (Fig. 2 G-I). La capacità di transgenico Wnt9b per segnalare al mesenchima per sostituire wild-type Wnt9b
attività conferma che è biologicamente attivo in vivo.</sup>

Un patrimonio di dati ha dimostrato che Wnt9b e β-catenina segnalazione sono segnali induttivi critiche che avviano la differenziazione di tappo mesenchima in vescicole renali epitelizzata [4], [8], [16]. Wnt9b prodotta sul nascere ureterale attiva il canonico percorso di segnalazione Wnt nel mesenchima adiacente e si traduce in l'espressione dei geni che regolano mesenchimali a epiteliali transizione (MET). Pertanto, abbiamo testato se la sovraespressione di Wnt9b
sul nascere ureterale segnalerebbe al mesenchima per attivare l'espressione genica TEM e per promuovere una maggiore induzione di nefroni. Wnt9b
è stato overexpressed sul nascere ureterale con Hoxb7
-cre: EGFP. embrioni E12.5 sono stati genotipizzati mediante analisi PCR quantitativa per determinare se fossero emizigote o omozigote per la Wnt9b
transgene e reni sono stati raccolti per l'analisi di espressione genica. Abbiamo rilevato un aumento dose-dipendente della Wnt9b
che è stato accompagnato da una attivazione proporzionale di espressione dei geni bersaglio Wnt9b, Wnt4
, Pax8
, e Fgf8
in tre vasche indipendenti di reni transgenici (Fig. 2J). SIX2
si esprime in indifferenziata (cap) mesenchima e è inibiti la differenziazione delle vescicole ne deriva [17]. SIX2
espressione di mRNA non è influenzato in Hoxb7
-cre, Wnt9b
doppi transgenici. Allo stesso modo, i geni ureterali gemma, Ret
e Wnt11
, non sono significativamente alterato dalla sovraespressione di Wnt9b
. L'up-regolazione specifica di geni nel mesenchima conferma che transgenico Wnt9b è in grado di segnalare dalla gemma ureterale per indurre i geni importanti per il TEM, tuttavia, nessuna evidenza istologica di ectopiche vescicole renali epitelizzata era evidente (dati non riportati). Questo suggerisce che upregulation di Wnt9b
sul nascere ureterale è sufficiente per l'attivazione del gene nel mesenchima, ma non per la differenziazione morfologica delle vescicole renali.

misexpression di Wnt9b sconvolge la funzione renale e la formazione sfintere pilorico attivando canonica β-catenina segnalazione

il paradigma emergente nel rene è che c'è un delicato equilibrio tra rinnovamento progenitore sé e l'attivazione di differenziazione [6], [7], [9]. Il percorso /β-catenina Wnt9b è necessario per la differenziazione e SIX2 sopprime la differenziazione nella fase iniziale di impegno. Pertanto, abbiamo ipotizzato che la capacità di SIX2 di promuovere decisioni destino opposto a quelli attivati ​​da una elevata attività β-catenina potrebbe essere un tema comune in fase di sviluppo. Abbiamo testato questa possibilità tramite l'attivazione di transgenici Wnt9b
con SIX2
-cre. I doppi transgenici esprimono Wnt9b
nelle stesse cellule che esprimono SIX2
e potrebbe disturbare i processi che vengono regolati in modo coordinato a livello renale e in altri tessuti. SIX2-cre ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
topi esposti angoscia allo svezzamento e misurazioni di peso corporeo sono stati ridotti del 39% in quattro settimane (14,5 ± 3,4 grammi, p < 0,001) rispetto al cre-negativi Wnt9b TG /+
nidiata (23,6 ± 0,7 grammi). L'analisi fenotipica ha rivelato che questa riduzione del peso corporeo è dovuto a malformazioni del sistema gastrointestinale e reni, due siti di SIX2
-cre espressione (Fig. 3).}

Numerosi cisti di varia dimensioni erano visibili nella corteccia e midollo dei reni eterozigoti doppie (Fig. 4, n = 11/11). Le cisti sono stati prevalentemente situati nella corteccia e midollo esterno ed erano di origine tubulo prossimale come dimostrato da LTL-colorazione. La malattia cistica è stato il primo evidente subito dopo la nascita (P7-10) nei segmenti prossimali del nefrone (dati non riportati). Questi doppi animali eterozigoti esposti elevati livelli di creatinina sierica in (0,652 ± 0,044, p < 0,005) rispetto al controllo cucciolata (0,119 ± 0,002) fin da ~3 settimane di età, che indicano una grave insufficienza renale. animali più vecchi con malattia avanzata contenevano anche cisti derivanti dai segmenti più distali tra di Henle (Tamm-Horsfall-positivo). In tutti gli animali con insufficienza renale avanzata esaminati, abbiamo osservato molti di raccolta cisti del dotto di derivazione che esprimevano Aquaporin 2 o legati D. Biflorus
-lectin. Dal momento che SIX2
-cre non si esprime nel dotto collettore, questa dilatazione è probabilmente secondario alla dilatazione in segmenti più prossimale. La presenza di cisti renali in Wnt9b
animali transgenici rafforza la conclusione che l'alterazione del sistema di segnalazione Wnt causa la malattia cistica [7], [18], [19].

Anche se le cisti renali sono stati non presente fino a dopo la nascita, upregulation di canonica Wnt era evidente a E12.5 quando SIX2
-cre è inizialmente espresso. espressione della proteina LEF1 è stata aumentata in aggregati pre-tubolari e strutture vescicolari renali in doppia transgenici ed è stata ulteriormente aumentata nelle numerose vescicole ectopici formate nei reni beta-catenina stabilizzati (N = 3, Fig. 5). L'aumento dose-sensibile in espressione LEF1 supporta pubblicato dati che Wnt9b agisce se la Wnt canonica via di segnalazione nel rene in via di sviluppo [7]. La mancanza di strutture vescicolari ectopiche nel Wnt9b
transgenici suggerisce che il Wnt9b
allele mostra un effetto moderato sulla segnalazione β-catenina rispetto al stabilizzato allele β-catenina.

Il secondo fenotipo contribuire alla riduzione del peso corporeo in SIX2-cre ^{tg /+
, Wnt9b TG /+
doppi eterozigoti era disturbi gastrici. liquido amniotico gialla è stata osservata nello stomaco di doppi transgenici e non in singoli littermates transgenici (n = 6, Fig. 6). Ciò indica che il reflusso duodenogastric stava accadendo e potrebbe essere causa di anormale formazione sfintere piloro. Lo sfintere tra lo stomaco e il duodeno è stato allungato e allargato nel doppio transgenico (Fig. 6, riquadro). L'antagonista TGFβ, Nephrocan, che è normalmente espressa in un modello molto ristretta a E16.5, è stato espanso in doppi transgenici, suggerendo che la regione dello sfintere non è stato correttamente vincolato. Questa morfologia allungata stato supportato da colorazione immunoistochimica dello strato muscolare liscia che forma la parete muscolare densa circonda piloro (Fig. 6 E, F). In singoli controlli transgenici, la muscolatura più spesso è stato trovato dove il tessuto presenta più costrizione al sfintere (line). Nel doppio transgenici, muscolosità denso è stato osservato, ma questa regione è stata compensata dalla zona che era il più ristretto.}

difetti Mis-patterning sono stati osservati anche analizzando marcatori specifici che distinguono tra prossimale (H ^{+ /K + ATPasi) e blu) distale (Alcian dello stomaco. Lo stomaco prossimale (corpo) contiene H + /K + ATPasi-esprimendo cellule parietali che sono esclusi dalla regione antro-piloro. Al contrario, l'antro-piloro contiene cellule della mucosa che macchiano con Alcian blu che non si trovano nella regione prossimale [20]. I doppi transgenici esposti persistente H + /K + ATPasi colorazione e l'assenza di Alcian mucosa blu-positivo nel antrale stomaco-pylorus che indica che la regione distale è mis-fantasia al destino prossimale da Wnt9b
espressione. Alcian colorazione blu delle cellule caliciformi nell'intestino era intatto in transgenici sia singole e doppie, perché SIX2
-cre non si esprime nel duodeno. Questa mis-patterning suggerisce che, simile al paradigma nel rene, canonica di segnalazione β-catenina specifica uno destino, la regione forestomach, e modelli di attività SIX2 l'identità distale. Questo è supportato da i domini di espressione di questi geni da un reporter canonica Wnt presenta un'elevata attività solo nel il prestomaco, e SIX2
si limita allo stomaco distale e piloro [13], [14].}

Se canonica Wnt è responsabile per il reflusso gastro-in SIX2-cre ^{TG /+
, Wnt9b TG /+
doppie transgenetica, poi le malformazioni osservato dovrebbe essere ricapitolato in un modello di topo che esprime una β-catenina stabilizzato nello stesso dominio ( CTNNB1 EX3 /+
, [21]). Dopo l'attivazione cre, questo allele previene la degradazione proteolitica di β-catenina e ci si aspetta di elevare canonica segnalazione Wnt in misura maggiore rispetto alla sola Wnt9b ligando. Tutta montare analisi in situ di stomaco E12.5 rivelato tre geni, Grem1
, NKX 2.5
, e GATA3
, che sono normalmente espressa in una sottile fascia demarking la regione che diventerà lo sfintere (n = 8, Fig. 7). espressione ectopica di Wnt9b
soppresso l'antagonista BMP Grem1
e il fattore di trascrizione GATA3
in questa regione, e questi geni sono stati ulteriormente smorzati quando segnalazione β-catenina è stato aumentato. Un'espansione dose-dipendente è stata osservata per il fattore di trascrizione Nkx2.5
in entrambi i mutanti. I geni che sono stati localizzati esclusivamente per l'intestino ( villin
) o per il prestomaco ( Bmp4
) non sono stati alterati in entrambi i mutanti (dati non mostrati). Aumento canonica Wnt nello stomaco antrale e piloro stata confermata isolando questa regione e eseguire PCR quantitativa. I canonici geni target di Wnt che sovraregolati nei stabilizzato allele β-catenina, LEF1
e Axin2
, sono stati anche aumentato nella regione pilorica di SIX2
-cre tg /+, Wnt9b TG /+ doppi transgenici [ LEF1
, 2.0 ± 0.25 e Axin2
, 1,4 ± 0,06 (n = 6)]. Insieme, il gene cambiamenti di espressione di dose-reattiva osservate nella regione pilorica in Wnt9b
transgenici e gli embrioni β-catenina stabilizzate dimostrano che l'aumento del segnale Wnt canonica sconvolge lo stomaco distale e lo sviluppo dello sfintere piloro.}

Discussione

Questi risultati descrivono la creazione di un nuovo modello di topo che attiva condizionalmente canonica Wnt. Il Wnt9b
transgene è inducibile in seguito all'esposizione a cre ricombinasi ed esprime la GFP come marcatore di induzione. Mantiene inoltre piena attività biologica in quanto può salvare Wnt9b ^{- /-
fenotipi nel rene. Questi topi sono stati mantenuti nella nostra colonia per oltre un anno e indurre Wnt9b
espressione sul allevamento a più ceppi CRE differenti. Abbiamo utilizzato questo nuovo ceppo di attivare segnalazione Wnt in SIX2
cellule -positive e ha trovato effetti deleteri nel rene e stomaco.}

Nel rene, Wnt9b è secreta dal dell'epitelio ureterale bocciolo per indurre le cellule progenitrici tappo mesenchima adiacenti per avviare la differenziazione. A sostegno di questo modello, il nostro in vivo guadagno-di-funzione studi dimostrano che Wnt9b
upregulates marcatori precoci di differenziazione delle vescicole renale come Wnt4
, Fgf8
e Pax8
. Tuttavia, anche se i geni vescicole renali sono indotti dalla Wnt9b
transgene, non abbiamo osservato evidenza morfologica di un aumento o ectopica formazione di vescicole renali, come riportato per SIX2
mutanti [9]. Oltre a un segnale Wnt induttiva, i fattori che mantengono la piscina progenitore renale (ad esempio, SIX2
) devono essere inibiti per suscitare completamente la formazione di vescicole renale. SIX2
espressione non è stato alterato nel nostro Wnt9b
transgenici e possono quindi spiegare perché l'aumento di Wnt9b non ha comportato vescicole renali ectopiche. l'induzione ectopica di marcatori vescicola renali è indotta da attivazione di β-catenina in SIX2
-positivo mesenchima metanephric utilizzando il stabilizzato allele β-catenina [4], di conseguenza, la differenza tra questi due esperimenti guadagno-di-funzione possono riguardare il grado in cui si attivano l'attività Wnt canonica. Inoltre, è probabile che l'attivazione del segnale canonico Wnt9b in mesenchima metanefrico induce l'inibizione di feedback, come osservato in altri tessuti sensibili Wnt, impedendo così l'induzione del programma di differenziazione completa [22]. Dati recenti supportano questa idea di inibizione Risposte Poiché è necessaria Wnt9b segnalazione /β-catenina non solo per la differenziazione dei mesenchima metanephric, ma, paradossalmente, lo stesso segnale è necessario anche per la manutenzione o l'espansione del pool progenitore renale [7]. Noi ipotizziamo che il stabilizzato β-catenina, che agisce a valle nella via, può aggirare questi meccanismi di regolazione. Queste possibilità potrebbero essere testati in studi futuri in che confrontano l'attivazione del gene a valle in cellule progenitrici renali utilizzando il Wnt9b
transgene e stabilizzato β-catenina topi guadagno-di-funzione.

perturbazioni nella canonica percorso di segnalazione Wnt hanno dimostrato di essere importante nella patogenesi della malattia cistica renale (recensione da Patel et al. [23]). transgenici espressione di un β-catenina stabilizzato o carenza di APC in epiteli tubulare renale conduce alla malattia cistica renale, a sostegno della conclusione che ectopica canonica Wnt è sufficiente per cystogenesis [18], [19]. L'insufficienza renale e dilatazione cistica in SIX2
-cre ^{tg /+, Wnt9b TG /+ doppi eterozigoti supporta inoltre l'ipotesi che upregulated canonica Wnt provoca cisti. Turbativa di non canonica Wnt (PCP) percorso è importante anche nella formazione di cisti renali [24]. Pertanto, è possibile che la formazione di cisti nel nostro modello non è semplicemente dovuta all'attivazione di segnalazione canonica, ma è il risultato di avaria al relativo equilibrio tra la segnalazione canonica e non canonica. A sostegno di questa idea, i geni che sono mutati nelle forme ereditarie della malattia cistica ( PKD1
, PKD2
, PKHD1
, Inversin
) localizzare a ciglia e questi organelli sono stati recentemente dimostrato di essere in grado di regolare l'equilibrio tra canonico e non canonico segnalazione Wnt [25], [26].}

C'è stato un grave fenotipo rene, anche se Wnt9b
mRNA è aumentata ~2 volte nel nostro transgene, che indica che livello relativamente basso, persistente attivazione di questa via conduce alla disfunzione renale. Questo livello di up-regolazione di Wnt9b sul nascere ureterale con Hoxb7
-cre non ha prodotto cisti, suggerendo che cystogenesis nei dotti collettori in SIX2
-cre ^{tg /+, Wnt9b TG /+ doppi transgenici è probabilmente un effetto secondario di segmenti tubolari dilatati (dati non riportati). A sostegno di questo, nella fase di post-natale giorno 7-10 animali, malattia cistica è evidente in segmenti solo tubolari prossimali al condotto di raccolta. Simile alla malattia renale policistica nei pazienti, i topi transgenici hanno sviluppato grave insufficienza renale, anche se la maggior parte nefroni non sviluppano cisti. Questo solleva la questione se tubuli renali senza cisti palesi sono anormali e contribuiscono in modo significativo alla compromissione funzionale progressivo in questi disturbi. Recenti studi dimostrano che adulte renali epiteli dei tubuli esprimono Wnt9b, i recettori Frizzled e LRP5 /6 co-recettori che sono in grado di mediare canonica Wnt in risposta al danno ischemico acuto [27]. In questa impostazione, Wnt segnalazione promuove la riparazione e la rigenerazione dei tubuli. Tuttavia, l'attività di segnalazione Wnt è stata anche coinvolta nella promozione della fibrosi renale dopo l'infortunio, come ad esempio nel modello UUO [28]. Nel complesso, questi studi sottolineano l'importanza di regolare segnalazione Wnt nel rene adulto per bilanciare le risposte benefiche, quali la riparazione /rigenerazione, e le risposte disadattivi che portano alla fibrosi e disfunzione d'organo cronica.}

La regione pilorica dello stomaco rappresenta un confine critico che separa lo stomaco da intestino. chiusura dello sfintere quando un bolo alimentare entra nello stomaco consente una corretta digestione prima di transito verso l'intestino tenue. La base molecolare per la formazione di questa regione discreta non è ben compreso, anche se alcuni dettagli stanno emergendo. Questi risultati suggeriscono che uno stretto controllo di segnalazione Wnt è di vitale importanza per lo sviluppo del piloro. Canonical attività Wnt viene rilevato nel fondo ed il corpo (corpo), ma escluso dallo stomaco distale e piloro [13]. In Barx1
- /- mice, lo stomaco è piccolo, il confine antro-corpus è sfocata e non vi è agenesia dello sfintere piloro. studi tessuto ricombinazione eleganti suggeriscono che questi fenotipi il risultato di perdita di espressione del Wnt antagonisti Sfrp1 e SFRP2. Tuttavia, dal momento che carenza Barx1
ha effetti globali sullo sviluppo foregut, non era chiaro se down-regolazione dell'attività Wnt canonica sia specificatamente richiesto per la formazione del piloro. I nostri studi testate più direttamente questa possibilità di mira l'attività Wnt ectopica di una regione ristretta solo anteriore al piloro con SIX2
-cre.

Abbiamo scoperto che l'attività ectopica Wnt sconvolge specificamente formazione del piloro sfintere in assenza di difetti globali di sviluppo stomaco. Così, down-regolazione dell'attività Wnt canonica è tenuto a motivo della regione pilorica che separa lo stomaco da intestino. espressione ectopica del legante Wnt9b e stabilizzato β-catenina in topi transgenici potrebbe superare gli effetti della secrete endogeni antagonisti Wnt Sfrp1 /2, in coerenza con il modello proposto da Kim et al [13]. Simile ai nostri risultati, in SIX2
mutanti ci sia ridotta espressione di Nkx2.5
e Gremlin
, geni che sono importanti per lo sviluppo dello sfintere piloro in pulcino [14] , [29]. Ciò suggerisce che SIX2
e Wnt
regolano una cascata genetica comune nella sfintere pilorico presuntiva. Abbiamo postulato che una funzione importante di SIX2
può essere quella di interpretare i segnali canonici Wnt in diversi contesti di sviluppo.

sovraregolata canonica Wnt è stato anche mostrato di influenzare la milza e lo sviluppo del pancreas [30]. A sostegno di questo, la milza e il pancreas ipoplasia è stata anche osservata in SIX2
-cre, Wnt9b
topi bi-transgenici (dati non riportati). Dal momento che SIX2
-cre non si esprime in questi tessuti, questo suggerisce che i segnali provenienti dal mesenchima posteriore dello stomaco possono influenzare la milza e il pancreas durante lo sviluppo. Ciò sostenere l'ipotesi che la regione pilorica può agire come un organizzatore per formazione di questi organi accessori. Durante lo sviluppo, cellule precursori milza transientemente associano con la regione pilorica, prima della loro migrazione verso sinistra dello stomaco dove si condensano [31]. Anche se non abbiamo rilevato SIX2
-cre espressione nel primordio della milza o mesotelio, non possiamo escludere che l'espressione transiente di SIX2
-cre in queste regioni è responsabile per difetti nella milza e pancreas . Futuri studi sono necessari per verificare direttamente queste possibilità.

In sintesi, abbiamo sviluppato un nuovo modello di topo che permette di espressione temporale e spaziale di Wnt9b. Nel rene in via di sviluppo, transgenici Wnt9b
può indurre presto MET espressione genica in SIX2
progenitori renali -positive, ma non è sufficiente per attivare il programma completo di differenziazione. espressione persistente del Wnt9b in SIX2
cellule -positive porta a cisti renali e insufficienza d'organo grave. Nello stomaco, ectopica Wnt attività β-catenina nella regione pilorica altera la formazione dello sfintere e distale patterning stomaco. Insieme, questi risultati sottolineano l'importanza di uno stretto controllo delle attività di Wnt e suggeriscono che SIX2 e β-catenina sono coinvolti in patterning dell'organo in contesti diversi.

Materiali e Metodi

Etica dichiarazione

Gli studi su animali sono stati approvati dal comitato di cura degli animali e l'uso di Saint Louis University (protocollo 1460) e il St. Louis VA (protocollo 0305). Tutte le procedure che coinvolgono gli animali erano in conformità con le istituzionali benessere degli animali regolamenti, norme e politiche.

Mouse

Wnt9b
topi transgenici sono stati incrociati per ognuna delle tre diverse linee CRE [32 ]. 1) cre β-actin- è stato utilizzato per esprimere Wnt9b ubiquitariamente (Fig 1, [33]) 2) Hoxb7
-cre:. EGFP è stato utilizzato per iperespressione Wnt9b nella sua posizione endogena nel rene, la ureterale gemma (Fig 2, [34].), e 3) la BAC SIX2
-cre: EGFP transgene è stata utilizzata per esprimere Wnt9b esogena nello stomaco e il rene (figure 3, 4, 5, [. ,,,0],35]).

• PLoS ONE: Blocchi insettivore Digest chitina nello stomaco Utilizzando acida mammiferi Chitinase
• PLoS ONE: Integrazione di stomaco contenuti e analisi degli isotopi stabili di quantificare le diete di Pygoscelid Penguins