PLoS ligų sukėlėjai: Caveolin-1 Apsaugo B6129 Pelės prieš Helicobacter pylori gastritas

Abstraktus

Caveolin-1 (Cav1) yra pastolių baltymų ir patogenas receptoriaus virškinamojo trakto gleivinę. Lėtinis infekcija skrandžio epitelinių ląstelių Helicobacter pylori
( h. Pylori
) yra svarbus rizikos veiksnys žmonėms skrandžio vėžiu (GC), kur Cav1 yra dažnai žemyn reguliuojama. Tačiau Cav1 funkcija H. Helicobacter pylori infekcija
ir patogenezė GC liko nežinoma. Mes parodome, kad čia Cav1 trūkumas pelės, užsikrėtę 11 mėnesių su CagA-pristatymo trūksta H. pylori
padermės SS1, sukūrė daugiau sunkia gastritas ir audinių žalą, įskaitant negautą pakauškaulio ląstelių ir foveolar hiperplazija ir rodomas mažesnis kolonizaciją skrandžio gleivinės nei laukinio tipo B6129 littermates. Cav1 null pelėmis parodė sustiprintas infiltracija makrofagų ir B-ląstelių ir sekrecijos chemokinus (intervaluose), tačiau sumažino lygį nuo CD25 ^{+ reguliavimo T-ląstelių. Cav1 trūkumas žmogaus GC ląstelių (AGS) užsikrėtusios CagA-pristatymo įgudę H. pylori
padermės G27, buvo jautresni CagA susijusių Citoskeletas streso morphologies ( "dūzgiantis paukštis"), palyginti su AGS ląstelių stabiliai transfektuotose Cav1 (AGS /Cav1). Infekcija "AGS /Cav1 ląstelių sukėlė į P120 RhoGTPase įsijungiantis baltymų /pašalintas kepenų vėžio-1 (p120RhoGAP /DLC1) iki Cav1 ir neutralizuoti CagA sukeltos Citoskeletas pertvarkymų įdarbinimo. Žmogaus GC ląstelių linijas (MKN45, N87) ir pelės skrandžio audinio H. pylori
žemyn reguliuojama endogeninio išraišką iš Cav1 nepriklausomai CagA. Mechaniškai h. pylori
aktyvuota sterolio reaguoja elementas surišančio baltymo-1 (SREBP1) nuslopinti transkripciją žmogaus Cav1 geno iš sterolių reaguoja elementų (SSR) į proksimalinės Cav1 rengėjas. Šie duomenys rodo, apsauginį vaidmenį Cav1 prieš H. pylori
indukuotų uždegimas ir audinių pažeidimas. Mes siūlome, kad H. pylori
išnaudoja žemyn-reguliavimo Cav1 nuversti šeimininko imuninę reakciją ir skatinti signalizacijos jo virulentiškumo veiksnių šeimininko ląsteles.}

Autorius Santrauka

infekcija bakterijos Helicobacter pylori
( h. pylori
) daugiausia pasireiškia vaikams besivystančiose šalyse, kuriems gresia pereiti į skrandžio vėžiu (GC), kaip suaugusiems po daugelio metų nuolatinės infekcijos, ypač su padermių, kurios yra teigiamas onkogeninė virulentiškumo faktorius CagA. Likvidavimo H. pylori
pagal antibiotikų yra pasirinkimo gydymo, bet taip pat gali būti pakeistas jautrumą alergijos ir kitų tipų navikais. Taigi, nauji diagnostiniai arba prognostiniai žymenys yra reikalingi, kurie aptikti ankstyvus molekulinius pokyčius, skrandžio gleivinės lėtinio uždegimo perėjimas prie vėžio metu. Mūsų tyrimo duomenimis, mes nustatėme, kad navikas slopintuvas caveolin-1 (Cav1) mažinamas nuo infekcijos H. pylori
ir CagA buvo pakankamas, bet nėra būtina šiam žemyn reguliavimą. Praradimas Cav1 sukėlė H. pylori
-dependent aktyvavimo sterolio reaguoja elemento surišančio baltymo-1 (SREBP1) ir šis įvykis panaikino Cav1 sąveiką su P120 RhoGTPase įsijungiantis baltymų /ištrintas kepenų vėžio-1 (p120RhoGAP /DLC1), sekundės , bona fide
navikas slopintuvas skrandžio audinio. Įtikinamai, Cav1 ir DLC1 gali būti naujus molekulinius žymenis į H. pylori
-infected skrandžio gleivinę prieš neoplastiniu transformacijos epitelio

nurodomoji dalis:. Hitkova aš juanis G Anderl F Gerhardas, M, Kirchneris T Reu'as S et al., (2013) Caveolin-1 Apsaugo B6129 Pelės prieš Helicobacter pylori pervežimas gastritas. PLoS Pathog 9 (4): e1003251. Doi: 10,1371 /journal.ppat.1003251

redaktorius: Steven R. blanke, Ilinojaus universitetas, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Gegužės 23, 2012; Priėmė: Vasario 4, 2013 m Paskelbta įnešta 11 balandžio 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Hitkova et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė dotacijų EB ir MPAE iš Deutsche Krebshilfe (108287) ir DFG (BU-2285). MPAE taip pat remia dotacijas iš Deutsche Krebshilfe (107885) DFG (SFB 824 TP B1), Else kronos Stiftung (NR P14 /07 //A104 /06) ir BMBF (Mobimed 01EZ0802;. KMU-innovativ Nėra 0315116B The finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Helicobacter pylori
( h. pylori
) yra gramneigiamų bakterijų, kurios kolonizuoja skrandžiai apytiksl. 50% pasaulio gyventojų ir padidina riziką plėtros lėtinis gastritas, skrandžio opa liga, skrandžio gleivinės limfoidinis audinys (MALT) limfoma, gleivinės atrofija ir skrandžio vėžys (GC) [1], [2]. remiantis šiuo etiologijos, H. pylori
buvo klasifikuojami kaip I klasės kancerogenams Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) 1994 m. [3]

dvi pagrindinės h. pylori
toksinai [4], CagA ir Vaca, internalizuojami į skrandžio epitelinės ląstelės pagal įdėjimo dėl bakterijų IV tipo sekrecijos sistemos (CagA) [5] arba tiesiogiai įdėjimo į lipidų plaustus (Vaca) [6], [7]. Lipidų plaustai yra cholesterolio ir sfingolipidas turtingas microdomains iš plazminės membranos [8], [9], kuris yra išnaudojamas daug patogenų, įskaitant virusų, parazitų ir bakterijų, kad būtų lengviau įsisavintų visą organizmų ir /ar internalizavimo toksinų į šeimininko ląsteles [ ,,,0],10], [11], [12]. Pavyzdžiui, Neisseria spec
. naudoja lipidų plaustų bei Ro-tarpininkaujant signalizavimo aktino citoskeleto prieiti prie citozolyje [13]. Pseudomonas aeruginosa
išnaudoja lipidų plaustas susijusios rinkliavos panašaus receptoriaus 2 infekcijos plaučių epitelio ląsteles [14].

Caveolin-1 (Cav1) yra 21-24 kDa pagrindinis ir esminis struktūrinis baltymas caveolae, specializuota forma lipidų plaustas microdomains. Caveolae yra 50-100 nm, kolba /tube formos invaginations kraujo plazmoje membranos gausiai makrofaguose, endotelio ir lygiųjų raumenų ląstelių, I tipo pneumocytes ir adipocitų, kur jie dalyvauja korinio transporto procesų, įskaitant Endocitozė, cholesterolio ištekėjimo ir membranos eismo [15] , [16]. Atsižvelgiant į tai, Cav1 taip pat gali veikti kaip klatrinas nepriklausomas Endocitozė ir bloko patogeno /toksinas įsisavinimo [17], [18] inhibitorius. Per privalomas jo pastolių domeną, Cav1 tiesiogiai slopina receptorių ir fermentų, įskaitant tirozino kinazės src ir Ras šeimos, G-baltymų ir azoto oksido synthases [15] gausa. Be membranos eismo vaidmenį, Cav1 todėl yra valdymo platformą ląstelių dauginimasis ir išgyvenimas [19]. Cav1 taip pat daro svarbų funkciją ląstelių judrumui ir migracijos ir per epitelio, stromos ir endotelio audinių, įgyvendindama ląstelių ląstelių ryšius, ląstelių matrica sukibimą ir imuninį atsaką [20], [21], [22], [23] .

Cav1 tiesiogiai jungiasi cholesterolio ir transkripcija Cav1 neigiamai reglamentuoja transkripcijos faktorius sterolio reaguoja elemento surišančio baltymo-1 (SREBP1) [24]. SREBP1 yra susietas su Endoplazminis tinklas (ER), kaip neaktyvų 125 kDa pirmtakas ir yra aktyvuota sąlygomis cholesterolio trūkumas pagal saitą proteolitinio skaldymo į Goldžio. Tai skaldymas po perkėlimo veikliosios 68 kDa SREBP1 į branduolį, kur jis jungiasi su sterolio-reaguoja elementų (SSR) tikslinių genų, įskaitant Cav1, dalyvauja sintezės cholesterolio ir riebalų rūgščių [25]. h. pylori
buvo parodyta Pritaikysime cholesterolio iš priimančiosios ląstelės membranos, ir priimančiosios cholesterolio keičia onkogeninių savybes CagA [26], [27].

Todėl hipotezę, kad cholesterolio prisijungiančių baltymų SREBP1 ir Cav1 yra tikslai H. Helicobacter pylori infekcija ir
/arba efektorines funkcijas. Tiksliau, mes paklausė, ar (i) H. pylori
išnaudoja Cav1 palengvinti injekcijos ir žemyn upelio signalizavimo CagA skrandžio epitelinių ląstelių arba (ii) Cav1 veikia kaip apsauginis "kliūčių vykdymo" baltymo, neutralizuoja liga sužadintą H. pylori
. Norėdami tai patikrinti, kad fenotipų, kurios atsiranda iš H. pylori
infekcija buvo tiriamas Cav1-stokojančių pelių ir žmogaus GC ląstelių linijų. Mūsų duomenys rodo, kad Cav1 apsaugotas B6129 peles su H. pylori
AMŽIAUS gastritas ir audinių pažeidimas, in vivo
nepriklausomai CagA. h. pylori pat
aktyvuota SREBP1 ir žemyn reguliuojama išraišką pelių ir žmonių Cav1 nepriklausomai nuo CagA. Be to, Cav1 neutralizuoti CagA priklausomi Citoskeletas pertvarkymai in vitro
pagal įdarbinimo naviko slopintuvas ištrintas kepenų vėžio-1 (DLC1).

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

tyrimai su gyvūnais buvo atliekami suderinus su etikos gairių Technische Universität München (Vokietijos gyvūnų apsaugos įstatymas, Deutsches Tierschutzgesetz) ir buvo patvirtintas (7.2-1-54-2531-74-08) iki Bavarijos vyriausybė

Gyvūnai

Homozigotinė Cav1 nokautas (Cav1-KO) (įtempimo Cav1tm1Mls /J; Inventorinis numeris 004.585) (Regierung von ÖBB, Miunchenas, Vokietija.). ir atitiko kontrolė laukinių -type (WT), (kamieno B6129SF2 /J; Inventorinis numeris 101045) pelės (8 savaites) buvo gauti iš Jackson laboratorijos (Bar Harbor, Meinas) ir palaikoma ant mišrios fone patogeno be pelės įrenginio [28], [ ,,,0],29]. Eksperimentinis skrandžio opos buvo atliktas su indometacinu, kaip paskelbta prieš [30]. Infekcija pelių su pele pritaikytos CagA /Vaca-pristatymo nepakankamo H. pylori
padermės SS1 buvo atliktas per zondą, kaip aprašyta [31]. Vidutinis laikas pelės iš skirtingų genetinių sluoksnių (C57BL /6, B6129, BALB /c) imtis pereiti į lėtinį gastritą ir už jos ribų (skrandžio atrofija, hiperplazija, displazija) [32] svyruoja tarp 10 ir 15 mėn nuo infekcijos su standartine nuoroda padermės SS1 [28], [33], [34], [35]. Todėl mes nusprendėme per šį laikotarpį atlikti mūsų analizę.

Reagentai

chemikalai iš Merck (Darmstadt, Vokietija) ar Sigma (Taufkirchen, Vokietija). Polikloniniai imuniniai serumai buvo SREBP1 (# PA1-46142, Thermofisher Mokslinė, Waltham, MA), Cav1 (N-20, SC-894), SREBP1 (C-20, SC-366), CagA (B-300, SC-25.766) , FAK (A-17, SC-557), PHOSPHO-FAK (Tyr-397, SC-11765), Hsp90 alfa /beta (H-114, SC-7947), Lamin /C (H-110, sc- 20.681, visi iš Santa Cruz Biotech ". CA), bendrosios ir PHOSPHO ERK1 /2 (P44 /P42), p38, JNK (visi iš ląstelių signalizacijos, Danvers, MA) ir Ki-67 (SP6 DCS GmbH", Hamburgas, Vokietija ). Pelės monokloniniai antikūnai buvo Cav1 (ɢ.406) ir PHOSPHO-Cav1 (pY14,ɣ.338) (abu iš BD /perdavime Lab., San Chosė, CA) DLC-1 (C-12, SC-271.915) ir beta-Actin (AC-15, SC-69.879) (abu iš Santa Cruz Biotech.). Makrofagų konkrečių žiurkių anti-pelės F4 /80 antikūnas (# MF48000) buvo gauta iš Invitrogen (Life technologies ", Darmstadt, Vokietija). Vištienos kovos h. pylori
polikloninis Ab "buvo naudojamas kaip aprašyta [36]. Serumas citokinai buvo matuojamas ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN) pagal gamintojo instrukcijas. Išskleidžiamajame Kiekybinėje mažų GTPases Ro /RAC /Cdc42 buvo įsigytas iš Biocat (Heidelberg, Vokietija).

Mobilusis kultūra

žmogaus embrioninių inkstų (HEK293), Madin-Darby šunų inkstų ( MDCK), tėvų žmogaus GC ląstelių linijas (MAA, MKN45, N87) (visi iš Amerikos tipas kultūros kolekcijos, Rockville, MD) ir stabiliai perkeltų klonų jų generuojami išliko kaip aprašyta anksčiau [37]. Infekcija ląstelių su ląstelių pritaikytos CagA-pristatymo įgudę H. pylori
padermės G27 buvo atliktas iki [36].

DNR konstruktai

išraiška plazmidės pEGFP-CagA buvo minėta kitur [38]. ~800 Bp fragmento, proksimalinės žmogaus Cav1 promotoriaus (AF019742, pozicija 69 859) [24] buvo amplifikuotas iš genominę DNR žmogaus normalios kepenys ir klonuotas į KpnI /Hind III vietų pGL3-Luc liuciferazės reporterio plazmidės ( Promega GmbH ", Manheimas, Vokietija). Izoformos 4 žmogaus DLC1 mRNR [39] (DLC1v4, NM_001164271.1) buvo papildytas iš žmogaus hepatomos HepG2 ląstelių ir įdėta į BamHI /NotI svetainėse ekspresijos vektorius pTarget (pt, Promega GmbH "). Transient transfekciją ir liuciferazės tyrimai buvo atliekami, kaip ir anksčiau [37].

bakterijų kultūros pervežimas

H. pylori
SS1 ir G27 bakterijos buvo susigrąžinta iš -80 ° C temperatūroje glicerolio atsargų ir auginami Wilkins-Chalgren (WC) kraujo agaro lėkštelės pagal microaerobic sąlygomis (10% CO2, 5% O2, 85% N2; 37 ° C) 2-3 dienas. Pelė pritaikyta h. pylori
SS1 buvo paruošta iš agaro plokščių vivo
infekcijų paskelbtas anksčiau [31]. SS1 padermės buvo PGR teigiamas CagA
genų ir iRNR, bet nebuvo įleisti funkcinę CagA baltymų [40], kaip akivaizdu iš "dūzgiantis paukštis" fenotipas užkrėstų AGS ląstelių nebuvimas (duomenys nebus rodomas) , Ląstelių pritaikytos h. pylori
bakterijos CagA-pristatymas įgudę G27 WT
ir CagA-išbraukta mutantas G27 delta CagA
buvo surinktos iš agaro lėkštelėse, o vėliau išaugo nuolat bendradarbiavimo kultūrą MDCK ląstelių, kaip aprašyta [36].

ex vivo
kiekybinis kolonijas sudarančių vienetų (CFUs)

Sveikos skrandžiai buvo pašalintų iš pelių ir kolonija formavimas lėmė iš esmės, kaip aprašyta [31] , Antralinių juostelės iš skrandžio buvo pasverti, patalpintas į 5 ml Brucella sultinio ir pavartomas 10 min. buvo paruošti skiedinius 1:10, 1:100 ir 1:1000 ir 100 mikrol kiekvieno praskiedimo buvo padengtas į H. pylori
-selective WC kraujo agaro lėkštelės. Bakterijų kolonijų skaičius buvo nustatyta po to, 5 dienas ir pritaikoma prie atitinkamų skrandžio vienetų masės.

perdirbimas pelės skrandžio audinių

Likusi skrandžio plautas su steriliu vandeniu. Antralinių juostelės buvo sumažinti, užšaldomos skystame azoto ir saugomi -80 ° C temperatūroje, kol RNR ekstrakcijos. Skrandžio likusi dalis buvo dedamas į 3 ml 4% (w /v) paraformaldehido (PFA) į fosfatinio buferio druskų tirpalu (PBS) ir inkubuojama 24 h, esant 4 ° C temperatūroje. Tada skrandis buvo supjaustyti išilgai į didesnį ir mažo kreivumo į dvi dalis, po dehidratacijos ir įdėjimas į parafiną ir histologiniai analizė.

gentamicino apsauga tyrimas

Ląstelės buvo užsikrėtę H. pylori
G27 įtampą nuo 2 iki 24 val esant infekcijos gausos (MOI) iš 500:1. Po to, ląstelės tris kartus buvo plaunamos PBS, kad būtų pašalintas likęs bakterijas ir buvo papildomai inkubuojami 2 h, esant 37 ° C temperatūroje, drėgnoje atmosferoje DMEM /F12 (10% FCS, 10% Brucella sultinio), papildytoje su gentamicino (200 mikrogramų /ml ), penicilino /streptomicino (100 mikrogramų /ml) ir chloramfenikolio (100 mikrogramų /ml). Nėra ekstraląsteliniuose bakterijų buvo patvirtinta po mikroskopu, o ląstelės vėliau buvo lizuoti aptikti intraceliulinės CagA Vakarų dėmė (WB).

Coimmunoprecipitation (CoIP) ir Vakarų dėmė (PB)

aptikimas immunoprecipitated baltymų SDS-PAGE ir WB buvo atliktas kaip ir anksčiau [41]. Matrica-padeda Lazeriniai desorbcija /jonizavimo masių spektrometrija (MALDI-IS) buvo išsamiai aprašyta [29].

Imunofluorescentinis

Dažymo buvo atliktas trijų spalvų režimas vizualizuoti 4,6- diamidino-2-fenilindolo (DAPI) Alexa-488 ir -594 naudojant skaitmeninio fotoaparato prijungtas (Axiovision, atleiskite 4.4) fluorescencijos mikroskopu (Axiovert 200M, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Halbergmoze, Vokietija). Confocal mikroskopija (Axiovert 40, Zeiss ") ir 3D rekonstrukcija H. pylori
-infected ląstelių LSM510 (Zeiss) ir Volocity (Improvision, Tübingen, Vokietija) buvo padaryta, kaip ir anksčiau [37].

organų įvertinimas ir imunohistocheminis (IHC)

Lėtinis aktyvus gastritas buvo apibrėžtas tuo pačiu metu buvimas tiek neutrofilinių polymorphnuclear (PMN) ir vienabranduolėse ląstelių (limfocitų ir plazminių ląstelių) per skrandžio gleivinę. Aktyvus (PMN) ir lėtinis (mononukleininėje) Infiltrate buvo įvertintas taip: Parafinas įterptųjų skrandžio audinių buvo supjaustyti 3 mkm skyriuose naudojant pusiau automatinį Mikrotoms (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Vokietija). Tuomet skyriai buvo dažomi hematoksilinu & Eozinas (H & R) sprendimai. Histopatologinė analizė buvo atliekama trimis patologai (CR, SR TK) apakinti į studijų setup. Morfologiniai pakitimai skrandžio gleivinės buvo klasifikuojami pagal atnaujintą Sidnėjaus sistemą [32], [42]. Gastrito įvertinimas pelnytas remiantis intramucosal uždegiminių infiltratų iš vienabranduolių ir PMN ląstelių tankio, kaip paskelbta prieš [43]: nė vienas (0), švelnus (1+), vidutinio sunkumo (2+) ir sunkus (3+). Be to, hiperplazinių ar regeneracinių epitelio pakitimai, buvo pastebėti praradimas pakauškaulio ląstelių ir limfinių folikulų ar limfinio agregatų dažnio. Iš H intensyvumas. pylori
kolonizacija į skrandžio gleivinę buvo įrašytas kaip nesunkus (kelių ir pavienių bakterijų atsitiktinių platinimas), vidutinio sunkumo (vienviečiai ir sugrupuotos bakterijų diskretinio platinimas) ir sunkus (tankus bakterijų grupių, apimančių skrandžio gleivinės nuolat sluoksnių). buvo nustatomas kelis daugybė įvairiuose regionuose, skrandžio. Imunohistocheminis (IHC) buvo atliktas parafino skyrius, kaip aprašyta anksčiau [44].

elektroforeziniai mobilumas perėjimas analizė (EJSA), chromatino imunoprecipitacijos (ChIP), atvirkštinės transkripcijos PGR (RT-PGR) ir kiekybine PGR (qPCR)

ChIP (komplektas iš Upstate, miliporų GmbH, Schwalbach, Vokietija) ir visų kitų metodų buvo atliekami taip, kaip aprašyta anksčiau [45]. Oligonukleotidai yra išvardytos S1 lentelėje.

ląstelių tyrimais

gyvybingumas nuo lipnių ląstelių buvo matuojamas pagal 1- (4,5-dimetiltiazol-2-il) 3,5-difenil-formazano (MTT ) Analizės (Roche Diagnostics GmbH ", Manheimas, Vokietija), kaip rekomenduoja gamintojas. Siekiant nustatyti ląstelių sukibimą, 1 × 10 ^{4 ląstelės buvo pasėjamos į 6 cm ląstelių kultūrų lėkštelėse nuo 1 iki 6 h, po to kartojasi plovimo su PBS. Likusios prisitvirtinę ląstelės buvo nustatyti su 4% (m /t) PFA PBS, nudažomi su violetinei ir vėliau skaičiuojami naudojant ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Žaizdų gijimą, depresiją tyrimai buvo atliekami iš esmės, kaip aprašyta [46]. Trumpai, ląstelės buvo auginamos iki susiliejimo 6 cm patiekalai, ir 5 mm įbrėžimams buvo įvesta į monosluoksnio apverstos mėlyną galiuką, po inkubuojant ląstelių kultūros plokščių papildomos 24, 48 ir 72 h. Žaizdų uždarymas buvo stebimas nuo fiksuojamos ir dažomos ląstelių su violetinei naudojant šviesią lauko mikroskopija (Axiovert 200m, "Carl Zeiss MicroImaging GmbH").}

Statistika

Rezultatai priemonės ± Fondų biržoje iš ne mažiau kaip 5 gyvulių vienetų kiekvienai genotipo arba 3 nepriklausomų eksperimentų iš skirtingų ląstelių persėjimų. Programinė įranga GraphPad prizmė (versija 4.0, La Jolla, CA) buvo naudojamas analizuoti duomenis. P-vertės (* p < 0,05) buvo apskaičiuotas naudojant Stjudento t ir Fišerio tikslius bandymus

Stojimo numeriai

Žmogiškųjų: Cav1:. NM_001753.4, Q03135; B2M: NM_004048.2, P61769; IL8: NM_000584.3, P10145; DLC1 V1: NM_182643.2, Q96QB1; DLC1 V4: NM_001164271.1, Q96QB1; ACS: NM_018677.3, Q9NR19; HMGCoAS: NM_001098272.2, Q01581; HMGCoAR: NM_000859.2, P04035; LDLR: NM_000527.4, P01130; beta Actin: P60709; Lamin A: P02545; Lamin, C: P02545; Hsp90 alfa: P07900; Hsp90 Beta: P08238; ERK1 (P44): P27361; ERK2 (P42): P28482; FAK: Q05397; JNK1: P45983; JNK2: P45984; p38: Q16539; Src: P12931; SREBP1: P36956; Ki-67: P46013; Pelė: Cav1: NM_007616.4, P49817; B2M: NM_009735.3, Q91XJ8; TNFalpha: NM_013693.2, P06804; IFNgamma: NM_008337.3, P01580; IL1beta: NM_008361.3, P10749; IL6: NM_031168.1, P08505; CD4: NM_013488.2, P06332; CD19: NM_009844.2, P25918; CD25: NM_000417.2, P01589; CD86: NM_019388.3, ​​P42082; CCL5: NM_013653.3, P30882; CXCL1: NM_008176.3, P12850; PPARg2: NM_015869.4, P37231; TFF2: NM_009363.3, Q9QX97; Šuo: B2M: NC_006612, XP_850148; h. pylori
: CagA: YP_002266135.1, B5Z6S0; UreB:. YP_626814.1, Q1CV82

Rezultatai

Cav1 trūkumas pelių rodyti sustiprintą gastritas ant užsikrėtimo CagA-pristatymo nekompetentingi H. pylori
SS1

Jei įvertinti histologinius pokyčius, kuriuos sukelia skrandžio audinio ant H. pylori
infekcija, B6129 WT ir Cav1-KO pelėms buvo užsikrėtę pelės pritaikyti ir CagA-pristatymo netobuli H. pylori
padermės SS1. Pelėms buvo numarinti 11 mėnesių vėliau, ir H. pylori
buvo izoliuotas nuo rezekcijos skrandžio audinio [31]. Cav1-KO pelėmis parodė mažiau bakterijų kolonizaciją skrandžio gleivinės nei WT pelėmis (7,3 ± 2,4 WT , palyginti
1,6 ± 0,5 KO × 10 ^{3 KSV /mg skrandžio audinius; * p = 0,0141; n = 15 už genotipo) (1 pav.). Histopatologinė analizė parodė, kad tiek WT ir Cav1-KO pelių sukūrė aktyvaus lėtiniu gastritu kartu vienbranduoliniq ir polymorphnuclear (PMN) ląstelių į skrandžio gleivinę (1b pav.). Priešingai, neinfekuotiems WT ir Cav1-KO pelių neturėjo intramucosal uždegimą (duomenys neparodyti). Vietoj to, gastritas buvo gerokai sustiprintas H. pylori
-infected Cav1-KO pelėms, palyginti su užsikrėtusiais WT pelėmis (pav. 1c). Be Cav1-KO pelių, vidutinis balas gastritas (0,7 ± 0,2 WT , palyginti
1,7 ± 0,1 KO; * p = 0,0002, N = 15 už genotipo) buvo sunkesnė (1 lentelė) nei WT pelių ir skrandžio gleivinė eksponuojami intramucosal B-ląstelių folikulų, foveolar hiperplazija ir praradimo pakauškaulio ląsteles. Šie duomenys rodo, kad Cav1-trūkumas siejamas su padidėjusia uždegiminio atsako į skrandžio gleivinę ir mažiau efektyvus kolonizacijos H. pylori
.}

Cav1-trūkumas skatina įdarbinti makrofagų į užkrėstą skrandžio gleivinės

Jei įvertinti imuninių ląstelių, kurios prisideda prie H tapatybę. pylori
AMŽIAUS uždegimas Cav1-KO pelių RT-qPCR analizė pasirinktų citokinų, paviršiaus žymenų ir chemokinus buvo atlikta (Pav. 2a). Sutampa su stebimos uždegimas h. pylori
SS1 sukeltas išraišką TNFalpha ir IFNgamma į skrandžio gleivinę tiek WT ir KO pelių. Be to, mes pareiškė padidintą iRNR išraišką CD19 (B-ląstelių) (1,6 ± 0,3 WT , palyginti
3,3 ± 0,9 KO; p = 0,0512; n = 15 už genotipo) ir RANTES (CCL5) (1.3 ± 0,2 WT , palyginti
2,1 ± 0,6 KO; p = 0.0449, n = 15 už genotipo) skrandžio audinio H. pylori
-infected Cav1-KO pelėms, palyginti su užsikrėtusiais WT pelių. Priešingai, iRNR lygiai CD4 (T-pagalbininkas ląstelių) CD25 (T reguliavimo elementai) ir CD86 (antigeno-pateikiančių ląstelių) buvo slopinama H. pylori
nepriklausomai nuo Cav1 statusą. Imunohistocheminis (IHC) aptiko gerokai padidėjo intramucosal F4 /80-teigiamų makrofagų skrandžio audinio infekuotų Cav1-KO pelėmis, lyginant su WT littermates (2b pav.). CD3 teigiamas limfocitai buvo įsikūręs aplink ir per intramucosal folikulų (duomenys neparodyti).

Panašūs rezultatai buvo gauti atlikus eksperimentus įvedant greito skrandžio žalą pelių injekcijos indometacino [30] (Fig.S1). Suderinamas su sustiprinto audinio pažeidimas Cav1-KO skrandžiai (* p = 0,0161, WT, , palyginti
KO, n = 9 už genotipo), pasižymi uždegimą, erozijos ir opų, Cav1 trūkumas pelėms taip pat išreiškė didesnes sumas nuo mRNR koduotę opos gydymas baltymus trilapis faktoriaus-2 (TFF2) (0,8 ± 0,3 WT , palyginti
2,3 ± 0,4 KO; * p = 0,0048; n = 9 už genotipo) ir peroksisomų proliferatorių aktyvuota receptoriaus gama (PPARg) (0,6 ± 0,2 WT , palyginti
2,5 ± 0,5 KO; * p = 0,0008; n = 9 už genotipo). Apibendrinant, šie duomenys rodo, kad nuostoliai Cav1 pagerina pelių jautrumą skrandžio uždegimas ir audinių pažeidimas.

Cav1 nei keičia sukibimas H. pylori
padermių nei išlikimo žmogaus GC ląstelių

Jei įvertinti Cav1 funkciją H metu. pylori
infekcija in vitro
, žmogaus skrandžio epitelio ląstelių linija buvo naudojama "AGS kuris buvo stabiliai perkeltų su Cav1 ekspresijos plazmidės (AGS /Cav1) arba tuščias vektoriaus (AGS /EV) [37]. Pirma, mes nagrinėjo, ar Cav1 įtakoja ląstelių išgyvenimą po H. pylori
infekcija (3A pav.). AGS klonai su ir be Cav1 buvo užsikrėtę 48 h su ląstelių pritaikytos CagA-pristatymo kompetentingos H. pylori
deformacijų G27 skirtingais daugiskaitos infekcija (VRM) nuo 1:100 į 1:2000. Kolorimetrin MTT tyrimai parodė, kad Cav1 neturėjo bendro išgyvenimo AGS ląstelių įtaką H. pylori
infekcija. Panašūs rezultatai buvo gauti CagA-pristatymo nekompetentingi H. pylori
SS1 ir Vakarų dėmė (PB) analizė aptikti išraišką ir fosforilinimo išgyvenamumo kinazės (AKT /PKB, ERK1 /2, p38MAPK) (duomenys neparodyti). Nes abu h. pylori parsisiųsti ir Cav1 bendrauti per lipidų plaustų, mes paprašėme, ar sukibimas bakterijų ląstelių priklauso nuo Cav1 buvimą. AGS /Cav1 ir AGS /EV ląstelės buvo užkrėstas (MOI = 10) su G27 (pav. 3B, C) arba SS1 (duomenys neparodyta) bakterijos, nuo 30 min, po to nuplauti vandeniu ir po to inkubacijos šviežią terpę 2 val. Po to, ląstelės buvo dažomos imunofluorescenciniam mikroskopijos, ir bakterijų skaičius, kuris prie jos prisijungusios Cav1 išreiškiančias, iš arba tuščios vektoriaus-transfekuota ląstelės buvo skaičiuojamas (pav. 3B, C). buvo pastebėtas tarp AGS /Cav1 ir AGS /EV ląstelių nėra sukibimo skirtumai, o tai rodo, kad Cav1 neturi įtakos sukibimą H. pylori
bakterijos šeimininko ląsteles.

Cav1 apsaugo žmogaus GC ląsteles nuo CagA sukeltos pertvarkymo citoskeleto

Adatų-kaip projekcijomis ( "dūzgiantis paukštis") formavimasis yra tipiškas morfologinis fenotipas AGS ląstelių atsakas į infekcijos CagA-pristatymo įgudę H. pylori
atmainos ir perkėlimas CagA į citozolyje [47]. Išnagrinėti Cav1 vaidmenį šiame streso sukeltos pertvarkymo aktino citoskeleto, AGS /Cav1 ir AGS /EV buvo užsikrėtę 16 h su H. pylori
G27 WT
arba izogeninių mutantas, Delta CagA
(VRM = 100). Užkrėstose ląstelėse buvo dažomi, kaip aprašyta aukščiau, ir, kad pailgų AGS ląstelių numeriai buvo nustatomas (. 4A pav, B). Cav1 trūkumas AGS ląstelės parodė žymiai pailgi morphologies nei Cav1 ekspresija ląstelių (11 ± 0,8% AGS /EV , palyginti
4 ± 0,8% AGS /Cav1; *, p = 1,1 × 10 ^{-8; n = 3 klonus). Kaip ir tikėtasi, ne "dūzgiantis paukščių" fenotipas buvo gautas užkrėstų su CagA-pristatymo ląstelių netobuli SS1 arba CagA-delecinio mutanto G27 Delta CagA
padermes, kurios yra negali švirkšti funkcinę CagA baltymų į šeimininko ląsteles (duomenys neparodyta). MAA /EV ląstelės taip pat gamina daugiau IL8 iRNR po H. pylori
G27 infekcija nei AGS /Cav1 ląstelių (64 ± 19 E. , palyginti
19 ± 6 Cav1; * p = 0,0176; n = 3 klonus) (pav. 4c). Šie duomenys rodo, kad Cav1 apsaugo nuo CagA susijusių ląstelių stresą.}

remiant šias išvadas, ląstelių sukibimą ir žaizdų uždarymui normos buvo ryškesni AGS /Cav1 palyginti su AGS /EV ląstelių (Fig.S2). Atitiktų savo funkciją kaip tikslinės baltymų CagA ir komponento židinio sąaugų [48], Pasaulio banko analizę (4D pav.) Taip pat nustatė aukštesnius lygius (0,4 ± 0,1 AGS /EV , palyginti
1,4 ± 0,1 AGS /Cav1 * p = 0,0012; n = 3 klonus) iš fosforilinto židinio sukibimo kinazės (FAK) yra Cav1 ekspresija ląstelių užsikrėtusių H. pylori
G27. Šie duomenys patvirtina, kad AGS /Cav1 ląstelės užsikrėtę CagA-pristatymo kompetentingos H. pylori
išlaikytas jų plitimui Išsiregistravimo epitelio formą, palyginti su pabrėžė pailgos fenotipas Cav1 /EV ląsteles.

CagA-pristatymas kompetentinga h. pylori
G27 sukelia privalomas p120RhoGAP /DLC1 į Cav1 žmogaus GC ląstelių

Cav1 buvo įrodyta, kad būti fosforilinamos citozolio tirozino kinazės (Src, Abl) ne tirozino 14 [49], ir fosforilinarai Cav1 ir src tiek įjungti mažų GTPases Ro /RAC /Cdc42 kurios reglamentuoja citoskeleto funkcijas [13], [50]. Norėdami nustatyti pagrindinės molekulinės mechanizmą, kaip Cav1 apsaugo nuo CagA susijusių ląstelių stresą, įvertinome inicijuotus CagA-pristatymo įgudę H signalizavimo būdus. pylori
G27. Infekcija AGS ląstelių sukėlė greitą fosforilinimo Cav1 į AGS /Cav1 ląstelių ir Src tiek AGS /Cav1 ir AGS /EV ląsteles. Šis rezultatas rodo, kad Cav1 veikia pasroviui nuo CagA-priklauso nuo Scr aktyvavimo bet prieš srovę nuo mažų GTPases aktyvavimo (pav. 5A, B). Suderinamas su šia išvada, baltymų lygius fosforilinto JNK, kurioje gyvena žemiau ir Src, buvo didesnis AGS /EV ląstelių, lyginant su AGS /Cav1 ląsteles.

Mes negalėjome aptikti tiesioginį bendravimą arba kiekybinei colocalization iš CagA baltymų arba h. pylori
G27 bakterijos su Cav1 į CoIP ar imunofluorescencines eksperimentai (. 6A pav B). Gentamicinu apsaugos tyrimai parodė, kad bendra suma iš liejamo ląstelėje CagA taip pat buvo nepriklausoma nuo Cav1 akivaizdoje (6c pav.). Taigi, Cav1 nei slopino sukibimas H. pylori
bakterijų, nei CagA injekcija į šeimininko ląstelę, o sumažino žemyn srauto poveikį CagA ant ląstelėje signalizacijos.

Jei nustatyti kandidatūrą baltymą, kuris suteikia apsaugą nuo CagA A Cav1 priklausomas būdas, buvo atliktas baltymų sąveika ekranas remiantis MALDI-MS (7A pav.). MAA /Cav1 ląstelės buvo užsikrėtę 16 h su H. pylori
G27 (MOI = 100), po kurio kambario temperatūroje MES-buferines 1% (v /v) Triton-X100 irimas ląstelių. Baltymų juostos nusodinti Cav1 antiserumo buvo regimos sidabrine žyme, ir buvo nustatyta peptidų MALDI-MS, kaip paskelbta anksčiau [29]. Baltymų fragmentas ~95 kDa esančius peptidai atitinkantį variantą 4 P120 Ro GTPase įsijungiantis baltymų /ištrintas kepenų vėžio-1 (p120RhoGAP /DLC1) [51], [52], navikas slopinamojo susijęs su židinio sąaugų ir caveolae /lipidų plaustai [53]. DLC1 variantas 4 (DLC1v4) turi prognozuojamą dydį ~110 kDa ir praturtino mėginiuose iš ląstelių, kurios buvo užsikrėtę H. pylori
G27, palyginti su sveikų ląstelių (lentelė S2). Šie rezultatai buvo patvirtinti CoIP iš Cav1 ir endogeninio DLC1 baltymų AGS /Cav1 ląstelių (pav. 7b), nurodant, kad H. pylori
G27 sukėlė konkrečią įdarbinimą DLC1 į Cav1 infekuotų žmogaus skrandžio epitelinių ląstelių.

Šis rezultatas paskatino mus išplėsti kDNR varianto 4 žmonių DLC1 [39] iš žmogaus hepatomos HepG2 ląstelių (pav . 7C). KDNR buvo įtraukta į ekspresijos vektorių pTarget (PT-DLC1v4) po trumpalaikis transfekciją į tėvų AGS arba HEK293 ląstelių 24 h. PB analizes aptikta išraišką ~110 kDa baltymas, atitinkantį prognozuojamą dydį DLC1v4 [39]. tada laikinai Transfekuoti AGS ląstelės buvo užsikrėtę H. pylori
G27 (MOI = 100) už papildomą 16 val. Imunofluorescenciniam atskleidė, kad DLC1 , savaime
neslopina formavimas CagA sukeltas "dūzgiantis paukščių" fenotipo (19 ± 2% AGS /DLC1 , palyginti
19 ± 2% AGS /EV; n = 3 klonus), palyginti su tuščių vektoriaus-transfekuota ląstelių (pav. 8A, B). Vietoj to, DLC1 skatinamas ląstelių plitimas (20 ± 3% AGS /DLC1 versus
11 ± 2% AGS /EV; * p = 0,0067; n = 3 klonus) atitiktų jos vaidmenį reguliuojant židinio sąaugų [ ,,,0], h. h. pylori
infekcija. pylori
.

• PLoS ONE: padidėjusi Interleukinas-32 išraiška yra susijęs su Helicobacter pylori susijusios Gastritis
• PLoS ONE: Tikslinės Išbraukus Kcne2 Sukelia Gastritas Cystica Profunda ir skrandžio Neoplasia