PLoS ONE: Sąlyginis išraiška Wnt9b į Six2 teigiamas Cells sutrikdo skrandžio ir inkstų funkciją

Anotacija

Per inkstų vystymuisi, kanoninė WNT signalizacijos aktyvuoja diferenciaciją, o transkripcijos faktorius Six2 palaiko kamieninių baseinas. Šios priešingos signalai padeda reguliuoti nephron formavimas ir užtikrinti Pilną nephrons yra suformuota. Kadangi šie du veiksniai kontroliuoti skirtingus likimus inkstų mezenchima, mes iškėlė hipotezę, kad raiška Wnt9b
į Six2
-expressing ląstelės gali sutrikdyti inkstų susidarymą ir gali pakeisti ląstelių diferenciacijos sprendimus kituose audiniuose. Mes sukūrėme transgeninių pelę, kad sąlyginai išsakytą kanoninę WNT ligando besivystančiame inkstų Wnt9b
. Transgenui įjungiama CRE rekombinaze ir išreiškia GFP. Mes pirmą kartą išbandė savo biologinį aktyvumą naudojant Hoxb7-CRE parsisiųsti ir nustatė, kad transgeninių Wnt9b galėjo paskatinti diferencijavimo genus ir gelbėti inkstų vystymuisi Wnt9b ^{- /- CR.LT homozigotiškas trūkumas pelių. Priešingai, išraiška, Wnt9b
ląstelėse naudojant Six2-CRE
sukėlė virškinimo trakto baimę ir sunkus inkstų funkcijos nepakankamumo suaugusių pelių. Transgeniniai inkstai turėjo daug cistine kanalėliuose ir kreatinino vertės (0,652 ± 0,044), palyginti su laukinio tipo pelėms (0,119 ± 0,002). Šie gyvūnai taip pat eksponuojami netinkamai suformuotą prievarčio sfinkterio, duodenogastric refliuksas, ir iš distalinės skrandžio transformaciją į proksimalinės likimą. Geno ekspresijos pokyčiai pastebėti, kad Wnt9b: EGFP
transgeno buvo palyginti su stabilizuotos β-kateninai alelio nustatyti, kad Wnt9b aktyvina kanoninę WNT kelią per analizuotą audiniuose. Šie rezultatai rodo, kad saviraiškos Wnt9b
į Six2
-positive ląstelių sutrikdo ląstelių išlikimo sprendimai inkstų ir virškinimo trakto}

nurodomoji dalis:. Kiefer SM Robbins L, Rauchman M "(2012) Sąlyginis išraiška Wnt9b į Six2
-Positive Cells sutrikdo skrandžio ir inkstų funkciją. PLoS vieną iš 7 (8): e43098. Doi: 10,1371 /journal.pone.0043098

redaktorius: Masaru Katoh, Nacionalinis vėžio centras, Japonija

Įstojo: vasario 29, 2012; Priėmė: Lie 17, 2012 m Paskelbta rugpjūčio 17, 2012

Tai atviros prieigos straipsnio be visų autorių, ir gali būti laisvai atgaminti, platinti, perduoti, keisti, pastatytas ant, ar jos kitaip nenaudojamos niekam bet kuriam teisėtam tikslui. Darbas prieinamas pagal Creative Commons CC0 viešo atsidavimą

Finansavimas:. Šis darbas buvo remiamas National Institutes of Health dotacijos R01 DK067222 (http://nih.gov/) ir Amerikos širdies asociacijos, įsisteigusios tyrėjas 0840117N (http://www.heart.org) į MR. SK parėmė Saint Louis universiteto Prezidento tyrimų fondo apdovanojimas (www.slu.edu). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Canonical WNT signalizacijos kelias yra pagrindinis reguliatorius ląstelių likimą, ląstelių proliferacija ir ląstelių sukibimą vystymosi metu ir per suaugus. Daugybė teigiamų ir neigiamų tarpininkai buvo nustatyta, kad darbas kartu siekiant stora reguliavimą β-kateninai signalizacijos. Centrinis paradigma yra, kad citoplazmos β-kateninai yra sugeriama į sunaikinimo kompleksas, fosforilinamos GSK3β ir orientuojasi į ubikvitino naikinimo keliu, dalyvaujant WNT signalo nėra. WNT privalomas slopina fosforilinimas ir sunaikinimas beta-kateninai, todėl jį translocate į branduolį paveikti taikinio geno raišką naudojant TCF schemą /LEF veiksnių (peržiūrėtas MacDonald et al., [1]). buvo sukurta daugybė pelės modeliai studijuoti šią kelius, įskaitant tiek naudos ir nuostolių funkcijos alelių iš Wnts, WNT receptoriai, beta-kateninai ir TCF /LEF transkripcijos reguliatoriai. Šie modeliai atskleidė esminius vaidmenis kanoninės WNT signalizacijos kaulų, plaukų, žarnyno, kraujo ir vėžio [2]. Augančios tema iš šių tyrimų yra tai, kad daugelis biologiniai procesai yra itin jautriai reaguoja į kanoninės WNT signalizacijos stiprumo.

stora reguliavimas kanoninės WNT signalizacijos yra būtinas inkstų vystymuisi. Per pradiniuose etapuose inkstų formavimosi, Wnt9b išsiskiria iš šlapimtakių pumpuro ir signalus, kad kamieninių ląstelių į BŽŪP mezenchima sukelti nephron diferenciaciją. Gydymas ličio chlorido arba aktyvavimo beta-kateninai gali sukelti nephron diferenciacija atsižvelgiant į šlapimtakių pumpuro ir Wnt9b nėra, tai rodo, kad į kanoninės WNT signalizacijos padidėjimas yra pakankama šiam indukcinis atveju [3], [4]. Kai dangtelis mezenchima ląstelės dauginasi išlaikyti kamieninės ląstelės, kurios yra būtinos vėlesnių iteracijų šio proceso [5]. Ši pusiausvyra tarp kamieninių priežiūros ir diferenciacijos sukėlimo yra pirmaeilės svarbos, siekiant užtikrinti, kad inkstų formuoja visą papildyti nephrons [5], [6], [7], [8], [9].

išreikštos dangteliu mezenchima Keletas veiksnių buvo įrodyta, kad slopinti WNT stimuliuojamos diferenciaciją įskaitant transkripcijos veiksnio Six2 pervežimas. Išbraukus Six2
rezultatai negimdinio diferenciacijos, išnaudosime dangtelis mezenchima protėvių, ir inkstų agenesis [9]. Nors tikslus mechanizmas dar nėra žinomas, hipotezė buvo pasiūlyta, kuriuo aukšto lygio kanoninės WNT signalizacijos vairuoti įsipareigojimą diferenciacijos kadangi aukštos Six2 veikla tose pačiose ląstelėse palaiko kamieninių ląstelių likimą [7]. Mes sukūrėme naują pelės modelį sąlyginai superekspresuotų Wnt9b aktyvuoti kanoninę WNT signalizacijos kelią. Mes naudojome šį modelį ir patikrinti, ar padidėjo Wnt9b veikla yra pakankamas, kad būtų suardyti tarp protėvių ir diferenciacijos į BŽŪP mezenchima pusiausvyrą.

antra vieta, kur abu Six2 veikla ir WNT signalizacijos vaidina svarbų vaidmenį yra prievarčio sfinkterio , Prievarčio sfinkterio yra suformuotas tuo distalinio galo skrandžio ir veikia kaip vožtuvas jį būtų galima tinkamai virškinimą maisto iki jo atvykimo į dvylikapirštės žarnos. Disfunkcija sfinkterio gali sukelti refliukso dvylikapirštės žarnos turinį į skrandį kelia didesnę riziką skrandžio metaplazijos ir vėžio [10], [11]. Šis regionas taip pat yra įgimtų anomalijų, įskaitant retą sutrikimą pirminės duodenogastric refliukso ir dažniau įgimtą ydą prievarčio stenozė [12] svetainė. Six2
trūkumas sukelia agenesis iš prievarčio sfinkterio ir nuteikti WNT veiklą su Sfrp1 ir Sfrp2 privalo modelis skrandį [13], [14]. Tai paskatino mus iškėlė hipotezę, kad Canonical WNT veikla turi būti griežtai reguliuojamas ir fazė prievartyje panašūs į tai, kas buvo siūloma inkstus. Norėdami tai patikrinti mes naudojamas, Six2
-cre aktyvuoti Wnt9b
transgeno į Six2
išreikšti domenus inkstų ir skrandžio.

sąlyginis Wnt9b
transgeninių alelis čia pranešė išreiškia Wnt9b parsisiųsti ir GFP kai aktyvuojamas CRE rekombinaze. Tai biologiškai aktyvus ir gali gelbėti inkstų susidarymą Wnt9b ^{- /- CR.LT embrionų. Padidėjusi Wnt9b
inkstuose šlapimtakių užuomazgų gali indukuoti genus, susijusius su diferenciacijos dangteliu mezenchima, bet nevyksta mezenchiminių-į-epitelio perėjimo (RER) gaminti morfologiškai skirtingas pūslelės struktūras. Wnt9b
transgeno aktyvavimo, Six2
-positive ląstelės sukelia inkstų cistos ir distalinės skrandžio regionuose pavertimas proksimalinės skrandžio likimą. Palyginimas Wnt9b
transgenics prie alelio, kuri gamina stabilizavosi β-kateninai baltymas parodo dozės reaguoja genų pokyčius ir rodo, kad šie kamienai reikšti alelių seriją, kuri turėtų būti vertinga tolygiam kanoninę WNT signalizacijos kituose audiniuose.}

Rezultatai

transgeninių pelių išreikšti Wnt9b kai aktyvuojamas CRE rekombinaze

Wnt9b transgeno buvo pastatytas su lox-STOP kasetę [15] sukurti sąlyginai aktyviai Wnt9b kuri priklauso nuo CRE rekombinazės ekspresiją (pav. 1A). Kai aktyvuota, transgenas-išreikšta Wnt9b yra atskirti nuo endogeninės Wnt9b, nes jame yra gripo hemagliutinino epitopą C žyma terminalo ir transgeninių ląstelių bus eksponuoti GFP fluorescenciją dėl IRES-EGFP kasetę. Išbandyti transgenui ištikimybę, mes išnagrinėjo CRE-priklausomą išraišką išaugintų ląstelėmis bei in vivo embrionais (1b pav.). Epitopą tagged Wnt9b aptikta lizatuose ląstelių kartu transfektuotose transgenui ir CRE plazmidžių, o ne transfekcija Vien transgenui. Be to, fragmentai iš embrionų, kurie buvo teigiamas tiek Wnt9b ir beta-aktino-CRE transgenai esančius Wnt9b gripu o vieniši Wnt9b transgenics nebuvo. GFP fluorescencija buvo pastebėtas Wnt9b /β-aktino-CRE dvigubų teigiamų embrionų, o ne Wnt9b littermates (pav. 1C-F). Sąvoka lygis transgeninių Wnt9b koreliuoja su intensyvumo GFP fluorescencijos kiekvienam įkūrėjas linija. (1D pav.). Keturi nepriklausomi įkūrėjas linijos negalėjo gaminti gyvai β-aktino-CRE ^{TG /+ Wnt9b TG /+ dviviečiai Heterozigotinių šuniukai, o tai rodo, kad visur padidėjusi Wnt9b išraiška yra embriono mirtina. Analizė embriono etapais parodė, kad β-aktino-CRE TG /+ Wnt9b TG /+ dviviečiai Heterozigotinių embrionai buvo aptikta mažiau nei tikėtasi Mendelio dažniais E11-E12. Vienas dvigubai heterozigotinė embrionų buvo stebimas iš steigėjo labai aukštos ekspresijos (Fig. 1A, n = 23, tikimasi, dažnis 25%) ir 16% buvo pastebėtas iš kito steigėjo (n = 25). Wnt9b /SS-aktino-Cre dviviečiai transgeniniai embrionai turėjo mažesnių širdis telkimo kraujo, o tai rodo širdies nepakankamumas, nes mirties priežastis.}

Transgeniniai Wnt9b yra biologiškai aktyvus

Norėdami nustatyti, ar transgeninių Wnt9b yra biologiškai aktyvus, mes patikrinome, jei ji buvo pajėgi pakeisti laukinio tipo Wnt9b
metu inkstų vystymuisi. Wnt9b <sup>- /- CR.LT embrionai eksponuoti didelio penetrantiškumas vilko gomurys ir inkstų agenesis fenotipų (2 pav.). Aktyvinimas transgeninių Wnt9b į šlapimtakių pumpuro su Hoxb7
-cre išgelbėjo inkstų susidarymą, bet ne gomurio niežėjimas uždarymo metu E14.5 visose Hoxb7
-cre TG /+ Wnt9b
- /- WNT
9b TG /+ embrionai (n = 7). Tai inkstų konkrečiai gelbėjimo patvirtina, kad transgeninių Wnt9b išraiška priklauso nuo CRE aktyvavimo, nes gomurys neišreiškia Hoxb7
-cre. Kiekybinė PGR su laukinio tipo Wnt9b - /- parsisiųsti ir Wnt9b - /- CR.LT, Wnt9b TG /+ transgeniniai inkstai atskleidė, kad transgeninių Wnt9b
buvo išreikšta 2.3- kartus aukštesnio lygio nei laukinio tipo geno, o išraiška Ret
nepakito (2 pav. G-I). Transgeninių Wnt9b gebėjimas signalą į mezenchima pakeisti laukinio tipo Wnt9b
veikla patvirtina, kad jis yra biologiškai aktyvus in vivo.</sup>

Duomenų turtas parodė, kad Wnt9b ir β-kateninai signalizacijos yra esminiai indukciniai signalai, kad inicijuos diferenciaciją BŽŪP mezenchima į epithelialized inkstų pūslelių [4], [8], [16]. Wnt9b gaminamas šlapimtakių pumpuro aktyvuoja kanoninę WNT signalizacijos kelią gretimame mezenchima ir rezultatų genų, reguliuojančių mezenchiminių į epitelio perėjimą (RER) išraiška. Todėl mes patikrinome, ar padidėjusią Wnt9b
į šlapimtakių pumpuro būtų signalas mezenchima aktyvuoti RER genų ekspresiją ir skatinti didesnį indukciją nephrons. Wnt9b
buvo ekspresija į šlapimtakių pumpuro naudojant Hoxb7
-cre: EGFP. E12.5 embrionai buvo genotipą kiekybinė PGR analizės siekiant nustatyti, ar jie buvo hemizygous arba homozigotinį Wnt9b
transgenui ir inkstai buvo renkami genų ekspresijos analizė. Mes nustatėme, nuo dozės priklausomas padidėjimą Wnt9b
kad lydėjo proporcingai aktyvavimo išraiškos Wnt9b tikslinių genų Wnt4
Pax8
, ir Fgf8
trijų nepriklausomų klanus transgeninių inkstus (pav. 2J). Six2
išreiškiamas nediferencijuotos (BŽŪP) mezenchima ir downregulated kaip pūslelės diferenciacija lėmė [17]. Six2
iRNR raiška yra nepasikeitusios, Hoxb7
-cre Wnt9b
dviviečiai transgenics. Panašiai, šlapimtakių BUD genai Ret parsisiųsti ir Wnt11
, yra reikšmingai nepakito Padidėjusi Wnt9b
. Konkretus ląstelę genų į mezenchima patvirtina, kad transgeninių Wnt9b yra pajėgi signalizacijos nuo šlapimtakių pumpuro sukelti svarbius RER genus, tačiau ne histologiškai įrodytas negimdinio epithelialized inkstų pūslelių buvo akivaizdu (duomenys neparodyti). Tai rodo, kad ląstelę Wnt9b
į šlapimtakių pumpuro pakanka genų aktyvacijai, mezenchima, bet ne morfologinės diferenciacijos inkstų pūslelių.

Misexpression iš Wnt9b sutrikdo inkstų funkciją ir prievarčio sfinkterio formavimas aktyvuojant kanoninę ß-kateninai signalizacijos

paradigma atsiranda inkstuose yra tai, kad yra subtili pusiausvyra tarp kamieninių savęs atnaujinimo ir aktyvavimo diferenciacijos [6], [7], [9]. Wnt9b /β-kateninai kelias yra reikalingas diferenciacijos ir Six2 slopina diferenciaciją pradiniame žingsnyje įsipareigojimo. Taigi, mes iškėlė hipotezę, kad Six2 gebėjimą skatinti likimą sprendimus priešais iš tų, aktyvuota aukštos β-kateninai veikla gali būti bendra tema plėtrai. Mes išbandėme šią galimybę aktyvacijos transgeninių Wnt9b
su Six2
-cre. Dvigubo transgenics išreikšti Wnt9b
tose pačiose ląstelėse, išreikšti Six2 parsisiųsti ir gali sutrikdyti procesus, kurie suderintai reguliuojamas inkstuose ir kituose audiniuose. Six2-CRE ^{TG /+
Wnt9b TG /+
pelės eksponuojami baimę nujunkymo ir keturias savaites (14,5 ± 3,4 kūno svorio matavimai buvo sumažintas 39% gramų, p < 0,001), palyginti su CRE neigiamas Wnt9b TG /+
seserimis (23,6 ± 0,7 gramų). Fenotipinė analizė parodė, kad šis sumažėjimas kūno svorį lėmė apsigimimų virškinimo sistemos ir inkstų, dvi svetaines, Six2
-cre išraiška (3 pav.).}

Gausybė cistos įvairaus dydžio, buvo matoma žievės ir kaulų čiulpus dėl dvigubo heterozigotinių inkstus (pav. 4, N = 11/11). Cistos buvo daugiausia įsikūręs žievės ir išorinio šerdinės dalies ir buvo Artimojo kanalėlių kilmės kaip parodė Lt-dažymo. Cistinė liga pirmą kartą buvo akivaizdu, netrukus po gimimo (P7-10) proksimaliniuose segmentuose nephron (duomenys neparodyti). Šie dvigubi Heterozigotinių gyvūnai eksponuojami padidėjusį kreatinino kiekį kraujo serume į (0,652 ± 0,044, p < 0,005), palyginti su kontrolės littermates (0.119 ± 0.002) ne anksčiau kaip ~3 savaičių amžiaus, nurodant sunkia inkstų nepakankamumas. Senesni gyvūnai su progresavusia liga taip pat yra cistos, gautus iš daugiau distalinių segmentų, įskaitant Henle (Tamm-Horsfall teigiamas) kilpa. Visų gyvūnų, sergantiems progresavusia inkstų nepakankamumas tirtų, mes pastebėta daug rinkti latakų gautas cistos, kad išreikštų Aquaporin 2 arba surištus D. Biflorus
-lectin. Nuo Six2
-cre nėra išreikštas surinkimo ortakio, tai išsiplėtimas gali antrinė išsiplėtimas daugiau proksimaliniuose segmentus. Inkstų cistos Wnt9b
transgeninių gyvūnų buvimas sustiprina išvadą, kad sutrikdymas iš WNT signalizacijos sistemos sukelia cistinė liga [7], [18], [19].

Nors inkstų cistos buvo nedalyvavo, kol po gimimo, ląstelę kanoninės WNT signalizacijos buvo akivaizdu, ne E12.5, kai Six2
-cre iš pradžių išreiškė. Lef1 baltymo ekspresija buvo padidintas ikimokyklinio vamzdinių agregatų ir inkstų pūslelės struktūrų dvigubo transgenics ir buvo dar labiau padidėjo daugelio negimdinio pūslelių susiformavo stabilizuotų beta-kateninai inkstus (n = 3, 5 pav.). Dozė reaguoja padidėjimas Lef1 išraiškos palaiko paskelbė duomenis, kad Wnt9b veikia nors Canonical WNT signalizacijos kelią besivystančiame inkstų [7]. Negimdinio pūslelės struktūrų trūkumas Wnt9b pervežimas transgenics rodo, kad Wnt9b
alelis eksponatų vidutinio poveikio β-kateninai signalizacijos, palyginti su stabilizuoto β-kateninai alelio.

antra fenotipas prisidėti prie sumažėjusio kūno svorį Six2-CRE ^{TG /+ pervežimas Wnt9b TG /+
dviviečiai heterozigotų buvo skrandžio skausmo. Geltonos amniono buvo pastebėta, kad dvigubų transgenics skrandžio ir kaip atskiri transgeninių littermates (n = 6, 6 pav.). Tai rodo, kad duodenogastric refliukso buvo vyksta ir gali būti dėl nenormalaus prievarčio rauko formavimas. Tarp skrandžio ir dvylikapirštės žarnos sfinkterio buvo pailgi ir padidėjo dvigubai transgeninių (6 pav., Intarpas). TGFβ antagonistas, Nephrocan, kuris paprastai išreiškiamas labai riboto pobūdžio ne E16.5, buvo išplėsta dvigubai transgenics, tai rodo, kad sfinkterio regionas nebuvo tinkamai suvaržytas. Tai pailgos morfologija parėmė imunohistocheminį dažymo iš lygiųjų raumenų sluoksnis, kuris sudaro tankus raumenų sienos aplinkinių fazė prievartyje (pav. 6 E, F). Vieno transgeninių kontrolės, storiausias raumenys buvo nustatyta, kur audinys pasižymi labiausiai spazmas tuo sfinkterio (linija). Dvigubai transgenics, buvo pastebėtas storio raumeningumas, tačiau šis regionas buvo kompensuoti iš zonos, kuri buvo labiausiai susiaurėjęs.}

Mis-modeliavimas defektai taip pat buvo pastebėtas analizuojant specifinius žymenis, kad atskirti proksimalinės (H ^{+ /K + ATPazės) ir distalinė (Alcian mėlyna) regionas skrandį. Proksimalinis skrandis (Corpus) yra H + /K + ATPazės ekspresija pakauškaulio ląsteles, neįtraukiamas iš Ertmė-fazė prievartyje regione. Priešingai, Ertmė-fazė prievartyje yra gleivinės ląsteles, kad dėmę Alcian Blue kad nerandama proksimalinio regione [20]. Dvigubo transgenics eksponuojami nuolat H + /K + ATPazės dažymo ir Alcian mėlyna-teigiamas gleivinės nebuvimo antralinių skrandžio-fazė prievartyje rodo, kad distalines yra MIS-raštuotas į proksimalinės likimo Wnt9b
išraiška. Alcian mėlyna dažymo taurė ląstelių žarnyne buvo nepaliestas tiek vienviečiai ir dviviečiai transgenics nes Six2
-cre nėra išreikštas dvylikapirštės žarnos. Tai neteisingai modeliavimas rodo, kad panaši į inkstų paradigma, kanoninė β-kateninai signalizacijos nurodo vieną likimą, kad prieskrandžio regioną ir Six2 veiklos modeliai distalinė tapatybę. Tai patvirtina fraze sričių šių genų nes Canonical WNT signalizacijos reporteris eksponuoja didelio aktyvumo tik prieskrandžio ir Six2
apsiriboja distalinės skrandžio ir fazė prievartyje [13], [14].}

Jei Canonical WNT signalizacijos yra atsakinga už skrandžio refliukso į Six2-CRE ^{TG /+
Wnt9b TG /+
dviviečiai transgenics, tada apsigimimų pastebėta, turėtų būti kartojami pelės modelį, kuris išreiškia stabilizuotą ß-kateninai tame pačiame domene ( Ctnnb1 EX3 /+
, [21]). Po CRE aktyvavimo, šis alelis apsaugo proteolitinę degradaciją beta-kateninai ir būtų galima tikėtis pakelti kanoninę WNT signalo didesniu laipsniu nei vien Wnt9b ligando. Visas kalnas in situ analizės E12.5 skrandžius atskleidė tris genus Grem1
Nkx 2,5 pervežimas ir Gata3
, kurie paprastai išreiškiami plonu juosta demarking regionas, kad taps sfinkterio (n = 8, 7 pav.). Negimdinis išraiška Wnt9b
slopino BMP antagonistas, Grem1 parsisiųsti ir transkripcijos faktorius, Gata3
šiame regione, ir šie genai buvo toliau downregulated kai β-kateninai signalizacijos buvo padidintas. Nuo dozės priklausomas plėtra buvo pastebėtas už transkripcijos veiksnio Nkx2.5 pervežimas į abi mutantai. Genai, kurie buvo lokalizuotas tik žarnyne ( villin
) arba į prieskrandžio ( Bmp4
) nebuvo pakeista arba mutantas (duomenys neparodyti). Padidėjęs Canonical WNT signalizacijos į antralinių skrandžio ir fazė prievartyje buvo patvirtinta izoliuoti šį regioną ir atlikti kiekybine PGR. Kanoninės WNT tikslinės genai, kurie yra aktyvinama į stabilizuotas β-kateninai alelio, Lef1 parsisiųsti ir Axin2
, taip pat buvo padidėjo prievarčio regione Six2
-cre TG /+ Wnt9b TG /+ dviviečiai transgenics [ Lef1
, 2.0 ± 0,25 ir Axin2
, 1,4 ± 0,06 (n = 6)]. Kartu, dozė reaguoja genų ekspresijos pokyčiai pastebėtas prievarčio regione Wnt9b
transgenics ir stabilizuotų β-kateninai embrionų įrodyti, kad padidėjo Canonical WNT signalizacijos sutrikdo distalinio skrandžio ir prievarčio sfinkterio plėtrą.}

Diskusijos

Šie rezultatai aprašyti naujos pelės modelį, kuris sąlyginai aktyvuoja kanoninę WNT signalizacijos kūrimą. Wnt9b
transgenas indukuojamąją nuo sąlyčio su CRE rekombinaze ir išreiškia GFP kaip indukcijos persekiotoją. Jis taip pat išlaiko visišką biologinį aktyvumą, nes jis gali išgelbėti Wnt9b ^{- /- CR.LT fenotipų inkstuose. Šios pelės išliko mūsų koloniją, nes per metus ir paskatinti Wnt9b
išraiška nuo veisimo keliems skirtingų CRE padermių. Mes panaudojo šį romaną įtampą aktyvuoti WNT signalizacijos Six2
-positive ląstelių ir nustatė, žalingą poveikį inkstams ir skrandžiui.}

inkstus, Wnt9b išsiskiria iš šlapimtakių pumpurų epitelio sukelti gretimų dangtelis mezenchima kamieninės ląstelės inicijuoti diferenciaciją. Grįsdama šį modelį, mūsų in vivo, pelnas-ir-funkcijos tyrimai rodo, kad Wnt9b
upregulates anksti žymekliai inkstų pūslelės diferenciacijos, pavyzdžiui, Wnt4
Fgf8 parsisiųsti ir Pax8
. Tačiau, nors inkstų pūslelės genai sukelia Wnt9b
transgeno, mes nesilaikė morfologinę įrodymų didesnio ar negimdinio inkstų pūslelės formavimosi, kaip pranešė už Six2
mutantai [9]. Be WNT indukcinis signalas, veiksniai, palaikyti inkstų kamieninių baseinas (pvz Six2
) taip pat turi būti downregulated visiškai išsiaiškinti inkstų pūslelės išsidėstymą. Six2
išraiška nepakinta mūsų Wnt9b
transgeninių ir todėl gali paaiškinti, kodėl į Wnt9b padidėjimas nesukėlė negimdinio inkstų pūslelių. Negimdinis indukcija inkstų pūslelės žymekliai yra sukeliama aktyvavimo beta-kateninai į Six2
-positive metanephric mezenchima naudojant stabilizuotą β-kateninai alelio [4], todėl skirtumas tarp šių dviejų pelnas-of-funkcija eksperimentų gali būti susiję su tai, kiek jie aktyvuoti kanoninę WNT veiklą. Be to, tikėtina, kad aktyvacija kanoninės signalizacijos iki Wnt9b į metanephric mezenchima sukelia grįžtamasis slopinimas, kaip nurodyta kitose WNT reaguoja audinių, tokiu būdu užkertant kelią indukciją visiškai diferenciacijos programą [22]. Naujausi duomenys patvirtina šie atsiliepimai slopinimo idėja, nes Wnt9b /β-kateninai signalizacijos privalo ne tik metanephric mezenchima diferenciacijos, tačiau paradoksalu pats signalas taip pat yra reikalingas priežiūros ar plėsti inkstų kamieninių baseinas [7]. Mes spėlioti, kad stabilizavosi β-kateninai, spręsdama pasroviui keliu, gali apeiti šias reguliavimo mechanizmus. Šios galimybės gali būti bandomi būsimoms studijoms, kad palyginti pasroviui genų aktyvacijos inkstų kamieninių ląstelių naudojant Wnt9b
transgenui ir stabilizavosi β-kateninai pelnas-of-funkcija pelėms.

pasipiktinimas kanoninė WNT signalizacijos kelias buvo įrodyta, kad būti svarbūs inkstų cistine ligos patogenezėje (peržiūrėti Patel ir kt. [23]). Transgeninių išraiška stabilizuotos beta-kateninai ar trūkumas APC inkstų kanalėlių epitelyje atsiranda inkstų cistine ligos, remti išvadą, kad negimdinis Canonical WNT signalizacijos pakanka už cystogenesis [18], [19]. Inkstų nepakankamumas ir cistinė dilatacija, Six2
-cre ^{TG /+ Wnt9b TG /+ dviviečiai heterozigotų toliau palaiko hipotezę, kad aktyvinama Canonical WNT signalizacijos sukelia cistos. Sutrikimų nekanoninį WNT signalizacijos (PCP) kelio yra taip pat svarbus inkstų cistas formavimas [24]. Tokiu būdu, ji yra įmanoma, kad cistos formavimas Mūsų modelis yra ne tik dėl aktyvavimo kanoninės signalizacijos, bet yra sutrikimo santykinio pusiausvyra tarp kanoninės ir nekanoninį signalizacijos rezultatas. Grįsdama šią idėją, genai, kurie mutavo į paveldėtų formų cistine ligos ( PKD1
PKD2
PKHD1
Inversin
) lokalizuoti į blakstiena ir šie organoidus neseniai buvo parodyta, kad būtų galima reguliuoti nuo kanoninės ir nekanoninį WNT signalizacijos [25] pusiausvyrą [26].}

buvo sunki inkstų fenotipas nors Wnt9b
iRNR raiška padidėjo ~2 kartus mūsų transgenui rodo, kad gana žemo lygio, nuolatinis aktyvacijos šio kelio veda į inkstų funkcijos sutrikimo. Šis ląstelę Wnt9b lygis šlapimtakių pumpuro naudojant Hoxb7
-cre negamino cistos, tai rodo, kad cystogenesis į surinkimo latakų Six2
-cre ^{TG /+, Wnt9b TG /+ dviviečiai transgenics tikėtina antrinis poveikis išsiplėtusiais vamzdinių segmentų (duomenys neparodyti). Grįsdama Tai, po gimdymo dieną 7-10 gyvūnams, cistinė liga yra akivaizdus tik vamzdinių segmentų proksimaliniuose į surinkimo lataką. Panašus į policistinių inkstų liga sergantiems pacientams, transgeninių pelių sukūrė sunkus inkstų nepakankamumas, nors dauguma nephrons neišauga cistos. Tai kyla klausimas, ar inkstų kanalėliuose be akivaizdžių cistos yra nenormalus ir reikšmingai prisidėti prie nuoseklaus funkcinio sutrikimo šių sutrikimų klausimą. Naujausi tyrimai rodo, kad suaugusiųjų inkstų kanalėlių epitelyje išreikšti Wnt9b, Frizzled receptorius ir LRP5 /6 bendradarbius receptorius, kurie gali tarpininkauti kanoninę WNT signalizacijos, reaguojant į ūminio išeminio traumos [27]. Šioje aplinkoje, WNT signalizacijos skatina kanalėlių remonto ir regeneraciją. Tačiau, WNT signalizacijos veikla taip pat buvo susijęs skatinant inkstų fibrozės po sužeidimo, pavyzdžiui, į UUO modelį [28]. Apskritai, šie tyrimai pabrėžti reguliavimo WNT signalizacijos suaugusiųjų inkstų subalansuoti naudingus atsakymus, tokios kaip remonto /regeneravimo srityje ir, Netinkamas atsakymus, padedančią fibrozė ir lėtinis organų disfunkcijos svarbą.}

prievarčio regionas skrandžio atstovauja kritinė riba, kuri atskiria skrandžio iš žarnyno. Sfinkterio uždarymas, kai maisto boliuso patenka į skrandį leidžia tinkamą virškinimą prieš tranzito į plonąją žarną. Molekulinė pagrindas formuojant šio diskrečiųjų regione nėra gerai suprantama, nors kai kurios detalės atsiranda. Šie rezultatai rodo, kad trumpas kontrolė WNT signalizacijos yra gyvybiškai svarbus vystymosi fazė prievartyje. Canonical WNT veikla aptikta dugno ir kūno (corpus), tačiau išbrauktos iš distalinės skrandžio ir fazė prievartyje [13]. Be Barx1 UAB - /- pelių, skrandis mažas, antralinių-Corpus riba yra neryškus ir yra agenesis iš prievarčio sfinkterio. Elegantiškas audinių rekombinacijos tyrimai rodo, kad šie fenotipų atsirasti nuostolių išraiška WNT antagonistais Sfrp1 ir Sfrp2. Tačiau, kadangi Barx1
trūkumas yra pasaulines poveikį Priekinis žarna plėtrą, buvo neaišku, ar žemyn reguliavimo kanoninės WNT veiklos konkrečiai reikia formavimosi fazė prievartyje. Mūsų tyrimai tiesiogiai išbandyti šią galimybę nukreipti negimdinis WNT veiklą riboto regione tik priekinį į fazė prievartyje su Six2
-cre.

Mes nustatėme, kad negimdinis WNT veikla specialiai sutrikdo formavimas prievarčio sfinkterio globalių defektų skrandžio plėtros nebuvimas. Taigi, žemyn reguliavimas kanoninės WNT veiklos privalo modelis su prievarčio regioną, kuris atskiria skrandžio iš žarnyno. Negimdinis išraiška Wnt9b ligando ir stabilizavosi ß-kateninai transgeninių pelių gali įveikti sekretuojamą endogeninių WNT antagonistų Sfrp1 /2, derančių su siūlomo Kim et al [13] modelio poveikį. Panašus į mūsų rezultatais, Six2
mutantai yra sumažintas išraišką Nkx2.5
ir Gremlinas
, genai, kurie yra svarbūs prievarčio rauko plėtros jauniklį [14] [29]. Tai rodo, kad Six2 parsisiųsti ir WNT
reguliuoti bendrą genetinį kaskados į Numanomų prievarčio sfinkterio. Mes teigiame, kad svarbi funkcija, Six2
gali būti interpretuoti kanoninių WNT signalus skirtingais vystymosi kontekste.

aktyvinama Canonical WNT signalizacijos taip pat buvo įrodyta, turi įtakos blužnis ir kasa plėtra [30]. Grįsdama šį, blužnis ir kasa hipoplazija taip pat buvo pastebėta, Six2
-cre Wnt9b
dviejų transgeninių pelių (duomenys neparodyti). Nuo Six2
-cre nėra išreikštas šių audinių, tai rodo, kad signalus iš užpakalinės pilvo mezenchima gali paveikti blužnis ir kasa kūrimo metu. Tai patvirtina hipotezę, kad prievarčio regionas gali veikti kaip formuoti šių aksesuaras organų organizatorius. vystymosi metu, blužnies blastas laikinai susieti su prievarčio regione, prieš jų migracijos į skrandžio, kur jie kondensuotis [31] į kairę. Nors mes neaptiko Six2
-cre išraiška blužnies primordium ar mesothelium, mes negalime atmesti, kad trumpalaikis išraišką Six2
-cre šiuose regionuose yra atsakingas už defektus blužnies ir kasos , Ateities tyrimai siekiant tiesiogiai išbandyti šias galimybes.

Apibendrinant, mes sukūrėme naują pelės modelį, kuris leidžia laiko bei erdvės išraiškos Wnt9b. Besivystančiame inkstus, transgeninių Wnt9b
gali sukelti ankstyvą RER genų išraišką Six2
-positive inkstų protėvių, tačiau tai nėra pakankamas, kad būtų įjungti visą diferenciacijos programą. Patvarūs išraiška Wnt9b į Six2
-positive ląstelių sukelia inkstų cistos ir sunkus organų nepakankamumas. Skrandyje, negimdinis WNT β-kateninai veikla prievarčio regione keičia sfinkterio formavimo ir distalinio skrandžio kuriuos naudojant. Kartu šios išvados pabrėžti griežtą kontrolę WNT veiklos svarbą ir rodo, kad Six2 ir β-kateninai dalyvauja organų raštas skirtinguose kontekstuose.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

su gyvūnais atlikti tyrimai patvirtino gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto Saint Louis universiteto (protokolas 1460) ir Sent Luiso VA (protokolas 0305). Visos procedūros, susiję su gyvūnų vykdė institucinių gyvūnų gerovės taisyklių, standartų ir politikos

Pelės

Wnt9b
transgeninių pelių buvo kirto į kiekvieną iš trijų skirtingų CRE linijų [32. ]. 1) β-actin- CRE buvo naudojamas išreikšti Wnt9b ubiquitously (1 pav [33]) 2) Hoxb7
-cre:. EGFP buvo naudojamas superekspresuotų Wnt9b savo endogeninio vietą inkstuose, The šlapimtakių pumpuras (2 pav, [34].), ir 3) BAC Six2
-cre: EGFP transgenas buvo naudojamas išreikšti Wnt9b išoriškai į skrandį ir inkstų (3 pav, 4, 5, [. ,,,0],35]).

• PLoS ONE: Owadożerny Šikšnosparniai Digest chitino skrandyje naudojimas rūgštus žinduolių Chitinase
• PLoS ONE integravimas Skrandžio turinys ir stabiliu izotopu analizė kiekybiškai įvertinti Pygoscelid Penguins