PLoS ONE. Proteomics-Based Identificatie en analyse van eiwitten geassocieerd met Helicobacter pylori in de maag Cancer

Abstract

Helicobacter pylori
( H
pylori
) is een spiraalvormige Gram-negatieve bacterie die de meest voorkomende chronische infectie in de menselijke maag veroorzaakt. Ongeveer 1% -3% van de geïnfecteerde individuen ontwikkelen maagkanker. Echter, de mechanismen die H
. pylori
induceert maagkanker zijn niet volledig begrepen. De beschikbare gegevens blijkt een sterk verband tussen de virulentie factor van H
. pylori
, cytotoxine-geassocieerde gen A (CagA), en maagkanker. Om verder te karakteriseren H
. pylori
virulentie, hebben we drie cellijnen door het infecteren van de maagkanker cellijnen SGC-7901 en AGS met cagA
^{+
H
. pylori Kopen en transfecteren SGC-7901 met een vector die het full-length cagA
gen. Detecteerden we 135 verschillend tot expressie gebrachte eiwitten van de drie cellijnen gebruikt proteoom technologie, en 10 differentiële eiwitten voor de drie cellijnen werden geselecteerd en geïdentificeerd door LC-MS /MS en bevestigd door Western blot: P-actine, L-lactaat (LDH), dihydrolipoamide dehydrogenase (DLD), pre-mRNA-verwerking factor 19 homoloog (PRPF19), ATP synthase, calmodulin (CAM), P64 CLCP, Ran-specifieke-GTPase activerend eiwit (RanGAP), P43 en calreticuline. Detectie van de expressie van deze eiwitten en genen die coderen voor deze eiwitten in menselijke maagkanker weefsels door real-time PCR (RT-qPCR) en Western blot toonde dat de expressie van β-actine
, LDH
, DLD
, PRPF19 Kopen en CaM
genen werden up-gereguleerd en RanGAP
werd down-gereguleerd bij maagkanker weefsels en /of metastatische lymfeknopen vergelijking met peri-kankerachtige weefsels. Hoge genexpressie werd waargenomen voor H
. pylori
infectie bij maagkanker weefsels. Verder is de LDH
, DLD Kopen en CaM
genen werden gedemethyleerd in de promotor respectievelijk -2325, -1885 en -276 sites, en de RanGAP
gen werd sterk gemethyleerd op de promotor -570 en -170 sites in H
. pylori
geïnfecteerde en cagA
tot overexpressie cellen. Deze resultaten bieden nieuwe inzichten in de moleculaire pathogenese en de behandeling doelen voor maagkanker met H
. pylori
infectie}

Visum:. Zhou J, Wang W, Xie Y, Zhao Y, X Chen, Xu W, et al. (2016) Proteomics-Based Identificatie en analyse van eiwitten geassocieerd met Helicobacter pylori
bij maagkanker. PLoS ONE 11 (1): e0146521. doi: 10.1371 /journal.pone.0146521

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medische Universiteit, JAPAN

Ontvangen: 15 september 2015; Aanvaard: 19 december 2015; Gepubliceerd: 8 januari 2016

Copyright: © 2016 Zhou et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. Alle relevante gegevens binnen het papier

Financiering:. het werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81260303, 31560326), Guizhou provincie stichting ([2014] QianJiaoHe 06) en Key Project van Wetenschap en Technologie van Guizhou Province (QianKeHe SY [2011] 3067, QianKeHe J [2012] 2039). In de originele versie, werd het werk ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81260303, 31560326) en Key Project van Wetenschap en Technologie van de provincie Guizhou (QianKeHe SY (2011) 3067),

Competing belangen. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Introductie

Helicobacter pylori
( H
. pylori
) zorgt ervoor dat de meest voorkomende chronische maag-infectie bij de mens over de hele wereld. Ongeveer de helft van de wereldbevolking is besmet met H
. pylori
, en de meerderheid van de gekoloniseerde individuen ontwikkelen asymptomatische gastritis. Onder geïnfecteerde individuen, ongeveer 10% -20% van individuen ontwikkelen maagzweer ziekten en 1% -3% ontwikkelen maagkanker [1,2]. In 1994, H
. pylori
werd geclassificeerd als een type I carcinogeen voor maagkanker door het Internationaal Agentschap voor de World Health Organization voor kankeronderzoek.

Maagkanker is een van de meest voorkomende vormen van kanker, en meer dan 70% van de nieuwe gevallen en sterfgevallen in ontwikkelingslanden [3]. Hoewel de wereldwijde incidentie is gedaald tientallen jaren, blijft maagkanker overwegend in de meeste ontwikkelingslanden, waaronder Japan, Korea en China [4-6]. In 2012, de Chinese Cancer Registry jaarverslag aangegeven dat maagkanker morbiditeit en mortaliteit zijn tweede en derde van alle kwaadaardige tumoren, respectievelijk.

De meerderheid van de H
. pylori
stammen dragen de CAG
pathogeniteit eiland ( CAG
PAI), die 27-31 genen die een bacteriële type 4 secretie systeem (T4SS) coderen bevat [7] . Het cytotoxine geassocieerde gen-gen ( cagA
), die zich aan het 3 'uiteinde van cag
PAI, codeert de enige bekende bacteriële oncoprotein, CagA, die translocatie in gastheercellen door T4SS na bacteriële hechting aan de maag. Eenmaal in de gastheercellen, wordt CagA tyrosine gefosforyleerd door leden van de Abl en Src kinase families en samenwerkt met talrijke intracellulaire effectoren, wat leidt tot de activering van signaaltransductie moleculen [8]. In klinische studies, cagA
-positieve stammen zijn consequent gekoppeld aan meer ernstige maagontsteking en zweren, en een klein deel van individuen te ontwikkelen maagkanker [9]. Echter, de mechanismen die ten grondslag liggen aan de associatie van CagA met kanker zijn niet opgehelderd.

Proteomics heeft ontpopt als een veelbelovende technologische platform voor de rationele identificatie van biomerkers en nieuwe therapeutische doelen voor ziekten en het bepalen van de onderliggende mechanismen van carcinogenese [10]. De meeste van de belangrijke eiwitten gedetecteerd door proteomics in vitro niet bevestigd in vivo in klinische monsters.

DNA methylatie en demethylatie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling en progressie van kanker door het blokkeren van de binding van transcriptiefactoren aan DNA en is gebeurt vrijwel uitsluitend in genpromotor CpG eilanden [11-13]. Onder organen, de maag vertoont de hoogste frequentie van abnormale CpG eiland methylering, eventueel H
. pylori
gemedieerde [14-16]. Hoewel studies van DNA-methylatie toeneemt, het gen methylatie staten geïnduceerd door H
. pylori Wat zijn nog niet duidelijk.

In dit werk, we gericht op specifieke eiwitten in verband met H
identificeren. pylori
infectie met behulp van vergelijkende proteomics en karakteriseren van de expressie van genen en CpG eiland methylatie van deze eiwitten bij maagkanker weefsels en cellen.

Materialen en methoden

Menselijke weefsels

Menselijke weefsels werden verkregen van een operatie monsters van 30 maagkanker patiënten en afgestemd aangrenzende kanker weefsels en metastatische lymfeklieren in Guiyang Medical Hospital, Guiyang China, tussen januari 2009 en juni 2010. De diagnoses werden bevestigd door twee pathologen. Onder de patiënten, 23 waren mannen, en 7 waren vrouwen. De patiënten varieerden in leeftijd 38-77 jaar. Tweeëntwintig patiënten hadden intestinale type adenocarcinoom en 8 had diffuse type adenocarcinoom. De studie protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van Guiyang Medical Hospital, en alle vakken mits informed consent.

Cell cultuur

De menselijke maag-carcinoom cellijn AGS (ATCC CRL-1739TM) en SGC-7901-cellen werden direct van American Type Culture Collection (ATCC) en Cell Bank of Type Culture Collection van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China) kocht, respectievelijk, en gepasseerd voor minder dan 3 maanden in ons laboratorium na ontvangst. Cellen werden gekweekt in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal bovien serum, 100 U /ml penicilline en 100 ug /ml streptomycine (Gibco, Grand Island, NY, USA) bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO _2.

H
. pylori
cultuur

H
. pylori
stam NCTC11637 (ATCC 43.504, een geschenk van de Chinese Centrum van Helicobacter pylori
stam beheer en behoud, Beijing, China), die cagA
positief, werd gekweekt in selectief medium op een Columbia agar plaat met 10% foetaal kalfsserum en H
. pylori
Selective Supplement (Oxoid Ltd., Engeland) bij 37 ° C onder microaerobic omstandigheden.

Cell infectie met H
. pylori

AGS en SGC-7901-cellen (5 x 10 ^{5) werden uitgezaaid in 6-well platen gedurende 24 uur en geïnfecteerd met H
. pylori
gedurende 6 uur en 12 uur bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 1: 100, 1: respectievelijk 1000, 500 en 1. Cellen werden gedurende 12 uur bij een MOI van 1: 1000 met H
. pylori
gekookt gedurende 15 min als controles.}

De bouw van de expressievector pcDNA3.1 / cagA

DNA werd geëxtraheerd uit H
. pylori
, en de full-length cagA
sequentie werd gesynthetiseerd door PCR en gekloond in pMD18-T plasmiden om pMD18-T / cagA
construeren. De cagA
gen werd geïdentificeerd door sequencing (GQ161098). pMD18-T / cagA
werd geknipt met de restrictie-enzymen Pst
I en Bam
HI, en cagA
werd geligeerd in pcDNA3.1 /Zeo (-) (Invitrogen, USA) aan de eukaryotische expressievector pcDNA3.1 / cagA
construeren. De sequenties van de primers worden in Tabel 1

Celtransfectie met pcDNA3.1 / cagA

SGC-7901-cellen werden gedurende 12 h in 6-well platen tot 80% confluente cellen te verkrijgen. De cellen werden vervolgens getransfecteerd volgens de instructies van de fabrikant. Na 48 uur werden de cellen 1:10 verdeeld nieuwe 6-well platen en geincubeerd gedurende nog 24 uur en daarna gehandhaafd selectieve zeocine-bevattend (250 ug /ml) standaard medium voor 2 weken tot kloon formatie. Cellen getransfecteerd met lege vector pcDNA3.1 /Zeo (-) werden als controles

Eiwitextractie en Western blot

Eiwitextracten werden bereid door hersuspenderen celpellets in RIPA buffer of homogeniseren 200. mg weefsel in RIPA buffer. Een totaal van 30-50 ug extract proteïne werd onderworpen aan SDS-PAGE gelelektroforese, overgebracht naar een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan (Millipore, Billerica, MA, USA) en gedurende de nacht geblot met muizen monoklonaal anti-CagA antilichaam (1: 800, SC-28368), muizen monoklonaal anti-fosfotyrosine antilichaam (PY99, 1: 300, sc-7020), konijn polyklonaal anti-beta-actine-antilichaam (1: 500, ab189073), konijn polyklonaal anti-LDH antilichaam (1: 350 , ab125683), muizen monoklonaal anti-DLD (1: 800, sc-376890), konijn polyklonaal anti-PRPF19 (1: 400, ab27692), muis monoklonaal anti-ATP synthase antilichaam (1: 300, ab54880), konijn polyklonaal anti -calmodulin anbody (1: 250, ab208911), konijn polyklonaal anti-RanGAP antilichaam (1: 200, ab92360), konijn polyklonaal anti-p64CLCP antilichaam (1: 300, ab28722), konijn polyklonaal anti-calreticuline antilichaam (1: 350, AB4) en monoklonaal anti-glyceraldehyde-3-fosfaat -dehydrogenase antilichaam (GAPDH, 1: 8000) uit Santa Cruz (CA, USA), Abcam (Cambridge, UK) en CangChen (Shanghai, China) in respectievelijk 5% BSA in Tris-gebufferde zoutoplossing en 0,01% Tween-20. Peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen (1: 5000, SC-2371, Santa Cruz, CA, USA) werden gebruikt en ontwikkeld met de chemiluminescentie reagens ECL Plus met behulp van Hyperfilm (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Kwantificering van de western blots werd uitgevoerd met behulp van Quantity One software. Elk experiment werd 3 keer uitgevoerd en een representatief resultaat is weergegeven.

Eiwitextractie en tweedimensionale gelelektroforese

De celpellets werden opgelost in cellysisbuffer overnacht bij 4 ° C en eiwit werd geprecipiteerd met drie volumes ijskoude aceton door incubatie bij 4 ° C gedurende 2 uur. De monsters werden vervolgens gecentrifugeerd bij 20.000 rpm gedurende 30 min, en de pellets werden geresuspendeerd in cellysis buffer en opgeslagen bij 4 ° C overnacht.

Een totaal van 800 ug eiwit werd op een volume van 250 ul met rehydratatieoplossing en iso-elektrische focussering (IEF) werd uitgevoerd met een Ettan IPGphor II isoelektrisch focusseren (Amersham Biosciences) volgens de instructies van de fabrikant. Het protocol voor IEF was 300 V voor 1H, 500 V gedurende 2,5 uur, 1000 V gedurende 2 uur; 8000 V gedurende 8 uur, 60 KVH (totaal).

Na IEF, de IPG strips (Amersham Biosciences) werden geëquilibreerd in equilibratiebuffer gedurende 15 min en op een 12% SDS-PAGE gel van twee- dimensionale elektroforese bij 30 mA /gel. Het verkregen SDS-PAGE gel werd gefixeerd in 20% TCA gedurende 30 min en vervolgens gekleurd met colloïdaal Coomassie G-250 [5].

De eiwitvlekken op de gel werd gescand en automatisch geanalyseerd. Differentieel tot expressie eiwit plekken werden bevestigd met Imaging Master 2D 5,0 analytische software (Amersham Biosciences). Student t-test werd uitgevoerd voor de kwantitatieve analyse van de 2D-gels. Differentiële expressie van een specifiek eiwit werd gedefinieerd als een ≥2-voudige verandering bij plek optische dichtheid tussen de twee sets gematched in duplo. De differentiële spots werden vervolgens uitgesneden uit de SDS-PAGE-gelen voor verdere identificatie door LC-MS /MS.

RNA-extractie en kwantitatieve RT-PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit 50 mg weefsel en behandeld met DNase I (RNase-vrij). De genen werden geamplificeerd met SYBR Green (Applied Biosystems, Australië). Hypoxanthine-guanine fosforibosyltransferase (
HPRT) werd gebruikt als een controle normalisatie en de relatieve mRNA-niveaus werden berekend door een vergelijking C _{t onder toepassing Step-One software (Applied Biosystems, Australië) [8]. Elk monster werd getest in drievoud en de resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. De gebruikte primers zijn opgesomd in Tabel 1.}

DNA-extractie en analyse methylatie van CpG eilanden

DNA werd geïsoleerd uit cellen en gemodificeerd met natriumbisulfiet met een EZ DNA methylatie-Gold Kit ^{™ (Zymo Research, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Promotor CpG eilanden werden voorspeld met behulp Methyl Primer Express software en geamplificeerd uit bisulfiet gemodificeerd DNA door PCR met de volgende procedures: denatureren bij 96 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 94 ° C gedurende 40 seconden, hybridisatie bij 60 ° C gedurende 40 seconden en verlenging bij 72 ° C gedurende 40 seconden, met een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten. De geamplificeerde PCR producten werden gekloneerd in pMD19-T vectoren en gesequenced. Bovendien, DNA geïsoleerd uit tumorweefsels werd gebruikt voor het detecteren H
. pylori
16S rRNA
-gen en cagA
gen. De primer sequenties worden opgesomd in Tabel 2.}

Statistische analyse

De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelden ± SD. Statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS 15.0 software. Enkele factoren variantieanalyse (ANOVA) en de t-test van Student werd gebruikt om de gegevens te analyseren. P
. ≪ 0,05 (tweezijdig) werd beschouwd als significant

Resultaten

Introductie van CagA in maagkanker cellen

Door CagA van H
. pylori
een kritische virulentie factor in de ontwikkeling en progressie van maagkanker, werd CagA gedetecteerd in maagkanker cellijnen door RT-PCR en Western blot na infectie van SGC-7901 en AGS cellen met H
. pylori Kopen en transfectie van SGC-7901-cellen met cagA
-vector. De CagA eiwit begon te verschijnen in een verhouding van cellen met bacteriën van 1: 500 in gekweekte cellen bij 6 uur, en het hoogste gehalte in een verhouding van 1: 1000 op 6 uur (figuur 1A en 1B). Echter werd gefosforyleerd CagA waargenomen in cellen bij een verhouding van 1: 500 na kweek gedurende 12 uur, en het hoogste gehalte werd waargenomen in cellen bij een verhouding van 1: 1000 na 6 uur van de cultuur. CagA mRNA en eiwit werden ook waargenomen in stabiel cagA
tot overexpressie SGC-7901-cellen (Fig 1C en 1D). Deze gegevens suggereren dat CagA succes werd in drie cellijnen en gefosforyleerd.

Identificatie van differentiële eiwitten in maagkanker cellen

Na cellen werden geïnfecteerd met H
. pylori
gedurende 6 uur bij een MOI van 1: 1000 of getransfecteerd met cagA
-vector, een proteomics techniek werd gebruikt voor zes twee-dimensionale elektroforese (2-dE) te creëren kaarten van de drie cellijnen en hun controles (figuur 2), en 135 differentiële vlekken werden gedetecteerd, waarvan 73 werden opwaarts gereguleerd en 62 werden down-gereguleerd. Ten differentiële spots voor alle drie de cellijnen werd geïdentificeerd met LC-MS /MS en geverifieerd door western blot, waaronder 6 opwaarts gereguleerd eiwit: P-actine, LDH, DLD, PRPF19, ATP synthase en calmoduline (CaM), en 4 down-gereguleerde eiwitten zoals RanGAP, P64 CLCP, P43 en calreticuline (tabel 3 en figuur 3A).

H
. pylori
infectie bevordert de expressie van differentiële eiwitten in maagkanker weefsels

Door H
. pylori
selectief koloniseert de menselijke maag een reeks pathologische processen brengen, de genexpressie van 10 differentiële eiwitten in 30 menselijke maagkanker monsters werd onderzocht met kwantitatieve RT-PCR. Van de 10 genen, de expressie van β-actine
, LDH
, DLD
, PRP19 Kopen en CaM
in maag kankers en /of gemetastaseerde lymfeklieren werden up-gereguleerd in vergelijking met peri-kankerweefsel, terwijl de expressie van RanGAP
werd down-gereguleerd. Similarily, de 6 eiwitten werden abnormaal tot expressie gebracht in dezelfde weefsels (Figuur 3B en 3C). Geen significante verschillen in de expressie van de andere genen waargenomen.

H
. pylori
kolonisatie bij maagkanker weefsels werd gemeten door het detecteren van de 16S rRNA
-gen en cagA
gen van H
. pylori
met PCR. H
. pylori
was aanwezig in 20 van de 30 monsters (positief tarief 67%), en alle H
. pylori
stammen zijn cagA
positief. Het mRNA niveaus van β-actine
, LDH
, DLD
, PRP19 en CAM
hoger in de H
waren. pylori
-positieve weefsels dan in de negatieve monsters (figuur 3D).

H
. pylori
induceert afwijkende DNA-methylatie bij maagkanker cellen

In drie cellijnen, PCR-producten van de CpG eilanden van de bovengenoemde genen werden met succes verworven na bisulfiet behandeling en gesequenced. In deze genen, LDH
, DLD Kopen en CaM
genen werden gedemethyleerd in de promotor respectievelijk -2325, -1885 en -276 sites, en de RanGAP
gen werd sterk gemethyleerd op de promotor -570 en -170 sites (figuur 4).

Discussie

Accumulatieve bewijsmateriaal wijst erop dat H
. pylori
infectie is een belangrijke factor voor de H
. pylori
geassocieerde maag-en vaatziekten en dat CagA is een bevorderen factor voor maagkanker [17,18]. Wij geconstrueerd drie experimentele cellijnen, waaronder twee maagkanker cellijnen geïnfecteerd met H
. pylori
( cagA
^{+) en een maagkanker cellijn overexpressie cagA
, en bepaald dat CagA begon te verschijnen in de cellen 6 uur na infectie en voor tot 12 uur. Vervolgens gefosforyleerd CagA begon te verschijnen, in overeenstemming met de injectie- en daaropvolgende fosforylatie van CagA in maagepitheelcellen de T4SS van H
. pylori
na infectie van het menselijk maagslijmvlies. Gefosforyleerd CagA activeert stroomafwaartse signaalwegen en speelt een pathologische rol. We hebben ook waargenomen CagA in cellen stabiel getransfecteerd met de cagA
-vector. Deze gegevens bevestigen de succesvolle bouw van de drie experimentele cellijnen.}

Proteomics is gebruikt om de relatie tussen H
bestuderen. pylori
infecties en maag ziekten, en vele differentieel tot expressie eiwitten geïdentificeerd [19-22]. Echter, de vereniging van deze eiwitten met CagA en hun expressie in menselijke maagkanker weefsels blijft onduidelijk. We verkregen een totaal van 135 differentiële spots van de drie cellijnen, waarvan 73 werden opwaarts gereguleerd en 62 werden down-gereguleerd. Tien differentiële plekken waren voor alle drie de cellijnen, waaronder 6 up-gereguleerd eiwitten (β-actine, LDH, DLD, PRP19, ATP synthase, en CAM) en 4 down-gereguleerd eiwitten (P64 CLCP, RanGAP, P43 en calreticuline) werden meningsuiting en het 10-eiwitten 'geverifieerd door western blot in deze cellijnen. Deze eiwitten zijn betrokken bij de energiestofwisseling, skelet omlegging, pre-mRNA verwerking, signaaltransductie, en andere eiwitten nauw verbonden met de ontwikkeling en progressie van vele menselijke kankers [23,24]. We kwantitatief de expressie van de genen die coderen voor deze 10 eiwitten in menselijke maagkanker weefsel, waaruit bleek dat β-actine
, LDH
, DLD
, PRP19 Kopen en CaM
werden consistent sterk tot expressie gebracht en RanGAP
was slecht uitgedrukt in zowel kanker weefsels en /of gemetastaseerde lymfeklieren in vergelijking met peri-kankerweefsel. De afwijkende expressie van deze eiwitten werd geverifieerd door western blot bij maagkanker en metastatische lymfeknopen. Vervolgens vonden we dat cagA
^{+ H
. pylori
gekoloniseerd 20 van 30 maagkanker weefsels en bevorderd of remde de expressie van deze genen in vivo.}

LDH en DLD nauw gecorreleerd met energiestofwisseling. Wanorde van de energiestofwisseling wordt als een belangrijke factor in de ontwikkeling en progressie van kanker. In tegenstelling tot normale cellen, kankercellen vertonen verhoogde afhankelijkheid van glycolytische routes voldoende zuurstof, zogenaamde aerobe glycolyse. Een grote hoeveelheid pyrodruivenzuur, een eindproduct van de route, wordt omgezet in melkzuur door LDH, bevorderen de glycolytische route en energiemetabolisme onbalans [25]. Melkzuur kan ook de pH van de cel micro dalen en neovasculaire respons op angiogenese factoren tumorcelmetastase [26,27] bevorderen verhogen. In overeenstemming met onze resultaten, LDH
was sterk uitgedrukt in kanker weefsels in 61,8% van de patiënten met maagkanker; patiënten met LDH overexpressie had kortere overleving vergeleken met patiënten met lage expressie [28]. Kim et al
. [29] opgemerkt dat DLD
expressie toeneemt met progressie van de tumor, waardoor er meer energie voor de groei van tumorcellen. Daarom hoge expressie van LDH en DLD is een cruciale factor voor de ontwikkeling en progressie van maagkanker en H
. pylori
infectie bevordert de expressie van deze twee genen bij maagkanker weefsels.

Beta-actine, een belangrijke component van het cytoskelet, handhaaft de structuur, de beweging en deling van cellen onder normale omstandigheden. β-actine
abnormaal tot expressie gebracht in vele ziekten [30]. De PRPF19 eiwit wordt verondersteld te functioneren in pre-mRNA splicing. Ubiquitinering van PRPF19 kan leiden tot DNA-schade en abnormale DNA repair is een belangrijke oorzaak van tumorigenese [31]. Calmodulin is een calciumbindend eiwit dat veel signaalroutes reguleert en daardoor deel aan celproliferatie, mitose en gentranscriptie. Calmoduline stimuleert celproliferatie in levercarcinomen in combinatie met PI3K en de overgang van de G1 naar S, in combinatie met cycline E [32]. Een remmer van calmoduline arrestatie cellen in G1 fase celdeling [33] remmen. In overeenstemming met deze resultaten, hebben we vastgesteld dat H
. pylori
kunnen deelnemen aan de ontwikkeling van kanker van de maag weefsels door het induceren van de hoge expressie van deze drie eiwitten.

Daarnaast zagen we down-regulatie van de RanGAP
gen in kanker weefsels met H
. pylori
infectie. RanGAP een GTPase-activerend eiwit. Na hydrolyse van GTP tot BBP een GTPase, actieve RanGTP inactief RanGDP, waardoor de blokkade van celsignalering tot progressie van kanker [34] remmen. Evenzo verlaagde RanGAP activiteit geïnduceerd door ubiquitinering bevordert de ontwikkeling van kanker [35].

DNA methylering abnormale genexpressie induceren. H
. pylori
infectie verhoogt de methylatie niveaus van bepaalde genen en resulteert in carcinogenese van het maagslijmvlies [36,37]. DNA-methylatie verschijnt meestal in de CpG eilanden van gen promoters. We merken op dat de methylatie status van de CpG eilanden van deze genen in de geconstrueerde cellijnen en vastgesteld dat de LDH
, DLD Kopen en CaM
genen werden gedemethyleerd op de promotor -2325, -1885 en -276 sites, respectievelijk, en de RanGAP
gen werd sterk gemethyleerd op de promotor -570 en -170 sites, in overeenstemming met de hoge expressie van de LDH
, DLD Kopen en CaM
genen en de lage expressie van de RanGAP
gen bij maagkanker weefsels met cagA
^{+ H
. pylori
infectie.}

Tot slot, deze resultaten suggereren dat H
.
pylori infectie, via CagA translocatie, kan de afwijkende methylering van deze genen induceren leidt tot disfunctionele genexpressie bij maagkanker weefsels en cellen. Onze resultaten geven een nieuw inzicht in de moleculaire pathogenese van maagkanker met H
. pylori
infectie. Toekomstige studies zullen de effecten van deze veranderde methylatie patronen te ontdekken over de pathogenese van maagkanker in klinische monsters.

Dankwoord

Wij danken de Chinese Centrum van Helicobacter pylori
stam Beheer en Conservering voor het verstrekken van H
. pylori
NCTC11637 en Dr. Yang Wenxiu en Wu Jiahong voor technische ondersteuning.

• PLoS ONE: associatie tussen het verlies van tanden en maagkanker: een meta-analyse van observationele studies
• PLoS ONE: Massive Endoscopische Screening voor slokdarmkanker en maagkanker in een High-Risk Area China