PLoS ONE: MicroRNA-149 remt proliferatie en voortgang van de celcyclus door de Targeting van ZBTB2 in Human Gastric Cancer

Abstract

Een toenemende hoeveelheid bewijsmateriaal wijst erop dat miR-149 kan zowel onderdrukken en het bevorderen van de groei van tumoren, afhankelijk van het type tumor. De rol van miR-149 in de progressie van maagkanker (GC) is niet bekend. Hier melden wij dat miR-149 is een tumor suppressor in menselijke maagkanker. miR-149 expressie is verminderd bij GC cellijnen en klinische monsters in vergelijking met normale maag epitheelcellen en weefsels resp. De expressieniveaus van miR-149 ook correleren met de mate van differentiatie GC cellen en weefsels. Bovendien, ectopische expressie van miR-149 bij maagkanker cellen remt proliferatie en voortgang van de celcyclus door down-regulering van ZBTB2
, een potente repressor van de ARF-HDM2-p53-p21-route, met een potentiële bindingsplaats voor miR-149 in de 3'UTR het mRNA. Het is ook gevonden dat ZBTB2 expressie verhogingen GC cellen en weefsels in vergelijking met normale maag epitheelcellen en weefsels resp. Onderdrukking van ZBTB2
leidt tot onderdrukking van celgroei en celcyclus arrestatie in G0 /G1-fase, wat aangeeft dat ZBTB2 kan werken als een oncogen in GC. Bovendien transfectie van miR-149 bootst in maagkanker cellen induceert neerwaartse regulatie van ZBTB2 en HDM2 en up-regulatie van ARF, p53 en p21 vergeleken met de controles. Kortom, onze gegevens suggereren dat miR-149 functioneert als een tumor suppressor in menselijke maagkanker door, ten minste gedeeltelijk door en targeting ZBTB2

Visum:. Wang Y, X Zheng, Zhang Z, J Zhou, Zhao G, J Yang, et al. (2012) MicroRNA-149 remt proliferatie en voortgang van de celcyclus door de Targeting van ZBTB2
in Human maagkanker. PLoS ONE 7 (10): e41693. doi: 10.1371 /journal.pone.0041693

Uitgever: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 13 maart 2012; Aanvaard: 25 juni 2012; Gepubliceerd: 29 oktober 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (no. 30872966 en no. 31071135), National Natural Science Foundation of China (nr. 81000864, ​​nr. 81172290, nr. 91129723, nr. 81090270, en no. 81090273) , en de Chinese Postdoctoraal Science Foundation (no. 20100471776). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is een van de meest voorkomende kankers en belangrijkste oorzaken van kanker overlijden wereldwijd, vooral in Oost-Azië, volgens de laatste wereldwijde schatting gepubliceerd in 2011 [1]. Ondanks een opmerkelijke daling van GC incidentie in de meeste delen van de wereld, is er nog steeds een grote last van het grote aantal GC gevallen en sterfgevallen wereldwijd. De carcinogenese van GC is een zeer ingewikkeld proces [2] - [5] waarbij de ontregeling van meerdere genen [6] - [8], zoals oncogenen [9] - [14] en tumor- suppressors [15] - [18]. De moleculaire mechanismen vereist voor GC ontwikkeling en progressie moeten verder worden onderzocht.

MicroRNAs (miRNAs) zijn een groep van endogeen tot expressie, niet-coderende kleine RNA (20-25 nucleotiden) bekend negatief genexpressie door het onderdrukken van translatie of verlaging van de stabiliteit van mRNA door direct te binden aan het 3'-ongetranslateerde gebied (3'-UTR) van doelwit mRNA [19], [20]. Accumulerende aanwijzingen dat miRNAs spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling, metabolisme, proliferatie, differentiatie en apoptose. Bovendien wordt afwijkende post-transcriptionele regulatie van mRNA van miRNAs in verband met tumorigenese [21]. Abnormale expressie profielen van miRNAs werden gedetecteerd in verschillende soorten van humane tumoren, waaronder long [22], borst [23], prostate [24], lever [25], colon [26], en maagkanker [27]. Bovendien kunnen sommige miRNAs functioneren als oncogenen of tumor suppressors door het reguleren van de expressie van doelwitgenen die belangrijke rol in de celcyclus, apoptose en proliferatie spelen. miR-22 [28], miR-101 [29] en miR-7 [30] zijn allemaal aangetoond dat ze downgereguleerd in tumormonsters en functioneren als tumor suppressors; miR-17 [31] en miR-21 [32] Aangetoond is opgereguleerd in tumormonsters en functie als oncogenen. Deze studies geven aan dat ontregeling van miRNAs vaak betrokken bij carcinogenese en progressie van kanker.

Recente studies hebben gesuggereerd dat miR-149 een belangrijke rol kan spelen bij verschillende ziekten, zoals de progressie van maligne tumoren. miR-149 is aangetoond dat het functioneert als zowel een tumorsuppressor [33] en een oncogen [34] in dat meerdere typen vaste tumoren. Bijvoorbeeld, het verlies van miR-149 leidt tot te krijgen van de functie van een aantal oncogenen en correleren met tumor rang niercelcarcinoom [35], astrocytomen [36], en prostaatkanker [37]. Ectopische expressie van miR-149 apoptose van neuroblastoom en HeLa-cellen [33]. Verhoogde expressie van miR-149 gerapporteerd belang bij de progressie van nasofarynxcarcinoom [38] en melanoom [34] is. Verder is ontregeling van miR-149 ook betrokken bij een aantal niet-neoplastische ziekten. Zo is downregulatie van miR-149 expressie betrokken bij de ontwikkeling van primaire myelofibrose, polycytemie vera en essentiële trombocytemie [39], en het verlies van miR-149 kan onderdrukken hepatitis C virus (HCV) RNA overvloed [40]. De expressiepatroon en de rol van miR-149 in de ontwikkeling van GC onduidelijk.

In de onderhavige studie hebben we gevonden dat miR-149 significant neerwaarts gereguleerd in GC cellijnen en klinische monsters ten opzichte van de normale maag epitheelcellen en naburige niet-tumorweefsels, respectievelijk. Ectopische expressie van miR-149 remt proliferatie en induceert G0 /G1 arrestatie van AGS en SGC7901 cellen In vitro
door zich te richten ZBTB2
. Bovendien, uitputting van ZBTB2
door siRNA resulteert in remming van proliferatie en de celcyclus. Het expressiepatroon van miR-149 en ZBTB2 GC cellijnen en klinische monsters werden omgekeerd gecorreleerd verder suggereert dat ZBTB2
een doelgen van miR-149. Introductie van miR-149 resulteert in veranderingen in de expressie van p53, p21, ARF en HDM2, leden van de ARF-HDM2-p53-p21-route, die wordt geregeld door ZBTB2. Samengevat bevestigen deze resultaten dat miR-149 wordt neerwaarts gereguleerd in GC cellen en klinische monsters en suggereren dat miR-149 functioneert als een suppressor van maag groei van kankercellen door remming van proliferatie en voortgang van de celcyclus.

Resultaten

de expressie van miR-149 wordt neerwaarts gereguleerd in GC cellijnen en klinische monsters

om de rol van miR-149 in de carcinogenese van GC te beoordelen, moeten we eerst gebruik van kwantitatieve RT-PCR om de expressie van meten miR-149 in humane GC cellijnen (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901 en MKN28) en vonden dat miR-149 GC cellijnen gedownreguleerd vergelijking met een normale maag epitheel cellijn, GES-1 (Fig. 1A). Met name werd de expressie van miR-149 positief gecorreleerd met de mate van differentiatie GC cellen. Namelijk, de expressie van miR-149 in slecht gedifferentieerde cellijnen, zoals MKN45, GC9811, en AGS, is beduidend lager dan in matig en goed gedifferentieerde cellijnen. De expressie van miR-149 in matig gedifferentieerde cellen, SGC7901, lager dan in de goed gedifferentieerde cellijn, MKN28 (fig. 1A).

Om te bepalen of niveaus van miR-149 ook correleren met de differentiatie graad van tumoren onderzochten we de expressie van miR-149 in 44 menselijke GC klinische monsters, met inbegrip van 13 slecht, matig 16, en 15 goed gedifferentieerd monsters. We vonden dat de expressie van miR-149 in maagtumoren opmerkelijk lager dan in overeenkomstige normale aangrenzende weefsels (fig. 1B). Bovendien is de expressie van miR-149 in meer gedifferentieerde tumoren hoger dan in minder gedifferentieerde tumoren (figuur 1C, F = 65,391, p
. ≪ 0,001). Daarnaast verminderde expressie van miR-149 correleert met lymfeklier metastase (* p
= 0,046) en TNM stadium (** p
= 0,0011) (Tabel 1).

Ectopische expressie van miR-149 remt proliferatie en induceert G0 /G1 arrestatie in AGS en SGC7901 cellen

Om de rol van miR-149 in GC cellen te onderzoeken, benut we slecht en matig gedifferentieerde GC cellijnen, AGS en SGC7901, respectievelijk. AGS en SGC7901 cellen werden tijdelijk met eithermature miR-149 bootst, inhibitor, mock getransfecteerd, of miR-NC. Zoals getoond in figuur 2A, 2D, kwantitatieve RT-PCR resultaten tonen dat expressie van miR-149 bootst of remmers aanzienlijk opwaarts reguleren of neerwaarts reguleren van de expressie van miR-149 in respectievelijk AGS en SGC7901 cellen van de eerste tot vijfde dag na de transfectie (Fig . 2A, F = 8,429, p
= 0,003;. fig. 2D, F = 8,595, p
= 0,003) in vergelijking met NC en mock controles

AGS en SGC7901 cellen getransfecteerd met miR-149 bootst en remmers vertoonden significant lagere en hogere niveaus van celproliferatie, respectievelijk dan de NC of mock groepen zoals bepaald door MTT-bepaling (figuur 2B, F = 27,47, p <. 0,001, fig. 2E, F = 44,061, p < 0,001). Transfectie van AGS en SGC7901 cellen met miR-149 bootst resulteert in aanzienlijke G1 fase-arrest in vergelijking met NC en mock controles ( p Restaurant < 0,05). Bovendien is de behandeling met miR-149-remmers leidde tot minder AGS en SGC7901 cellen in G1 arrestatie in vergelijking met NC en mock controles ( p Restaurant < 0,05). (Fig 2C, F = 134,177, p
< 0,001;. fig. 2F, F = 58,792, p
= 0.003)

ZBTB2
is een doelwit van miR-149

Vorige gegevens suggereren dat miR-149 een suppressor van GC celgroei zou kunnen zijn door zich te richten genen die proliferatie en voortgang van de celcyclus (33-34) (38) te regelen. Zo hebben we gezocht naar bijkomende potentiële doelwitten van miR-149 van TargetScanHuman database. We identificeerden talrijke potentiële miR-149 target genen, met inbegrip van ZBTB2
, een POK familie transcriptiefactor en potente repressor van de ARF-HDM2-p53-p21-route (41). ZBTB2
bleek vermeende miR-149 bindingsplaatsen binnen de 3'UTR (Fig. 3A) te hebben. Luciferase reporter assays werden uitgevoerd om na te gaan of de ZBTB2
is een direct doelwit van miR-149 met behulp van AGS en SGC7901 cellen. We co-getransfecteerd AGS en SGC7901 cellen respectievelijk met een psiCHECK-2 vector die of 3'UTR voor ZBTB2 of gemuteerde 3'UTR voor ZBTB2 en bootst van miR-149 of remmers van miR-149. Wild-type en mutant ZBTB2-3'UTR met de vermoedelijke bindingsplaats van miR-149 werd gekloneerd in psiCHECK 2-vector stroomafwaarts van luciferasegen (afb. S1). Introductie van miR-149 significante daling van de luciferase-activiteit van de ZBTB2 3'UTR reporter vector (Fig 3B-3C, p
. ≪ 0,001), maar had geen invloed op de luciferase-activiteit van de mutant ZBTB2-3 'UTR reporter vector. Deze gegevens suggereren dat miR-149 rechtstreeks regelt ZBTB2
expressie niveaus. Bovendien is er geen significante afname van de relatieve luciferaseactiviteit in cellen gecotransfecteerd met miR-149 remmer of 3'UTR-ZBTB2 /psiCHECK 2-vector (Fig. 3B-3C). Het is misschien vanwege het gebrek aan interactie tussen 3'UTR van ZBTB2 en endogeen miR-149, vandaar verminderde miR-149 expressie heeft luciferaseactiviteit niet verhoogd van de ZBTB2-3'UTR reporter vector. Deze resultaten bevestigen verder dat miR-149 onderdrukt ZBTB2 expressie door te richten op de 3'-UTR van ZBTB2
mRNA.

miR-149 en ZBTB2 expressie wordt negatief gecorreleerd in GC cellen en klinische monsters

de relatie tussen miR-149 en ZBTB2 verder te onderzoeken, onderzochten we de expressie van ZBTB2 in GC cellen met Western blotting en GC weefsels met behulp van immunohistochemie. Het bleek dat GC cellen significant hoger expressieniveau van ZBTB2 dan de normale maag epitheelcel, GES-1 (Figuur 4A a-b F = 167,843, p
. ≪ 0,001). ZBTB2 expressie negatief gecorreleerd met de mate van differentiatie van de GC cellen; slecht gedifferentieerde GC weefsels toonden een significant hogere ZBTB2 expressie niveau dan goed gedifferentieerd GC weefsels en paste de normale maag weefsels (Fig S2A-B, F = 117,280, p
. < 0,001). ZBTB2
mRNA expressie samenvallen met het eiwit niveaus (Fig 4B a, F = 283,355, p
. ≪ 0,001). Voorts wordt de expressie van miR-149 en ZBTB2 omgekeerd gecorreleerd (Fig. 4B b, p
= 0,033, r = -0,908). Vervolgens hebben we gemeten de expressie van miR-149 en ZBTB2
met behulp van kwantitatieve RT-PCR in 5 GC cellijnen (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901 en MKN28) (Fig. 4C a) en 18 GC klinische monsters (6 slecht, 6 matig, en 6 goed gedifferentieerd monsters) (Fig 4C b.). De resultaten bevestigen dat het mRNA niveau van de ZBTB2
negatief correleert met miR-149 expressie (figuur 4C een, p
= 0,033, R = -0,847;. Fig. 4C b, p Restaurant < 0,001, R = -0,908). Bovendien AGS (fig. 4D) en SGC7901 cellen (Fig. 4E) getransfecteerd met miR-149 bootst aanzienlijk verminderde expressie van ZBTB2 op eiwitniveaus (panelen a-b) en mRNA niveaus (panel c) vergeleken met mock of NC cellen ( p Restaurant < 0,001). Onze bevindingen wijzen erop dat miR-149 direct de expressie van ZBTB2
.

miR-149 onderdrukt GC cel proliferatie en voortgang van de celcyclus door zich te richten ZBTB2
kan reguleren

Vervolgens hebben we bevestigd dat miR-149-gemedieerde proliferatie remming en inductie van celcyclus arrestatie in GC cellen vereist doelgerichtheid van de ZBTB2
. ZBTB2
expressie werd aangereden met behulp van siRNA in AGS en SGC7901 cellen. Western blotting (Fig. 5A, a-c) en kwantitatieve PCR analyse toonde dat depletie van ZBTB2
door siRNA transfectie aanzienlijk kunnen worden gecompenseerd door miR-149 remmer en een duidelijke toename van ZBTB2 waargenomen in cellen getransfecteerd met miR-149-remmers (Fig 5B, p
. < 0,001). MTT assay toont dat proliferatie van cellen getransfecteerd met siRNA-ZBTB2 werd onderdrukt en de proliferatie van cellen getransfecteerd met miR-149-remmers aanzienlijk gestegen ten opzichte cellen getransfecteerd met siRNA-NC (controle) en siRNA-ZBTB2 + miR-149 (Fig. 5C ). Bovendien, remming van de ZBTB2
expressie bevordert G0 /G1 arrestatie en onderdrukt de G0 /G1 celcyclus geïnduceerd door miR-149-remmer behandeling in AGS en SGC7901 cellen in vergelijking met NC controle cellen (Fig. 5D-5E, p Restaurant < 0,001). Onze resultaten suggereren dat miR-149 remt proliferatie GC cel en voortgang van de celcyclus door remming van ZBTB2
expressie.

Invoering van miR-149 veranderde de expressie van ZBTB2 en celcyclus-gerelateerde eiwitten

ZBTB2 is vermeld dat een potente repressor van de ARF-HDM2-p53-p21-route, wat belangrijk is bij regulering van de celcyclus (41) zijn. Om de regulering van deze eiwitten door miR-149 in GC cellen te onderzoeken, we getransfecteerde AGS en SGC7901 cellen met miR-149 bootst of miR-NC en uitgevoerd RT-PCR en western blotting analyse voor ZBTB2 target genen. Zoals getoond in Figuur 6A-6B, ectopische expressie van miR-149 downregulates de expressie van ZBTB en HDM2 en reguleert de expressie van ARF, p53 en p21 ( p
< 0,001). Deze gegevens zijn consistent met de functie van ZBTB2 bij de onderdrukking van de transcriptie van ARF, p53 en p21 en activeren de expressie van HDM2 (41). Bovendien ectopische expressie van ZBTB2 door transfectie keerde de miR-149-gemedieerde vermindering van HDM2 expressie en toename van ARF, p53 en p21 expressie in AGS en SGC7901 cellen (Fig. 6A-B). . Ectopische ZBTB2 expressie werd bevestigd in getransfecteerde AGS en SGC7901 cellen (Fig S3, SGC7901 cellen, F = 806,365, p Restaurant < 0,001; AGS cellen, F = 1436,300, p
< 0,001). ARF, p53 en p21 bevorderen voortgang van de celcyclus dan ook, hun neerwaartse regulatie door expressie van miR-149 bootst verklaart de G0 /G1-fase arrestatie in AGS en SGC7901 cellen.

Discussie

Het verhogen van bewijs suggereert dat miRNAs spelen een cruciale rol bij het ontstaan ​​van kanker en de progressie van kanker [21]. Veranderde miRNA expressieniveaus zijn betrokken bij de initiatie en ontwikkeling van tumoren; modulatie van miRNAs die als negatieve regulatoren van oncogenen of tumor suppressors leidt tot stimulering van proliferatie en groei [28] kankercel functioneren - [32]. Eerdere studies hebben aangetoond dat de rol van miR-149 in de progressie van verschillende typen tumoren controversieel [33] - [36], [38]. De uitdrukking patroon en de doelstellingen van miR-149 variëren in verschillende typen tumoren. miR-149 expressie wordt neerwaarts gereguleerd in sommige tumoren, functioneren als een tumor suppressor door zich te richten oncogenen in sommige kankers. Bijvoorbeeld, in clear cell niercelcarcinoom miR-149 wordt neerwaarts gereguleerd en de waarschijnlijke doelstellingen werden geïdentificeerd als KCNMA1 en LOX (35). Verder is miR-149 ook neerwaarts gereguleerd in glioblastoma cellen en is voorgesteld om als tumor suppressor doelwit RAP1B, CD47, CCN1 en NXF1 [36]. Daarentegen kan miR-149 ook functioneren als een tumor suppressor doelwit bepaalde oncogenen. Detectie van miRNA expressieprofielen in verschillende klinische stadia nasofaryngeale carcinoom (NPC) en NPC lymfeklier blijkt dat de expressie van miR-149 is opgereguleerd in NPC en expressie van het doelwitgen, Smad2
, verminderd met de progressie van NPC [38]. Eenzelfde oncogene rol van miR-149 werd ook waargenomen bij melanomen waarbij opregulatie van miR-149 veroorzaakt downregulatie van GSK3-α en opregulatie van Mcl-1, waardoor apoptotische resistentie [34]. Tot nu toe is weinig bekend over de rol van miR-149 bij maagkanker. Hier melden wij dat miR-149 expressie aanmerkelijk wordt verminderd meerdere maagkanker cellijnen en klinische monsters vergeleken met de normale maag epitheelcel en gekoppeld aangrenzend normaal weefsel, respectievelijk. Belangrijk is dat het niveau van miR-149 expressie geassocieerd met de mate van differentiatie GC cellen en specimens; GC slecht gedifferentieerde cellen of exemplaren hebben een lagere miR-149 expressie vergeleken met goed gedifferentieerd monsters. Ectopische expressie van miR-149 remt cellen proliferatie en voortgang van de celcyclus door zich te richten ZBTB2
in AGS en SGC7901 cellen. miR-149 en ZBTB2 expressie zijn negatief gecorreleerd in GC cellen en klinische monsters, en overexpressie van miR-149 zorgt voor neerwaartse regulatie van de ZBTB2
. Uitputting van ZBTB2 resulteert in remming van AGS en SGC7901 cellen proliferatie en voortgang van de celcyclus. Gezamenlijk tonen deze resultaten aan, voor het eerst, dat ZBTB2 kan functioneren als een oncogen in de tumorigenese van maagkanker.

Onze gegevens tonen aan dat de invoering van miR-149 in GC cellen induceert celcyclus, wat suggereert dat miR-149 doelen kunnen worden betrokken bij regulering van de celcyclus. ZBTB2 is een POK familie transcriptiefactor die de ARF-HDM2-p53-p21-route [41] kan onderdrukken. ARF, een tumor suppressor [42], kan worden geïnduceerd door aanhoudende mitogene stimulatie en speelt een belangrijke rol bij het activeren van p53 onafhankelijk en regelen van de stabiliteit van p53 door interactie met HDM2 [43], een belangrijke regulator van p53. De tumorsuppressor p53 speelt een cruciale rol bij het handhaven van homeostase cel tot induceren celcyclus en apoptose wanneer cellen worden blootgesteld aan stressoren, zoals hypoxie, DNA schade en telomere dysfunctie [44]. p21, p53 een doelgen, bemiddelt celcyclus G1 fase-arrest door binding en remming van de activiteit van cycline-CDK2 en CDK1 complexen [45]. ZBTB2 kan de transcriptie van ARF, p53 en p21 onderdrukken en veroorzaken HDM2 expressie [41]. Om te bevestigen of de celcyclus effecten geïnduceerd door miR-149 expressie wordt gemedieerd door ZBTB2 verlies, onderzochten we de expressie van HDM2, ARF, p53 en p21 van AGS en SGC7901 cellen die met miR-149 bootst. We vonden dat ectopische expressie van miR-149 resulteert in verhoogde expressie van ARF, p53 en p21 en verlaagde expressie van HDM2 en ZBTB2. Deze resultaten ondersteunen het idee dat miR-149 oefent zijn remmende rol van GC celproliferatie en celcyclusprogressie doelwit ZBTB2
waardoor de expressie van stroomafwaartse regulatoren van de celcyclus moduleert.

Samengevat onze gegevens geven aan dat miR-149 kan functioneren als een tumor suppressor bij maagkanker cellen en speelt een belangrijke rol bij het remmen van ZBTB2
. Daarom downregulatie van miR-149 bevordert GC cel proliferatie en voortgang van de celcyclus. Bovendien tonen onze resultaten dat ZBTB2 kan functioneren als een oncogen in de ontwikkeling van maagkanker. Gezien het feit dat elke miRNA vele doelgenen die kankerverwekkend kunnen beïnvloeden op verschillende manieren kan reguleren, meer studies nodig zijn om andere miR-149 targets die cruciale rol in GC tumorigenese kan hebben onderzoeken. De huidige studie geeft ook nieuw inzicht in de rol van miR-149 in menselijke maagkanker progressie en geeft aan dat miR-149 als een therapeutisch doelwit voor de behandeling van kanker van de maag kan dienen.

Materialen en methoden

Ethics Verklaring

Voor weefselmonsters, schriftelijke toestemming werd verkregen van patiënten. De in deze studie procedures werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Vierde Militaire Medische Universiteit en is in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki, en om de lokale wetgeving.

Cellijnen en kweekomstandigheden

Gastric kanker lijnen AGS, MKN28, MKN45 werden gekocht van AGCC en werden GC9811 en SGC7901 verkregen cellijnen Beijing Institute of Oncology. Alle cellijnen werden in ons instituut onderhouden volgens de aanbevolen protocollen. Cellen werden gekweekt in RPMI-1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) bij 37 ° C in een 5% CO _{2 incubator .}

menselijke specimens

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional review Board van de Vierde Militaire Medische Universiteit. Schriftelijke informed consent werd verkregen voor alle patiënten samples.Human maagkanker monsters (n = 44) en afgestemd naburige niet-tumor monsters werden verkregen van patiënten bij Xijing ziekenhuis van Maag Lever Darm, de vierde Militaire Medische Universiteit, met informed consent van elke patiënt.

RNA-zuivering, cDNA- synthese en kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)

Totaal RNA van gekweekte cellen werd geëxtraheerd met TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) volgens de protocol en RNAs de fabrikant werden bewaard bij -80 ° C voor qRT-PCR analyse. Rijpe miR-149 expressie werd gedetecteerd met een Mirvana TM qRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas) met U6 als een interne controle. ZBTB2 expressie werd gedetecteerd met primers F: 5'ACTCGGGCGAGATCCACGGC 3 ', R: 5' ACGCAGGCTGCTCATCGGAG 3 'en GAPDH werd gebruikt als een interne controle. PCR producten werden gescheiden op een met ethidiumbromide gekleurde 1,5% agarosegel en zichtbaar gemaakt met UV.

Celtransfectie

De humane miR-149 duplex nabootsen en remmer (miR-149) en negatieve controle oligonucleotide duplex mimic (miR-NC) werden ontworpen en geleverd door Ribobio (Guangzhou, Guangdong, China). De kleine interfererende RNA (siRNA) voor ZBTB2 en de negatieve controle RNA (siRNA-NC) werden gesynthetiseerd en gezuiverd door Genepharma (Shanghai, China). miRNAs, siRNA en ZBTB2 cDNA plasmide (FulenGen Co. China) werden getransfecteerd door LipofectamineTM 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) volgens het protocol van de fabrikant. De ZBTB2 siRNA volgorde: F: 5 'GCUGGCUUCUUUCCAAGUU dTdT 3', R: 5 'AACUUGGAAAGAAGCCAGC 3'; De NC siRNA volgorde: F: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ', R: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3'

miRNA doelwit voorspelling

Om potentiële miRNA target genen te vinden, TargetScanHuman website (. http://www.targetscan.org/) werd gebruikt, de binding vrije energie werd berekend en afwachtend sites werden geanalyseerd met behulp van http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid website.

Vector constructen en luciferase reporter assay

Om ZBTB2-3'UTR plasmideconstruct, een wildtype 3'-UTR fragment van humaan ZBTB2 mRNA (nt 1238-1244, Genbank toegangsnummer. NM_020861.1) die de vermeende miR-7 bindende sequentie werd geamplificeerd door RT-PCR en gekloneerd in de plaats tussen de XhoI en NotI stroomafwaarts van het luciferase reportergen van de psiCHECK ™ vector (Promega, USA). Een mutant van de enkele miR-7 bindingsplaats (5'GAGCCAG-3 'naar ACCGCGC-3 5'') in de 3'-UTR van ZBTB2 werd opgenomen door Site mutagenese Kit (SBS gentech, Beijing, China ). Wilde en mutante vormen van pmirGLO-ZBTB2-UTR vectoren werden bevestigd met DNA-sequentiebepaling

De nucleotide sequenties van primers voor ZBTB2-3'UTR (MT) kloon. MutZBTB2F: 5'GGCCTCACAAGACAAAACAGACCGCGCAAGTAAGGACTGAAGGAGAA 3 'mutZBTB2R: 5' TTCTCCTTCAGTCCTTACTTGCGCGGTCTGTTTTGTCTTGTGAGGCC 3 '

De nucleotide sequenties van primers voor ZBTB2-3'UTR (WT) kloon: ZBTB2XhoIF: 5'CCGCTCGAG ATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCA 3' ZBTB2NotIR: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TACTCATTTAATTAAACGTTTATTC 3 'ZBTB2XhoIF2: 5'CCGCTCGAGATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCATTTTTACAAAGACTATC 3' ZBTB2F3: 5'CCGCTCGAG CTGTAGTTCTCCATGGCATGATAC 3 '.

Cellen werden getransfecteerd met de miR-149 bootst, NC en pmirGLO plasmide 24 putjes met gebruik van Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) volgens de instructies. 48 h later werden de cellen geoogst en geanalyseerd voor luciferase activiteit met het Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) en gedetecteerd door de GloMaxTM 20/20 detectiesysteem (E5331, Promega).

Western blotting

Totaal eiwit uit gekweekte cellen werden gelyseerd met lysisbuffer die PMSF op ijs. Daarna werden eiwitten geëlektroforeerd over 12% SDS-polyacrylamidegelen en werden vervolgens overgebracht naar een PVDF-membraan (Millipore). Membranen werden geblokkeerd met 5% magere melkpoeder bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en overnacht geïncubeerd met primaire antilichamen. Membranen werden geïncubeerd met secundaire antilichamen gemerkt met HRP gedurende 1 uur bij kamertemperatuur na drie 10 min wassingen in TBS-T (triethanolaminebuffered zoutoplossing met Tween). Tenslotte werden de signalen gedetecteerd met ECL-kit (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) en de membranen werden gescand en geanalyseerd met behulp van een Bio-Rad ChemiDoc XRS + beeldvormingssysteem met beeldverwerkingssoftware (versie Afname 1). De eiwitexpressie werd genormaliseerd op een endogene referentie (actine) en opzichte van de controle. De Spectra multicolor brede range eiwit ladder (Fermentas) werd gebruikt als moleculaire marker. Alle bij de Western blot assay antilichamen zijn vermeld in tabel S1.

Immunohistochemie Immunohistochemische en scoring

Paraffinesecties, 4-urn dik, werden gebakken gedurende 2 uur bij 65 ° C en van paraffine ontdaan . Antigeenterugtrekking werd uitgevoerd met natrium citraat buffer (pH 7,2) bij 95 ° C gedurende 15 minuten en daarna werden objectglaasjes bij kamertemperatuur gekoeld gedurende 30 minuten. Na behandeling met 3% waterstofperoxide gedurende 15 minuten om endogeen peroxidase te blokkeren, werden de coupes behandeld met normaal geitenserum beperken vloeistof voor 30 minuten om aspecifieke binding en konijn polyklonaal anti-ZBTB2 (1:500, BIOSS Co . China) werd gedurende de secties gedurende 12 uur bij 4 ° C.After opwarmen gedurende 1 uur en wassen voor 5 tijden werden secties geïncubeerd met secundair antilichaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Diaminobenzidine (DAB) werd gebruikt voor kleurreacties. Latere immunohistochemische kleuring werd gescoord zoals eerder beschreven [46].

MTT-test

De cellen werden met 100 nM miR-149 remmer (Genepharma, Shanghai, China), bootst (Ribobio, Guangzhou, Guangdong) of 100 nM siRNA-ZBTB2 (Genepharma) .Twenty vier later werden de cellen gezaaid in 96-well platen (2 x 103 /putje). De levensvatbaarheid van cellen werd onderzocht door MTT (3-2, 5-difenyl tetrazolium bromide) test (Sigma, USA) per dag gedurende 6 dagen.

celcyclus analyse met flowcytometrie

Maagkanker cellijnen, AGS en SGC7901 werden gekweekt in RPMI-1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) aangevuld met 10% FBS in 6-well platen. Transfectie werd uitgevoerd wanneer de cellen bereikten 80 %% - 90% confluentie. Vervolgens werden de cellen geoogst, tweemaal gewassen met behulp PBS en in 70% ethanol gefixeerd bij 4 ° C overnacht. Daarna werden cellen geïncubeerd met propidiumjodide bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en werden geanalyseerd met stroomcytometrie onder toepassing van een FACScan stromingscytometer (BD Biosciences, Mountain View, CA). Deze gegevens werden geanalyseerd met behulp van FlowJo (FlowJo).

Statistische analyse

De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. Voor statistische testen, SPSS statistisch softwarepakket version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) werd gebruikt. De t-toets, de one-way ANOVA en twee-weg ANOVA-test werd uitgevoerd voor MTT assays, kwantitatieve PCR en tumorgroei curve. De correlatie tussen miR-149 en ZBTB2 werd geanalyseerd met Spearman rank correlatie. P-waarden < 0,05 werden beschouwd als statistisch significant

Ondersteunende informatie
Figuur S1..
wild-type en mutant ZBTB2
-3'UTR daarin de vermoedelijke bindingsplaats van miR-149 werden gekloond in psiCHECK-2 vector. A. ZBTB2
-3'UTR werd vermeerderd uit genomisch DNA van AGS. B. Lane 1,3, 5: Recombinant plasmiden van ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
respectievelijk; lane 2,4,6: respectievelijk Resultaten enzym vertering van recombinante plasmiden van ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
. De resultaten toonden aan dat ZBTB2
-1/2/3 zijn met succes in de vectoren geplaatst (M1:. DL2000 DNA Marker; M2: DL1 kb DNA Marker; ZTBT2-1 /2/3 bands: 1406 bp; vectoren bands: 6.1 Kb). C. M1: 1 kb DNA Ladder Marker. Laan 1: versterking van mut ZBTB2
F1 /R1 (negatieve controle zonder Taq enzym); Laan 2: versterking van mut ZBTB2
F1 /R1. Een band van mut ZBTB2
(7,6 Kb) toonden de succesvolle PCR van mutant-amplificatie. D. Sequencing resultaten van WT ZBTB2 Kopen en MT - ZBTB2
doi:. 10.1371 /journal.pone.0041693.s001
(TIF)
Figuur S2 .
ZBTB2 expressie in menselijke maagkanker specimens en afgestemd aangrenzende normale weefsels. A. Afbeeldingen slechts voorbeeld positieve immunohistochemische kleuring van ZBTB2 in menselijke maagkanker monsters (b-c) en gekoppeld aangrenzend normaal weefsel (a) (vergroting 200 x). B. Immunohistochemische kleuring werd gescoord als eerder beschreven [46]; statistische analyse van gegevens over de ZBTB2 uitdrukking verschil tussen menselijke maagkanker specimens en afgestemd naburige niet-kwaadaardige weefsels (One-Way ANOVA analyse, F = 117,280, *** p Restaurant < 0,001).

• PLoS ONE: CYP2E1 RsaI /PstI polymorfisme en maagkanker Gevoeligheid: Meta-analyses op basis van 24 case-control studies
• PLoS ONE: Genetische susceptibiliteitsfactoren op genen betrokken bij de steroïde hormoon biosyntheseroute en progesteronreceptor voor maagkanker Risk