PLoS ONE: Nicotine Verzwakt Activering van Tissue Resident macrofagen in de muis maag door de β2 nicotine acetylcholine Receptor

De abstracte

Achtergrond

De cholinerge anti-inflammatoire pathway is een endogeen mechanisme waarmee het autonome zenuwstelsel dempt macrofaagactivatiesyndroom via nicotine acetylcholine receptoren (nAChR). Dit concept is echter niet aangetoond op celniveau in intact weefsel. Daartoe hebben we het effect van nicotine op de activatie van macrofagen in muizen maag preparaat bestudeerd met calcium imaging.

Methods

Calcium transiënten ([Ca ^{2 +] _{i) in ingezeten macrofagen werden opgenomen in een maag muis preparaat dat myenterische plexus en spieren lagen van Fluo-4. Activatie van macrofagen werd bereikt door focale trekje toediening van ATP. De effecten van nicotine op activatie van macrofagen werden geëvalueerd en de nAChR is betrokken farmacologisch gekarakteriseerd. De nabijheid van cholinergische zenuwen macrofagen werd gekwantificeerd met confocale microscopie. Expressie van β2 en α7 nAChR werd geëvalueerd door β2 immunohistochemie en-fluorofoor gelabeld α-bungarotoxin}}

Resultaten

In 83% van de macrofagen cholinerge spataderen zenuwvezels werden op afstanden <opgespoord;. 900 nm. De ATP-geïnduceerde [Ca ^{2 +] _{i te verhogen werd significant geremd in 65% of 55% van macrofagen door 100 urn of 10 uM nicotine, respectievelijk. Dit remmende effect werd teruggedraaid door de β2 nAChR voorkeur antagonist dihydro-β-eryhtroidine maar niet door hexamethonium (niet-selectieve nAChR-antagonist), mecamylamine (α3β4 nAChR-voorkeur antagonist), α-bungarotoxin of methyllycaconitine (beide α7-nAChR voorkeur antagonist ). Macrofagen in de maag te uiten β2 maar niet α7 nAChR op eiwit niveau, terwijl die in de darm te drukken beide receptor subunits.}}

Conclusie

Deze studie is de eerste in

situ aantonen van een remming van macrofaag activatie door nicotine suggereren functionele signalering tussen cholinergische zenuwcellen en macrofagen in de maag. De gegevens suggereren dat de β2 subunit van de nAChR is kritisch betrokken bij de nicotine-geïnduceerde remming van deze inwoner macrofagen

Visum:. Nemethova A, Michel K, Gomez-Pinilla PJ, Boeckxstaens GE, Schemann M (2013 ) Nicotine Verzwakt Activering van Tissue Resident macrofagen in de muis maag door de β2 nicotine acetylcholine receptor. PLoS ONE 8 (11): e79264. doi: 10.1371 /journal.pone.0079264

Editor: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 10 juni 2013; Aanvaard: 26 september 2013; Gepubliceerd: 1 november 2013

Copyright: © 2013 Nemethova et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door een subsidie ​​van de Europese Unie 7e Framework Program (ipodd), door de Deutsche Forschungsgemeinschaft Sche267 /9-1 naar MS; door een subsidie ​​van het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO, Odysseus en Hercules-programma) om GEB, en door een FWO postdoctoraal research fellowship aan PJG. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

In 2000, Tracey en collega's aangetoond dat elektrische stimulatie van de nervus vagus verschaft een krachtige anti-inflammatoire ingevoerd in de milt. In een muismodel van sepsis, vagale zenuwstimulatie (VNS) resulteerde in verminderde pro-inflammatoire cytokineproductie, een effect afhankelijk α7 nicotinerge acetylcholinereceptoren (nAChRs) [1,2]. Deze zogenaamde "cholinerge anti-inflammatoire pathway" (CAIP) werkt via adrenerge milt zenuwen die synaptische-achtige contacten met β2 adrenerge receptor tot expressie milt T-cellen. Daaropvolgende afgifte van acetylcholine (ACh) uit deze T-cellen verantwoordelijk voor de anti-inflammatoire werking vermoedelijk door interactie met α7nAChR-expressie macrofagen [1,2].

In 2005 hebben we aangetoond dat de CAIP ook moduleert de intestinale immuunsysteem. In een muismodel van postoperatieve ileus, toonden we aan dat VNS verminderde darm-manipulatie geïnduceerde ontsteking van de dunne darm, een gunstig effect afhankelijk α7 nAChR maar onafhankelijk van de milt [3,4]. Deze gegevens suggereren dat de darm immuunsysteem plaats direct gemoduleerd door vagale zenuwuiteinden en /of enterische neuronen. Als resident intestinale macrofagen zijn de belangrijkste spelers triggering deze ontstekingsreactie [5], deze cellen vormen de meest waarschijnlijke doelwit van de CAIP. In vitro studies met geïsoleerde peritoneale macrofagen, hebben perifere mononucleaire cel afkomstige macrofagen of macrofaag cellijnen inderdaad ruimschoots aangetoond dat acetylcholine en nicotine te verminderen cytokine productie [1-3,6,7] en het verhogen van fagocytose [6]. Toch blijft het de vraag in hoeverre hun fenotype erg lijkt op dat van de bewoner macrofagen beïnvloed door enterische neuronen, vooral omdat receptor expressie in macrofagen op- of neerwaarts gereguleerd zoals ze zijn geïsoleerd uit hun natuurlijke omgeving kan zijn. Daarom besloten we een techniek waarmee we het effect van nicotine op de activatie van macrofagen in hun natuurlijke omgeving bestuderen. Zoals macrofagen door ATP, een bekende gevaar signaal voor immuuncellen [8,9] geactiveerd, blijkt een toename van de intracellulaire Ca ^{2 +, wonen Ca 2 + imaging werd gekozen om de bewoner macrofagen in intacte flat te bestuderen sheet maag muis voorbereidingen. Dit liet ons toe om te vergelijken ATP opgewekte Ca 2 + transiënten ([Ca 2 +] _{i) in macrofagen zich in de gladde spieren lagen voor en na toepassing van nicotine. We verder gebruikt meerdere antagonisten met bekende voorkeur voor specifieke nAChR subeenheden teneinde verdere mechanistische inzicht in de rol van nicotine-receptor tot expressie macrofagen de CAIP in de darm verschaffen. Deze farmacologische bevindingen werden bevestigd door immunohistochemie. Tot slot, analyseerden we het aandeel van de resident macrofagen die in de nabijheid van cholinerge zenuwvezels.}}

Methods

Verklaring Ethiek

Alle muis werk werd uitgevoerd volgens de Duitse richtlijnen voor dierlijke zorg en welzijn (Deutsches Tierschutzgesetz) en door de Beierse staat ethisch comité (Regierung Oberbayern, die dient als de institutionele zorg en gebruik Comite van de Technische Universität München) goedgekeurd volgens §4 en §11 Deutsches Tierschutzgesetz onder het referentienummer 32 -568-2.

weefselmonsters

Male 12-16 weken oude C57BL /6 muizen (Charles River, Sulzfeld, Duitsland) werden gedood door cervicale dislocatie. De maag werd geoogst in ijskoude Krebs buffer die (in mm) 117 NaCl, 4,7 KCI, 1,2 MgCl _{2 6 H 2O, 1,2 NaH 2PO 4, 25 NaHCO 3, 2,5 CaClz 2 2 H 2O en 11 glucose en ingesteld op pH 7,4. De maag werd geopend langs de grotere kromming en gewassen met ijskoude Krebs. Onder microscopische inspectie, werd de maag vastgepind op een Sylgard gerecht en het slijmvlies en submucosa werden zorgvuldig verwijderd. Bij de dissectie, werd het weefsel continu geperfuseerd met ijskoud Krebs oplossing levensvatbaarheid van het weefsel te verzekeren. Alleen de voorste of achterste helft van de maag werd gevestigd op een kleine Sylgard ring met een centrale opening van 100 x 200 mm ^2.}

Calcium imaging

Vlakke plaat muis buik voorbereidingen waren geïncubeerd in gemodificeerde Krebs-oplossing (117 NaCl, 4,7 KCI, 1,2 MgCl _{2 6 H 2O, 1,2 NaH 2PO 4, 20 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2 2 H 2O en 11 glucose) met 30 uM van het fluorescente calcium indicator Fluo 4-acetoxymethyl (AM) (Invitrogen) en 1,25 mM probenecide (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Duitsland) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker en vergast met carbogen (95% O 2-5% CO 2). De Sylgard ring is aangebracht in de opname kamer met serosale zijde van de maag tegenover de bodem van de kamer. De kamer is verbonden met het perfusiesysteem continue perfusie met carbogeen begast Krebs oplossing bij kamertemperatuur mogelijk. Een uitwasperiode van 1,5 uur liet men voorafgaand aan het experiment. Het weefsel kamer werd gemonteerd op een omgekeerde epifluorescentie microscoop (Zeiss Axio Observer A1, Carl Zeiss, Jena, Duitsland), uitgerust met een high speed monochrome camera (Zeiss Axiocam HSM) en software (Zeiss Axio Vision 4.8) voor de verwerving en analyse. Fluo-4 was enthousiast met behulp van een blauw licht emitterende diode (LED) Luxeon III (3W, 470nm dominante golflengte, Philips Lumiled, Phillips, Hambur, Duitsland) werden en fluo-4 signalen gedetecteerd met een filter kubus F26-514 Bright Line FITC BP (excitatie: HC475 /35, dichroïsche: 499, emissie: HC530 /43, AHF Analysentechnik, Tübingen, Duitsland) met behulp van X20 objectief (A-plan, NA = 0,25, Zeiss). Het systeem gemeten ten opzichte van veranderingen in fluorescentie (Δ F /F) van Fluo-4 toezicht op veranderingen in intracellulaire calcium ([Ca ^{2 +] i). Ca 2 + transiënten werden geregistreerd vanaf 3 seconden voordat de plaatselijke toediening van ATP voor een totaal van 14,5 s met een frame rate van 2 Hz en de belichtingstijd van 200 ms.}}

We gebruikten ATP als instrument voor macrofaagactivering omdat het gevaar signaal lokaal vrijgegeven op de plaats van ontsteking [8,9] ATP en omdat bekend is dat cytokine secretie uit macrofagen induceert via verhoging van [Ca ^{2 +] _{i [10-12].}}

ATP (Sigma-Aldrich) en nicotine (Sigma-Aldrich) werden lokaal toegepast door de druk uitwerpen van twee micropipetten met een duur van 200 ms en 10 sec, respectievelijk. De positie van de micropipetten gezorgd dat de uitgestoten hoeveelheden waarop identieke weefselgebieden. De micropipetten werden gevuld met 1 mM ATP en 100 pM of 10 pM nicotine opgelost in Krebs oplossing die 1,25 mM probenecide. Volgens de eerder gepubliceerde kalibratiecurven, schatten we dat een stof onder druk uitstoten pulsen toegepast zal worden verdund met ongeveer 01:10 eenmaal het weefsel [13] bereikt.

Lokale toediening van ATP en nicotine toegestaan ​​meting van reacties op meerdere gebieden (gewoonlijk 4-5) in hetzelfde weefsel. De positie van de regio's in het weefsel werd gedocumenteerd onder het coördinatensysteem weergegeven op de mobiele microscoop podium. Het effect van nicotine op ATP geïnduceerde calcium transiënten werden opnieuw onderzocht in dezelfde regio na toevoeging van verschillende nAChR antagonisten. Na registratie van de reacties werden gevisualiseerd door macrofagen vitale incubatie van het weefsel met allofycocyanine (APC) gemerkte rat anti-muis-anti-F4 /80 antilichaam (1: 250, eBioscience, Frankfurt, Duitsland) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker en vergast met carbogen. Het weefsel werd gedurende 15 minuten gewassen. De microscoop podium werd verplaatst naar de regio's waar we opgenomen van te vinden. Beelden van gemerkte macrofagen werden verkregen met behulp van rode Z-LED P4 (3,5 W) excitatiebron (625 nm dominante golflengte, Seoul Semiconductor) en filter kubus F46-006 ET filter set (excitatie: ET 620/60, dichroïsche: 660, emissie: ET700 /75, AHF Analysentechnik, Tübingen, Duitsland). De overlay van Fluo-4 signalen en beelden van F4 /80 positieve macrofagen liet ons toe om de antwoorden te analyseren in individuele macrofagen.

Immunohistochemie

Om label weefsel inwoner macrofagen, we voor het eerst gebruik gemaakt van de vitale etikettering hierboven beschreven protocol. Het weefsel werd vervolgens overnacht bij kamertemperatuur gefixeerd in een oplossing met 4% formaldehyde en 0,2% picrinezuur in 0,1 M fosfaatbuffer, gewassen 3 x 10 minuten in fosfaatbuffer en uiteindelijk gedurende 1 uur in een oplossing die 0,5% Triton X- 100, 0,1% NaN _{3, 4% paardenserum opgelost in PBS (alle van Sigma-Aldrich). Cholinerge varicosities labelen, werd het weefsel overnacht geïncubeerd in blokkeeroplossing met geit anti-vesiculaire acetylcholine transporter (vacht, 1: 1000, Merck-Millipore, Darmstadt, Duitsland). De weefsels werden gewassen 3 x 10 minuten in PBS en gedurende 1,5-2 uur in de blokkeeroplossing die Cy3-gelabeld anti-geit-antilichaam (1: 500; Dianova, Hamburg, Duitsland). De weefsels werden gewassen 3 x 10 minuten in PBS en aangebracht in anti-fade stof (20% PBS /NaN 3, 80% glycerol) met poly-L-lysine-gecoate glaasjes afgedekt en voor het bekijken.}

Om β2 nAChR labelen in het weefsel inwoner macrofagen, slijmvlies-free maag ganse berg bereidingen van wild-type en p2 nAChR knock-out [14] muizen werden in ijskoude PBS oplossing die 4% paraformaldehyde gefixeerd gedurende 10 min (PFA) . De weefsels werden vervolgens gewassen 2 x 10 minuten in PBS en gedurende 2 uur in PBS met 1% protease-vrij albumine Bovine Fraction V (BSA, Serva, Heidelberg, Duitsland) en 10% normaal donkey serum (NDS, Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA). De weefsels werden gedurende 36 uur met PBS dat 1% BSA, 5% NDS, rat anti-muis F4 /80 (1: 500; kloon BM8, BioLegend, San Diego, USA) en konijn anti-muis β2 nAChR (1: 200; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Duitsland). De weefsels werden gewassen 3 x 10 minuten in PBS en gedurende 1 uur in PBS dat 1% BSA, 5% NDS, Alexa Fluor® 647-gelabeld geit anti-rat antilichaam (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA) en Cy3-gemerkt ezel anti-konijn-antilichaam (1: 1000; Chemicon, Millipore, Billerica, USA). De weefsels werden gewassen 3 x 10 minuten in PBS en aangebracht in slow-fade reagens (Invitrogen Life Technologies, Gent, België) op poly-L-lysine gecoate glaasjes afgedekt en voor viewing.To label α7nAChR in weefsel macrofagen, een stuk maag en ileum muizen werden onderworpen aan vitale kenmerken behulp Cy5-gelabelde α-bungarotoxine (Invitrogen) bij 0,1 ug /ml in RPMI 1640 medium (Lonza, Bazel, Zwitserland) bij 4 ° C gedurende 15 min [4]. De weefsels werden vervolgens gefixeerd in PBS met 4% PFA. De mucosa en submucosa verwijderd en de weefsels werden gedurende 2 uur in blokkeeroplossing bevattende 1% BSA. De weefsels werden vervolgens gedurende 60 h in blokkeeroplossing die rat anti-muis F4 /80 (kloon BM8, BioLegend), gevolgd door 3 x 10 minuten wassen in PBS en gedurende 1 uur in PBS dat 1% BSA en Cy3-gelabelde anti-rat antilichaam (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA). Tenslotte werden de weefsels gewassen 3 x 10 minuten in PBS en aangebracht in slow-fade stof-poly-L-lysine gecoate glaasjes afgedekt en voor het bekijken.

Confocale microscopie en beeldanalyse

beelden werden verkregen met behulp van een LSM 510 (Carl Zeiss) confocale microscoop met Plan-Neofluar x40 /1.3 Olie DIC en Plan Apochromat x63 /1.4 Olie DIC doelstellingen. Laser golflengten van 543 nm en 633 nm werden gebruikt voor de excitatie van de fluoroforen Cy3 en Cy5 of APC respectievelijk. Cy3 en APC of Cy5 signalen werden gedetecteerd met behulp van de filter stelt BP 565-615 IR en BP 650-710 IR, respectievelijk.

Afbeelding stacks voor de kwantitatieve analyse met behulp van de x63 doelstelling werden gescand met een XY-resolutie van 1024 × 1024, dat een oppervlakte van 95,5 × 95,5 micrometer bedekt ^{2. De eerste en laatste optische schijfjes werden op de boven- en onderkant van het buitenoppervlak van een macrofaag. De optische diepte van elk segment was 900 nm. Twee opeenvolgende segmenten overlapt voor 500 nm. Meestal waren tussen de 9 en 16 plakjes gegenereerd resulteert in een scan diepte van 3,2-6,0 micrometer die tussen 1-3 macrofagen en vacht positieve vezels kruising macrofagen. Afbeelding stacks werden geanalyseerd met behulp van Image J Pro.}

Beelden van β2 en α7-nAChR gelabeld macrofagen werden genomen met behulp van de x63 objectieve en gescand met een XY resolutie van 1024 × 1024, dat een oppervlakte van 95,5 x 95,5 urn bedekt ^{2. De optische diepte van de beelden was 900 nm.}

Pharmacology

Om actiepotentiaal propagatie in neuronen blokkeren, tetrodotoxine (Biotrend, Köln, Duitsland) werd toegevoegd aan het perfuseren Krebs oplossing bij 1 uM. Voor farmacologische karakterisering werden de volgende nicotinezuur blokkers toegevoegd aan de Krebs oplossing perfuseren het weefsel: 200 uM hexamethonium (Sigma-Aldrich), 100 uM mecamylamine (Sigma-Aldrich), 10 uM dihydro-β-erythroidine (DHBE, Sigma-Aldrich) , 100 nM, 3 uM en 10 uM α-bungarotoxin (ABGT; Tocris) en 10 nm en 100 nm methyllycaconitine (MLA, Tocris). Hexamethonium, mecamylamine en DHBE werden getest in de concentraties die in staat zijn nicotinezuur snel prikkelende postsynaptische potentialen af ​​te schaffen in cavia myenterische neuronen waren [15] .Het gebruik van 10 nm en 100 nm MLA is gebaseerd op de concentratie van respectievelijk gebruikt om α7 subunit bevattende nAChR te blokkeren [16] en gebruikt om IL-6 secretie van geïsoleerde peritoneale macrofagen remmen [3].

data analyse en statistiek

De maximale relatieve veranderingen in fluorescentie (Δ F /F) in reactie op ATP administratie werd uitgedrukt als% toename boven de basale fluorescentie voordat ATP administratie. De statistische analyses werden uitgevoerd met Sigma Plot 9,0 (systat Software Inc, Erkrath, Duitsland). Gegevens zijn weergegeven als whiskerdiagrammen de mediaan en het 25 ^{e en 75 e percentielen en het 10 e en 90 e percentielen. Niet normaal verdeelde gepaarde gegevens werden geanalyseerd door de Wilcoxon rank test ondertekend. Verschillen werden beschouwd als statistisch significant bij P
< 0,05. N
nummers tussen haakjes geven het aantal macrofagen /weefsels onderzocht, dat wil zeggen een resultaat op basis van opnames van 20 macrofagen in 5 weefsels (gelijk aan 5 dieren) wordt gepresenteerd als (20/5).}

Resultaten

Ruimtelijke relatie tussen weefsel inwoner macrofagen en cholinerge varicosities in de maag van de muis

We gebruikten confocale microscopie om de nabijheid tussen F4 /80-positieve macrofagen en vacht-positieve spataderen cholinerge zenuwvezels beoordelen in de maag van de muis (Figuur 1A). Gedetailleerde analyse blijkt dat 83% van de 41 macrofagen bestudeerd liggen op 900 nm ten minste een varicose cholinerge zenuwvezels (Figuur 1B-C).

reproduceerbaarheid van ATP opgewekte [Ca 2 +] i signalen in resident macrofagen weefsel

Microejection van ATP veroorzaakte een sterke, snel begin [Ca ^{2 +] _{i voorbijgaande in macrofagen, dat zijn hoogtepunt 8-10 seconden na het aanbrengen bereikt gevolgd door een langzame terugkeer naar de baseline [Ca 2 +] i niveaus (Figuur 2A en Movie S1). Aangezien er niet altijd volledig herstel van het basale niveau tijdens de opname periode, de maximale [Ca 2 +] i signaal werd gebruikt voor de analyse van alle experimenten. Nr tachyfylaxie waargenomen aangezien de maximale amplitude van [Ca 2 +] i in reactie op een tweede ATP toediening, 10 minuten na de eerste, niet afwijken van de initiële maximale respons (Figuur 2B).}}

het effect van nicotine op [Ca ^{2 +] _{i signalen in resident macrofagen weefsel}}

Om het effect van nicotine op de ATP opgewekte bestuderen [Ca ^{2 +] _{i signalen die we microejected nicotine gedurende 10 sec en onmiddellijk opnieuw aangebracht ATP op dezelfde regio. Een rationeel nicotine als selectieve, niet-aangetaste nAChR agonist zou nicotinische receptor activatie nabootsen door afgifte van acetylcholine uit cholinerge neuronen. Het analyseren van de veranderingen in [Ca 2 +] i in alle macrofagen bleek dat nicotine significante vermindering van het ATP opgewekte [Ca 2 +] i-signalen (figuur 2D en F). Een meer gedetailleerde analyse van de effecten van nicotine op de ATP-geïnduceerde [Ca 2 +] i transiënten onthulde drie populaties van macrofagen (figuur 2D-G). Nicotine bij 10 en 100 uM vermindering van het ATP opgewekte [Ca 2 +] i signalen in 55% en 65% van macrofagen, respectievelijk. De [Ca 2 +] i signaal onveranderd bleef 36% en 28% van macrofagen na toepassing van 10 pM en 100 pM nicotine, respectievelijk. In een klein deel, 10 pM en 100 pM ATP nicotine versterkte het opgewekte [Ca 2 +] i respons (9% en 7% van macrofagen, respectievelijk).}}

Om vermijden voorspanning verdere analyse is gebaseerd op nicotine effecten op alle macrofagen ongeacht of het ATP geïnduceerde [Ca ^{2 +] _{i signaal verlaagd, verhoogd of ongewijzigd.}}

Rol van neuronen in de nicotine opgeroepen verzwakking van de activering van macrofagen

Nicotine activeert direct enterische neuronen en we ingegaan op de mogelijkheid dat de activering van close-by myenterische neuronen bijgedragen aan de verzwakte [Ca ^{2 +] _{i reacties in macrofagen. Er zijn geen aanwijzingen gevonden in dergelijke indirecte remmende pathway omdat de verzwakking van de ATP opgewekte [Ca 2 +] i-signaal door nicotine bleef in aanwezigheid van tetrodotoxine (figuur 2C). Opmerkelijk is echter dat het aandeel van de macrofagen wanneer nicotine niet gewijzigd ATP opgewekte [Ca 2 +] i signalen werden sterk verminderd (28% versus 6%). Tegelijkertijd, macrofagen waarbij nicotine geremd of versterkt ATP opgewekte [Ca 2 +] i signalen gestegen van 65% tot 71% en van 7% tot 23%, respectievelijk.}}

farmacologische karakterisering van het remmende effect van nicotine op weefsel macrofagen

de activatie van macrofagen door ATP en de remming van de ATP reactie van 100 uM nicotine is betrouwbaar opgenomen in elk van de 21 preparaten in figuur 2F. Dit liet ons toe om antagonisten studies uit te voeren zonder de noodzaak om de remmende respons in die macrofagen behandeld met de antagonisten restudy. Bovendien we waardoor het aantal opnameperiodes verlaagd tot een niveau waarbij geen signaalsterkte en gegarandeerde reproduceerbare ATP antwoorden dat compromis. Om de nAChR subeenheden die betrokken zijn bij het remmende effect van nicotine onderzoeken, testten we vijf verschillende blokkers bekende subeenheid voorkeur [17] (figuur 3). Het remmende effect van nicotine op ATP opgewekte [Ca ^{2 +] _{i reacties was onveranderd in de aanwezigheid van het niet-selectieve ganglion nAChR antagonist hexamethonium, de α3β4 nAChR-voorkeur antagonist mecamylamine of α7-nAChR voorkeur antagonisten α-bungarotoxine en methyllycaconitine (figuur 3A). De β2-nAChR antagonist voorkeur di-hydro-β-eryhtroidine omgekeerd het remmende effect van nicotine op ATP opgewekte [Ca 2 +] i reacties in macrofagen (figuur 3B).}}

Hoewel we gebruikten ABGT in concentraties die beschreven betrouwbaar blokkeren α7 nAChR in neuronen en geïsoleerde alveolaire macrofagen [18], werden we bezorgd dat hij niet bij het remmende effect van nicotine antagoneren kan het gevolg ongunstige concurrentie op de bindingsplaats. Dit lijkt echter onwaarschijnlijk opgeroepen omdat zelfs bij concentraties van 3 pM en 10 pM ABGT was niet in staat om het remmende effect van nicotine op ATP omgekeerde [Ca ^{2 +] _{i responsen (Figuur 3A). ABGT ook niet de demping opgeroepen door 10 uM nicotine (figuur 3C) te keren.}}

Etikettering van β2 maar niet a7 nAChR in ingezeten macrofagen weefsel

Om aanvullend bewijs voor de betrokkenheid van β2 nAChR te bieden, maar niet die van α7 nAChR in het remmende effect van nicotine op de ATP-opgewekte [Ca ^{2 +] _{i reacties, immunohistochemische etikettering van p2 nAChR en vitale etikettering van α7 nAChR door ABGT in ingezeten macrofagen van maag muscularis werden uitgevoerd (figuur 4). De meerderheid van de resident macrofagen van de maag muscularis werden p2 nAChR-immunoreactieve (Figuur 4A) ter ondersteuning van de waargenomen antagonistische effect van DHBE op de nicotinereceptoren remming van ATP reacties. De gebruikte antilichaam voor nAChR p2 specifiek vanwege het ontbreken van nAChR p2-immunoreactiviteit in een β2 nAChR knockout muis (Figuur 4B).}}

Vital kenmerken van α7 nAChR door ABGT geopenbaard zonder α7 nAChR in weefsel macrofagen in maag van de muis (Figuur 4C), daarentegen, intestinale macrofagen werden gemerkt door ABGT (figuur 4D). Het gebrek aan α7 nAChR in macrofagen maag muscularis bevestigd dat er geen antagonisme van α7-nAChR voorkeur blokkers ABGT en MLA op het remmende effect van nicotine op ATP opgewekte [Ca ^{2 +] _{i responsen in deze cellen.}}

Discussie

Tot op heden heeft het effect van nicotine is onderzocht alleen in geïsoleerde macrofagen of macrofaag cellijnen. Hier hebben wij een in vitro model
maag muizenspier-myenterische plexus preparaat ontwikkeld om het effect van nicotine op weefsel macrofagen in hun natuurlijke omgeving bestuderen. Deze studie is daarom als eerste aan dat nicotine rechtstreeks inhibeert activatie van weefsel macrofagen tot β2 subunit bevattende nAChR en daarmee de basis voor signalering tussen functionele cholinergische zenuwcellen en macrofagen in de darm. Onze conclusie wordt ondersteund door verschillende lijnen van de bewijzen. Ten eerste ATP opgewekte [Ca ^{2 +] _{i transiënten in macrofagen wordt aanzienlijk verminderd door nicotine zelfs in de aanwezigheid van de zenuw blocker tetrodotoxin. Ten tweede, de nicotine geïnduceerde demping van ATP reacties in macrofagen werd omgekeerd door DHBE, ze niet hexamethonium, mecamylamine, ABGT of MLA. De farmacologische bevindingen werden gesteund door de demonstratie van β2-positiv maar ABGT-negatieve nAChR subunits op de maag macrofagen. Ten derde het merendeel van macrofagen waren in directe nabijheid van varikeuze cholinerge zenuwvezels. Vergelijkbare nabijheid van macrofagen om zenuwvezels waargenomen in de rat intestinale muscularis [3].}}

Onze criterium gebruikt om de nabijheid tussen macrofagen en cholinerge zenuwvezels (900 nm afstand) te definiëren is het eens met het concept van extrasynaptic communicatie . Volgens dit concept een diffusie ondersteunde volume transmissie kan optreden bij 100 nm om urn afstanden tussen de bron en het doel [19]. We nemen aan dat de meeste, zo niet alle, cholinergische zenuwen in de nabijheid van macrofagen afkomstig van myenterische neuronale cellichamen gebaseerd op eigen waarneming dat vagale vezels geen contact intestinale macrofagen [3] Dit wordt ook ondersteund door de bevindingen die de maag vagale efferente vezels vrijwel uitsluitend beëindigen enterische ganglia [20], waar ze activeren de meeste myenterische neuronen met nicotinereceptoren [15].

De CAIP is een fysiologisch systeem om macrofaagactivatiesyndroom controle tijdens inflammatoire aandoeningen. De anti-inflammatoire effect van CAIP activering is aangetoond In vivo
door nervus vagus stimulatie in muismodellen van sepsis en postoperatieve ileus [2,3] en In vitro
door nicotine toediening aan geïsoleerde , lipopolysaccharide gestimuleerde macrofagen [1-4,21]. In de huidige studie, vonden we dat nicotine verminderd de ATP-geïnduceerde stijging van de intracellulaire Ca ^{2 + in ingezeten macrofagen in de maag. Interessant is dat dit effect omgekeerd door de β2 nAChR subunit voorkeur antagonist DHBE wat suggereert dat de betrokkenheid van deze subunit in de nicotine-gemedieerde modulatie van de bewoner macrofagen. Deze waarneming is consistent met onze eerdere bevindingen dat DHBE omgekeerde nicotine geïnduceerde remming van tumornecrosefactor-α (TNF-α) afgifte en verhoogde fagocytose in geïsoleerde peritoneale macrofagen [6]. Overeenkomstig, cytokine productie van humane neuroblastoma cellijn stabiel getransfecteerd met α4β2 nAChR aanzienlijk verminderd door nicotine voorbehandeling [22]. Hoewel deze gegevens suggereren dat α4β2 nAChRs het effect van nicotine op het ATP-geïnduceerde toename in intracellulaire Ca kan mediëren 2+ recente gegevens blijkt dat β2 subeenheden ook samenstellen met andere α subeenheden, waaronder α7 subeenheden. Een recente publicatie bespreekt de elektrofysiologische eigenschappen van α7β2 nAChR tot expressie gebracht in humane epitheliale cellijnen toonden aan dat lage concentraties van DHBE geantagoneerd α7β2 nAChR maar niet a7 nAChR [16]. Deze en andere gegevens op het farmacologisch profiel van DHBE zou suggereren dat DHBE is een uiterst selectieve antagonist van P2-nAChR, maar niet betrouwbaar onderscheid tussen de verschillende samenstellingen van α3, α4 of α7 met β2. Toch zou onze immunohistochemische en essentiële kenmerken van de maag inwoner macrofagen geen betrokkenheid van α7 nAChR bevoordelen omdat de maag macrofagen niet werden gelabeld door ABGT maar sprak de β2 nAChR subunit.}

Toch kiezen we voor een eerder conservatieve interpretatie van onze data en concluderen dat β2 nAChR zijn kritisch betrokken bij nicotine remming van macrofaag activiteit, hoewel het waarschijnlijk is dat de concentratie gebruikt in onze studie DHBE voorkeur blokken α4β2 nAChR. Onze voorbereiding is bij uitstek geschikt in toekomstige studies naar het adres van de mogelijke bijdrage van α7β2 nAChR door het onderzoeken van het effect van nicotine in het weefsel inwoner macrofagen uit α7 nAChR, P2 en nAChR α7β2 nAChR dubbel knock-out muizen. Soortgelijke strategieën worden gebruikt om de betekenis van een α4β2 nAChR bestuderen.

Het is belangrijk op te merken dat de antagonistische werking van DHBE niet selectief is voor macrofagen DHBE, zoals hexamethonium en mecamylamine, blokkeert ook nicotine synapsen in de maag myenterische neuronen [15]. Niettemin moet de nicotine receptoren op macrofagen andere eigenschappen dan die van enterische neuronen bezitten aangezien noch hexamethonium mecamylamine of omgekeerd nicotine geïnduceerde demping van ATP opgewekte responsen in macrofagen. Hexamethonium en mecamylamine oefenen hun acties door verstopping van de poriën van de nicotine-kanaal [23-25]. Hun onvermogen om de nicotine inhibitie van macrofagen te keren kan het bestaan ​​van een atypische nAChR in macrofagen suggereren. Inderdaad, opname van Ca ^{2 + transiënten in reactie op nicotinetoediening geopenbaard toegenomen [Ca 2 +] _{i in slechts 13% van macrofagen (6 van de 45 macrofagen; gegevens niet getoond). Deze populatie is veel kleiner dat het aantal macrofagen die nicotine gemoduleerde ATP opgewekte [Ca 2 +] i.}}

overvloedig bewijs suggereert dat α7 nAChR speelt een cruciale rol in de nicotine geïnduceerde verlaging van macrofagen cytokineproductie [2,3,6,26]. Eerder hebben we inderdaad aangetoond dat nicotine niet verminderen TNF-α productie in peritoneale macrofagen van α7 nAChR knockout muizen [6], terwijl de anti-inflammatoire werking in de dunne darm van nervus vagus stimulatie in ons model van postoperatieve ileus verloren in deze KO muizen [4]. In de onderhavige studie is echter het effect van nicotine op ATP-geïnduceerde activering van macrofagen werd niet geblokkeerd door de α7 nAChR voorkeur blokkers ABGT en MLA argument tegen de betrokkenheid van α7 nAChRs. Dit wordt verder ondersteund door het ontbreken van etikettering van maag muscularis macrofagen door α7-nAChR voorkeur α-bungarotoxin. In de darm, maar we deden acht α-bungarotoxin positieve gelabelde muscularis macrofagen [4 en deze studie], met vermelding van de regio-specifieke verschillen in het fenotype van deze afweercellen.

Hoewel het schijnbare gebrek aan ABGT-gevoelige α7 nAChR in onze studie lijkt in tegenspraak met onze eerdere bevindingen, we hebben er alle vertrouwen dat deze gegevens niet te wijten aan het onvermogen van ABGT om te concurreren voor de bindingsplaats als dezelfde concentratie gebruikt in onze studie blokken neuronale α7 nAChR in de hersenen en in

• PLoS ONE: Electroacupuncture bij ST36 verbetert Maaglediging en Reddingen netwerken van interstitiële cellen van Cajal in de maag van diabetische ratten
• PLoS ONE: Tonic en Fasische gladde spiercontractie is niet geregeld door de PKCa - CPI-17 Weg in Swine Maag Antrum en Fundus