PLoS ONE: Flotillin2 Expression korrelerer med HER2 Nivåer og dårlig prognose i Gastric Cancer

Abstract

Mål

Flotillin genet er kjent som en svulst promoter eller suppressor, avhengig av tumortype eller svulst scene. Vi forsøkte å undersøke den kliniske betydningen av flotillin2 protein uttrykk i magekreft.

Metoder

Vi undersøkte flotillin2 og ErbB2 nivåer i vevet microarray av 282 magekreftprøver og analysert sammenhengen mellom flotillin2 nivåer, clinicopathologic faktorer og prognose. Reguleringen av erbB2 ved flotillin2 ble undersøkt med flotillin2 siRNA-transfektert mage kreftceller.

Resultater

Flotillin2 delvis samlokalisert med erbB2 på plasmamembranen som oppdages av konfokalmikroskopi, nivåer av erbB2 ble redusert etter flotillin knockdown i SGC-7901 kreftceller, og uttrykk for flotillin2 var positivt korrelert med at av erbB2. I ikke-neoplastiske gastrisk mucosa, ble flotillin2 ikke uttrykt i det epiteliale rom. I magekreft, ble positiv farging av flotillin2 vist i 129 (45,7%) av 282 tilfeller, også, det var signifikant assosiert med Lauren klasse, histologisk type lymphovascular invasjon og svulst plassering. Videre overlevelsesanalyse viste at flotillin2 ekspresjon var et uavhengig prognostisk faktor av dårlig overlevelse (p < 0,001).

Konklusjoner

Disse resultater indikerer at en positiv korrelasjon mellom flotillin2 og erbB2 ekspresjonsnivåer, flotillin2 kanskje involvert i stabilisering av erbB2 på plasma membran, flotillin2 signifikant korrelert med kreft progresjon og dårlig prognose i magekreft

Citation. Zhu Z, Wang J, Sun Z, Sun X, Wang Z, Xu H (2013) Flotillin2 Expression korrelerer med HER2 Nivåer og dårlig prognose i magekreft. PLoS ONE 8 (5): e62365. doi: 10,1371 /journal.pone.0062365

Redaktør: Joseph Najbauer, Universitetet i Pécs Medical School, Ungarn

mottatt: 15 februar 2013; Godkjent: 20 mars 2013; Publisert: 02.05.2013

Copyright: © 2013 Zhu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (81272718), Young Scholars 'forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning i Kina (20122104120008) og fondet for Scientific Research av det første sykehuset i Kina Medical University (FSFH1208). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Mange plasma membran proteiner er kjent for å være involvert i celledeling, celle adhesjon, cellemotilitet og tumorcelle invasjon, sto for mer enn to tredjedeler av kjente narkotika mål. Cellemembranen og assosierte proteiner er av vesentlig interesse med hensyn til ulike aspekter av tumor, fra kreftfremkallende og metastatiske mekanismer for å molekylær diagnose og terapi [1]. Flotillins er forbundet med vesikulær invaginations av plasmamembranen, og fungere som regulatorer av signaltransduksjon [2]. Blant flotillin familiemedlemmer, er det to forskjellige flotillin gener (flotillin1 og 2), flotillin2 protein ekspresjon har blitt rapportert i noen humane kreftcellelinjer og tumorprøver [3], [4], [5], [6]. Siden flotillin2 samhandler direkte med signalmolekyler som reseptorer, kinaser, adhesjonsmolekyler og G-proteiner, fungerer den som en svulst modulator gjennom regulering av celledeling, differensiering, apoptose, adhesjon og invasjon [4].

Overuttrykte av erbB2 (human epidermal vekstfaktor-reseptor-2), også kjent som HER2, er membran-assosiert tyrosinkinase som kan føre til aktivering av cellulære signaloverføringssystemer, noe som resulterer i cellulær transformasjon og cellesprednings hendelser assosiert med cancer, for eksempel brystkreft kreft, eggstokk-kreft og magekreft [7], [8], [9]. Høy ekspresjon nivå av erbB2 er signifikant korrelert med økt tumorinvasjon, metastase, resistens mot kjemoterapi, og dårlig prognose av pasienter [10]. Nyere studier har vist at flotillin2 protein, blant andre funksjoner, var involvert i endocytiske mekanismer og cellulære trafikk prosesser, og ble funnet å være i et molekylkompleks med erbB2 [11]. For å forstå om stabilisering av erbB2 på plasmamembranen er mediert av flotillin2 og deres kliniske betydning, gjennomførte vi sammen membran proteomikk analyse av menneskelig magekreft.

I denne studien beskriver vi flotillin2 og erbB2 uttrykk nivåer er positivt korrelert på cellenivå, samt i magekreft vev og vi viser at erbB2 er internalisert og brytes ned av en mekanisme på flotillin2 uttømming. Videre clinicopathologic betydningen av flotillin2 ble videre undersøkt ved hjelp av arkiv vevsprøver og statistisk analyse. Vi fant at flotillin2 er en uavhengig prognostisk faktor, også en potensiell ny biomarkør for lymfeknutemetastaser. Våre data vil rette for en forståelse av mage kreft karsinogenisitetsstudier og gruvedrift biomarkører for diagnostisering og behandling av denne sykdommen.

Materialer og metoder

vevsprøver og oppfølging

En totalt 282 pasienter som hadde kirurgi for magekreft mellom januar 2006 og desember 2009 kl First Affiliated Hospital Kina Medical University ble valgt for denne studien. Alle pasienter-avledet prøver ble samlet inn og arkivert i henhold til protokoller godkjent av Institutional Review Boards of the First tilknyttet Hospital Kina Medical University. Diagnosen ble bekreftet av minst to patologer og iscenesettelse var basert på patologiske funn i henhold til syvende amerikanske Joint Committee on Cancer retningslinjer. Median varighet av oppfølging var 51 (range, 5-78) måneder.

282 pasienter som gjennomgikk gastroctomy ble utsatt for nøye klinisk observasjon, inkludert bryst og buk CT bildebehandling, CEA nivå, og blodprøver på 2- til 3-måneders intervaller og en årlig gastroskopi. Total overlevelse (OS) priser ble definert som intervallet fra den første operasjonen til klinisk eller radiologisk påvist tilbakefall eller metastasering og død, henholdsvis. Sluttdato for oppfølgingsstudie for å gjennomføre analysen var 29. juni ble 2012.

Etikk uttalelse

Etisk godkjenning for denne forskningen hentet fra forskningsetiske komité for Kina Medical University, Kina. Alle pasienter som gir svulstvevet samt normale prøver mage vev signerte en samtykkeerklæring før kirurgisk fjerning av magekreft for å tillate denne forskningen som skal utføres.

TMA konstruksjon og immunhistokjemi

Hematoxylin og eosin (H &Co. E) -stained objektglass ble screenet for optimal tumorvev og noncancerous vev tilstøtende til tumor (minst 2 cm fra tumor) og TMA objektglass ble konstruert med en vev manuell oppstillings instrument. To kjerner ble tatt fra hver formalinfiksert, parafin-innleiret (FFPE) magekreft vevsprøve og fra hver normal gastrisk mucosa prøve ved anvendelse av en 1,0 mm diameter dor instrument. Prøver fra den samme pasient ble oppdaget ved siden av hverandre for å sikre tilsvarende reaksjonsbetingelser for det normale og tumorvev hos denne pasienten. Immunhistokjemisk analyse ble utført på FFPE-prøver som beskrevet tidligere ved hjelp av en Envision kit (Dako Cytomation, Glostrup, Danmark) [12]. Trykkoker mediert antigen gjenfinning ble utført i citrat-buffer (pH 6,0) i 7 min. Seksjoner ble inkubert med en 200 fortynning av anti-flotillin2 (Santa Cruz, sc-25507) og erbB2 (SC-33684) over natten ved 4 ° C, og deretter inkubert med geite-anti-mus eller anti-kanin Envision System Plus-HRP ( Dako Cytomation) i 30 minutter ved romtemperatur. Etter skylling tre ganger i PBS i 10 minutter hver, ble seksjonene inkubert med DAB i 1 minutt, motfarget med Mayer hematoksylin, dehydrert, og montert.

Evaluering av immunhistokjemisk farging

Immunreaktiviteten ble bedømt uavhengig av to forskere som var blindet for pasientens utfall. Evalueringen var basert på fargeintensitet og graden av farging. Fargeintensitet for flotillin2 og erbB2 ble scoret som 0 (negativ), en (svak), 2 (moderat), og 3 (sterk). Farging utstrekning ble scoret som 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%), og 4 (76-100%), avhengig av prosentandelen av positive -stained celler. Summen av fargeintensitet og fargings grad score ble anvendt som den endelige farging stillingen. Prøvene ble delt inn i tre grupper etter deres samlede score: 0-1, negativ, 2-4, svak positiv, og 5-7, sterk positiv

FISH analyse for mage kreftceller
<. p> Amplifisering av erbB2-genet ble bestemt ved to-farge FISH måte ved hjelp av Passvision HER2 DNA-probe-sett (Vysis Inc. Downers Grove, IL, USA) i henhold til produsentens protokoll. HER2-spektrum Orange sonde inneholder en DNA-sekvens som er spesifikke for erbB2 humane gen locus og hybridiserer til region 17q11.2-q12 av humant kromosom. CEP 17 (kromosom oppregning probe 17) anvendt som en kontroll inneholder alfa-satellitt-DNA. Kjernen ble kontra med 40, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI). Den nakne mus av magekreft modell (SGC-7901, MGC-803 og BGC-823) ble gjort som beskrevet tidligere [13], [14]. Tumor lysbilder ble observert etter BX60 fluorescens mikroskop utstyrt med digitalt kamera (DP50) (Olympus, Tokyo, Japan), og bildene ble tatt med Søker programvare. En celle ble ansett for å vise forsterkning når en bestemt klynge eller mer enn 10 signaler for erbB2 ble funnet.

Cellekultur og trans

magekreft cellelinjer SGC-7901 (moderat differensiert), MGC -803 og BGC-823 (dårlig differensiert) ble alle kjøpt fra cellen bank av Chinese Academy of Sciences. Cancercellelinjer ble holdt i RPMI 1640 (Hyclone, Logan by, USA) supplert med 10% FBS. Alle cellelinjer var i en 5% CO2 fuktet atmosfære ved 37 ° C. For siRNA transfeksjon, ble cellene sådd ut i seks-brønns plater ved en tetthet på 2 x 10 ^{5-celler /brønn, 24 timer før transfeksjon, sirnas rettet mot ikke-overlappende deler av mRNA-sekvensen ble anvendt for flotillin2. For uttømming av flotillin2, en pool av to forskjellige siRNA med sekvensene målretting konstruere GAGGUUGUGCAGCGCAAUU og GGAUGAAGCUCAAGGCAGA [15], ble cellene sådd ut uten antibiotika, dyrket i 24 timer og transfektert ved hjelp av Lipofectamine transfeksjon reagens (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens prosedyre. Etter 4 timer med transfeksjon, ble mediet skiftet for å fullvekstmedium inneholdende serum og antibiotika, og cellene ble dyrket i 3 dager før forsøkene ble startet.}

Immunofluorescence, Western blot og QRT-PCR

Cellene ble vasket to ganger med kald PBS og lysert på is i RIPA-buffer med proteasehemmere og kvantifisert ved hjelp av BCA-metoden. 50 ug Protein lysater ble løst i 6% SDS-polyakrylamidgel, elektrooverført til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Bedford, MA) og blokkert i 5% fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann (pH = 7,5). Membranene ble immunoblottet over natten ved 4 ° C med anti-flotillin2 /ErbB2 polyklonale antistoffer som IHC beskrevet ovenfor, henholdsvis, og deretter etterfulgt av deres respektive sekundære antistoffer. Signaler ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens (Pierce, Rockford, IL). For Immunofluorescence, ble binding av primært antistoff gjort synlig ved TRITC /FITC-konjugert geite-anti-muse-IgG-antistoff, og objektglassene ble deretter undersøkt ved hjelp av en konfokal laser scanning mikroskop.

PCR-amplifikasjoner for kvantifisering av flotillin2, erbB2 og GAPDH mRNA i celler ble gjort i en LightCycler system (Roche Applied Science) ved hjelp av LightCycler Faststart DNA Master SYBR Grønn jeg kit (Roche Diagnostics). I korte trekk, ble en mester blanding forberedt på is, som inneholder 1 mL av komplementære DNA, 2 mL av LC DNA Master SYBR Grønn Jeg mix, 50 ng av primere, og 4 mM MgCl2. Forsterkningsbetingelsene for 40 sykluser besto av denaturering ved 95 ° C i 10 sekunder, annealing ved 65 ° C i 10 s, og forlengelse ved 72 ° C i 10 sek. Produktene ble deretter utsatt for en temperaturgradient 68-95 ° C ved 0,1 ° C /s, med kontinuerlig overvåking fluorescens for å fremstille smelte kurver av produktene. Uttrykket nivåer ble normalisert til erbB2 mRNA uttrykk.

Statistisk analyse

χ ^{2 test eller Fishers eksakte test for andel ble brukt, når det er hensiktsmessig, for å analysere forholdet mellom flotillin2 og erbB2 uttrykk og clinicopathological variabler. Overlevelsesratene ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden og forskjellene mellom overlevelseskurver ble undersøkt ved hjelp av log-rank test. Univariate Cox regresjon ble brukt for å estimere den enkelte hazard ratio (HR). De betydelige variablene i univariate analyser (P < 0,05) ble deretter satt inn i multivariat analyse. HR med 95% konfidensintervall (KI) ble målt til å anslå fare risikoen for individuelle faktorer. P < 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Analysene ble utført ved hjelp av SPSS statistisk programvare programversjon 19,0 (SPSS Inc., Chicago, IL).}

Resultater

Uttrykk for flotillin2 og erbB2 i magekreft

Farget seksjoner av microarray (TMA) av 282 vev kjerner ble gradert for deres cytoplasmatic immunhistokjemisk farging intensitet mot flotillin2 og erbB2 protein. De 282 lesbare prøver inkludert 282 gastrisk karsinom, 181 peri-karsinom og 101 prøver av normal gastrisk epitel vev. Tumorceller viste typisk diffus membranfarging av flotillin2 kan finnes i gastrisk karsinom (figur 1a) med den tilsvarende plasseringen av erbB2 (figur 1b), i ikke-neoplastiske gastrisk mucosa, flotillin2 og erbB2 var begge ikke uttrykt. Positiv farging av flotillin2 ble vist i 129 (45,7%) av 282 prøver, erbB2 var 59 (20,9%). Amplifisering av erbB2-genet ble bestemt ved to-farge FISH av xenotransplantater i nakne mus. ErbB2 genamplifisering i en klynge mønster (rød) ble observert i MGC-803, BGC-823 og SGC-7901 celler, erbB2 overekspresjon bare i menneskelig SGC-7901 magekreftcelle (figur 2a-c).

Sammenhengen mellom de uttrykk for flotillin2 med erbB2

Vi analyserte den cellulære lokalisering av erbB2 og flotillins i SGC-7901 magekreftcelle. Vi kunne vise ved konfokalmikroskopi at flotillin2 delvis co-lokalisere med erbB2 på plasmamembranen (Figur 1a-e). Våre data viser at uttrykket av flotillin2 gjør har en signifikant sammenheng med at av erbB2 (p < 0,001) i immunhistokjemisk vev rekke analyse (tabell 1). I tillegg kunne samvirke mellom flotillins og erbB2 demonstreres ved immunoblot (figur 2d) og kvalitets RT-PCR eksperimenter (figur 2e), banket ned av endogene flotillin2 resulterte i trekking ned av erbB2. Vi neste analysert virkningen av flotillins på internalisering og påfølgende nedbrytning av erbB2. Som beskrevet nedenfor, erbB2 og HER2 har også mange relasjoner av clinicopathological faktorer til felles.

Sammenhengen mellom flotillin2 og clinicopathological faktorer

I denne studien, 282 magekreftpasienter med tilstrekkelig primære svulster materialer og følg -up gang var tilgjengelige, hvis vev ble samlet inn i løpet av de siste 6 årene. Tabell 2 ga beskrivende statistikk for parametere målt for disse pasientene. Median varighet av oppfølgingen var 54 måneder (variasjon 9-78 måneder). Den 5-årige total overlevelse (OS) rate var 48,2%

Vi fant at økt uttrykk av flotillin2 og erbB2 ble begge signifikant assosiert med histologisk type (p < 0,001, henholdsvis)., Lauren Karakter (p < 0,001, respektivt) og Lymphovascular invasjon (p = 0,059 og p < 0,001, tabell 2). I tillegg ble flotillin2 signifikant korrelert med tumorstørrelse (p = 0,006), T trinn (p = 0,001) og lymfeknutemetastase (p = 0,033, tabell 2). Imidlertid ble ikke observert noen signifikant korrelasjon mellom flotillin2 uttrykk og andre parametere inkludert alder, kjønn, sted, makroskopiske type og levermetastaser.

Uttrykk av flotillin2 i forhold til prognose

Ved hjelp av Cox proporsjonal farer regresjon modellen ble univariable forholdet mellom tumoregenskaper og pasientenes resultat oppnådd (tabell 3). Av de 282 pasientene som ble analysert, ble statistisk signifikante forskjeller i OS sett, med et dårlig resultat for pasienter med høyere farging av flotillin2 og erbB2. Andre prediktive faktorer som ble funnet å være korrelert med OS var alder (P = 0,042), størrelse (P = 0,001), makroskopiske type (p = 0,001), Pt (P < 0,001) og pN trinnet (P < 0,001) (tabell 3). Ved hjelp av log-rank test, var det signifikante forskjeller i OS mellom positive og negative pasienter med flotillin2 og erbB2 (P < 0.001, henholdsvis) i alle pasienter ble vist i figur 3.

Cox multivariate proporsjonal-hazard regresjonsmodell ble så brukt til å finne ut hvilke faktorer som var sammen predicative av OS. Variabler som ble antatt å være av betydning i univariat analyse ble inkludert i analysen. Betydningen justert for andre co-variates, ble gitt i Tabell 4. multivariat analyse av felles effekt av flotillin2 og erbB2 med andre prognostiske faktorer viste at PT (P < 0,001) og pN scenen (P < 0,001) flotillin2 (HR = 1,485, 95% KI:. 1,278 til 1,725, P < 0,001) var en bedre uavhengig prognostisk markør enn erbB2 (HR = 1,375, 95% KI: 1,133 til 1,947 P = 0,004) for OS (tabell 4)

diskusjon

vurderingen av biologiske prognostiske faktorer er av klinisk betydning, spesielt for en sykdom med dårlig utfall slik som magekreft. Denne studien bekreftet konstituerende uttrykk for flotillin2 i mage kreft vevsprøver og cellelinjer, fant vi også at flotillin2 var en selvstendig dårlig prognostisk faktor for total overlevelse av mage kreftpasienter. I tillegg er den foreliggende studien viste, for første gang, en positiv sammenheng mellom de uttrykk for flotillin2 og HER2 i magekreft. I forrige undersøkelse, Pust et al. (2012) fant at brystcancercellelinjer avledet fra fjernmetastaser viste en høyere grad av flotillin mRNA og protein uttrykk enn de som er avledet fra primære magekreft. Således, de forklarte rolle flotillin2 som en vevs- og scene-spesifikke tumor-modulator, hvor det virker som en inhibitor eller formidler av tumordannelse og progresjon avhengig av dets proteininteraksjonspartnere så som vekstfaktorreseptorer eller celleadhesjonsmolekyler [11] . Våre resultater er enig med denne beskrivelsen fordi flotillin2 uttrykk i denne studien var positivt korrelert med HER2 uttrykk, som var positivt korrelert med dårlig prognose i magekreft.

Data fra to nyere publikasjoner viser at flotillin har en funksjonell rolle i reseptor-tyrosin-kinase-signalering, spesielt i aktivering av MAP-kinase signalering og regulering av FGF-signalisering i HeLa-celler [16], [17]. I de SKBR3 brystkreftceller, slik at Akt fosforylering blir redusert ved uttømming av flotillin-2, men ikke etter flotillin-1 knockdown, var enig med våre data. Dermed kan reseptortyrosinkinaser eller reseptor-tyrosin-kinase-medierte signalveier reguleres ved flotillins på forskjellige måter og /eller i en celletype-spesifikk måte, er det mulig at de forskjellige signalveier som utløses av erbB2 reguleres ved enten flotillin2. Likevel, de reduserte ErbB2 nivåer utløst av flotillin2 knockdown støtte vår hypotese om en flotillin2-mediert stabilisering av erbB2.

ErbB2 er kjent for å være assosiert med dårlig prognose i magekreft, har flotillins blitt beskrevet å være assosiert med svulst genesis. Vi viste at flotillin2 co-lokaliserer med erbB2 på plasmamembranen og spiller en funksjonell rolle i reguleringen av erbB2 i magekreft. Høy ekspresjon av flotillin2 er assosiert med dårlig prognose og redusert overlevelse tid, og det fremstår som en potensiell prediktor for tilbakefall i magekreft. Det har blitt rapportert at østrogenreseptorer involvert i mage karsinogenese og flotillin2 interagerer med reseptorene [18], [19], noe som indikerer en betydelig innvirkning av flotillin2 funksjon på magekreftutvikling. På den annen side, på grunnlag av våre studier vev microarray, flotillin2 overekspresjon var sterkt assosiert med økt cellemigrering og ondartet transformasjon som fører til spredning til lymfeknuter og økt invasivitet. I vår studie, forhøyet flotillin2 og HER2 begge viste en signifikant korrelasjon med histologisk type (P < 0,001 begge), Lauren Karakter (P < 0,001 begge), mens flotillin2 får også en høy relevans med T scenen (P < 0,001) og lymfeknute metastase (P = 0,033). Den sterke korrelasjon tyder på at flotillin2 kan brukes som en biomarkør for å identifisere undergrupper av pasienter med magekreft med en mer aggressiv fenotype. Den multivariat analyse viste flotillin2 fungerer som en bedre prognostisk markør for å forutsi risikoen for metastasering og gjentakelse (HR = 1,485, 95% KI: 1,278 til 1,725) enn Her2 (HR = 1,375, 95% KI: 1,133 til 1,947) for OS. Vi foreslår at flotillin2 over-uttrykk kan bidra til økt spredning og utvikling av mage kreft.

I konklusjonen, er dette den første demonstrasjonen av en positiv korrelasjon mellom flotillin2 og ErbB2 nivåer i dyrkede magekreftceller samt i vev. Videre korrelerer flotillin2 uttrykk nivå med dårlig prognose i magekreft, noe som indikerer at flotillin2 kan være en prognostisk biomarkør for magekreft. Det er funnet at ErbB2-overuttrykkende tumorer er mer sannsynlig å være resistente mot behandling med et antistoff-basert (trastuzumab /Herceptin) terapi, som er blitt klinisk førstelinjebehandling hos pasienter med erbB2-overuttrykkende magekreft [20] , [21]. Men selv i kombinasjon med andre medikamenter chemotherapeutical, mer enn 20% av pasienter med erbB2-overekspresjon viser ingen respons på behandlingen. Dermed ved å målrette flotillin2 uttrykk, nye strategier i kreftbehandling kan utvikles.

• PLoS ONE: Multiple-til-flere relasjoner mellom microRNAs og målgener i Gastric Cancer
• PLoS ONE: sosiodemografiske og geografiske forhold i Esophageal og magekreft dødelighet i Sverige