PLoS ONE: Næringsstoffer Forskjellig Regulering Nucleobindin-2 /Nesfatin-en In Vitro i Cultured Mage Ghrelinoma (MGN3-1) celler og in vivo hos hannmus

Abstract

Nesfatin-en utskilles, måltid-responsive anorexigenic peptid kodet i forløperen nucleobindin-2 [NUCB2]. Sirkulasjons nesfatin-en øker etter måltidet, men kosten komponenter som modulerer NUCB2 /nesfatin-en er fortsatt ukjent. Vi antok at karbohydrat, fett og protein differensielt regulere vevsspesifikk ekspresjon av nesfatin-1. NUCB2, prohormone konvertaser og nesfatin-1 ble påvist i mus magen ghrelinoma [MGN3-1] celler. NUCB2 mRNA og protein ble også påvist i mus lever, og små og store tarmen. MGN3-1 celler ble behandlet med glukose, fettsyrer eller aminosyrer. Mann C57BL /6 mus ble kronisk matet høy fett, høy karbohydrat og høyt protein diett i 17 uker. Kvantitativ PCR og nesfatin-1-analyser ble anvendt for å bestemme nesfatin-1 på mRNA og proteinnivå. Glukose stimulert NUCB2 mRNA uttrykk i MGN3-1 celler. L-Tryptofan også økt NUCB2 mRNA uttrykk og ghrelin mRNA uttrykk, og nesfatin-en sekresjon. Oljesyre hemmet NUCB2 mRNA uttrykk, mens ghrelin mRNA ekspresjon og sekresjon ble forbedret. NUCB2 mRNA uttrykk var betydelig lavere i leveren hos mus matet en høy protein diett sammenlignet med mus som andre dietter. Kronisk inntak av høyt fettinnhold forårsaket en signifikant reduksjon i NUCB2 mRNA i magen, mens høyt proteininnhold og høyt fettinnhold forårsaket lignende undertrykkelse av NUCB2 mRNA i tykktarmen. Ingen forskjeller i serum nesfatin-1-nivåer ble funnet i mus ved 7 a.m, ved begynnelsen av den lette fasen. Høy karbohydrat diett matet mus viste signifikant forhøyet nesfatin-1-nivå på 13:00 Serum nesfatin-en var signifikant lavere hos mus matet høy fett, protein eller karbohydrater i forhold til kontrollene på 7 pm, like før den mørke fasen. Mus som fikk en bolus av høy fett hadde signifikant forhøyet nesfatin-1 /NUCB2 på alle tidspunkter testet post-sonde, sammenlignet med kontroll mus og mus som andre dietter. Våre resultater for første gang viser at nesfatin-en moduleres av næringsstoffer

Citation. Mohan H, Ramesh N, Mortazavi S, Le A, Iwakura H, Unniappan S (2014) Næringsstoffer Forskjellig Regulering Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 in Vitro
i Cultured magen Ghrelinoma (MGN3-1) Celler og in Vivo
hos hannmus. PLoS ONE 9 (12): e115102. doi: 10,1371 /journal.pone.0115102

Redaktør: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, USA

mottatt: 1 mai 2014; Godkjent: 18 november 2014; Publisert: 15.12.2014

Copyright: © 2014 Mohan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer

Finansiering: Denne forskningen er finansiert av en åpen driftstilskudd fra den kanadiske Insitutes av Health Research (CIHR; http:. //www.cihr-irsc. gc.ca/e/193.html) og et etableringstilskudd fra Saskatchewan Health Research Foundation (http://shrf.ca/). SU er en CIHR New etterforsker. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Finansiører har ingen rolle i forskningen eller manuskript forberedelse

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Nesfatin-en [NEFA /NUCB2 -kodet metthetsfølelse og fett påvirke protein-1] er et potent anorexigenic peptid implisert i regulering av energibalansen og glukosehomeostase [1], [30]. Det er et 82 aminosyrepeptid avledet fra forløper-protein, nucleobindin-2 (NUCB2) [1]. NUCB2 er sammensatt av 396 aminosyrer, som består av to EF-hånd motiver og et DNA-bindende domene [1], [3]. Post-translasjonell behandling av prohormone konvertaser (PC 1/3 og PC 2) fører NUCB2 å spaltes i tre peptider, nesfatin-1 (1-82 aminosyrer), nesfatin-2 (85-163 aminosyrer), og nesfatin- 3 (166-396 aminosyrer). NUCB2 /nesfatin-en aminosyre-sekvens er sterkt konservert på tvers av virveldyr [6], [7], [31]. NUCB2 /nesfatin-1 er funnet i forskjellige hypothalamus kjerner som er involvert i energimetabolismen, slik som bueformede kjernen, paraventrikulære kjerne, supraoptic kjernen, lateral hypothalamus område og zona increta [8], [9]. Insulinproduserende beta-celler ko-uttrykke nesfatin-1 i de pankreatiske øyer av rotter og mus [2], [4], [11], som tyder på at nesfatin-1 kan spille en viktig rolle i insulinsekresjon og glukose-homeostase [4], [29]. Ghrelin og NUCB /nesfatin-en er colocalized i mage oxyntic slimhinnekjertlene hos gnagere [13] og mennesker [16]. NUCB2 mRNA-ekspresjon i rensede gastrisk mucosal endokrine celler ble funnet å være høyere enn i hjernen hos rotter [13]. Den fulle lengde NUCB2 protein ble observert i tynn- og tykktarmen og leveren av hannrotter, og ICR-mus [5]. Den brede distribusjonen av NUCB2 /nesfatin-en i sentrale og perifere vev poeng til en rolle for nesfatin-en i å regulere stoffskiftet.

Daglig administrasjon av nesfatin-en forårsaket utvidet reduksjon i matinntaket og kroppsvekt [1] . Intracerebroventrikulær administrering av NUCB2 undertrykker matinntak, kroppsvekt og subkutan, mesenterisk og epididymal fettmasse i voksne rotter på en doseavhengig måte. I tillegg NUCB2 knockdown hos rotter ved infusjonen anti morfolino oligonukleotid (as-man) forårsaket en økning i appetitt og kroppsvekt [1]. Intra-paraventricular kjernen injeksjon av nesfatin-en reduserer kumulative matinntaket på 1 og 3 timer [9]. Intraperitoneale injeksjoner av nesfatin-1 resulterte i en reduksjon i matinntak hos leptin motstandsdyktig db /db-mus og
høyt fettinnhold tilføres mus [8]. Nesfatin-1 består av 3 strukturfragmenter og bare på midten av fragmentet (rester 24-53, M30) for nesfatin-1 er involvert i å produsere anorektiske responser [15], [28]. Sammen utgjør disse resultatene gir klare bevis som støtter satiety effekter av nesfatin-en.

Nesfatin-en er et måltid lydhør glucoregulatory hormon [12], [13], og bukspyttkjertelen holmer av rotter slipper NUCB2 i respons til glukose [14]. I studier på mennesker, glukose behandlet pasientene hadde høyere basal nesfatin-1-nivå sammenlignet med kontrollpersoner [10]. I MIN6-celler ble det observert en 4 ganger økning i nesfatin-1-nivåer når cellene ble inkubert i høy glukose (16,7 mM) i forhold til lav glukose (2,0 mM) [4]. Nesfatin-en forbedret glukosestimulert insulinsekresjon fra dyrkede MIN6 celler som ble inkubert i høy glukose enn i lav glukose på en doseavhengig måte [4]. I bukspyttkjertelen av streptozotocin (STZ) -injected mus med type 1 diabetes, ble det funnet at både NUCB2 og preproinsulin-mRNA-ekspresjon var signifikant lavere [4]. I kontrast, ble forbedret nesfatin-en samlokalisering med insulin funnet i holmen beta cellene i fettrik diett-indusert overvektige mus med type 2 diabetes. Nesfatin-1 har vevs spesifikke effekter på glukoseopptak i rotteadipocytter og muskel [30]. Samlet sett nesfatin-en utøver viktige roller i å regulere hele kroppen glukose og energi homeostase.

Mens nesfatin-en fremstår som et viktig måltid responsive peptid [1], [12], [13], [30] , hva som utløser sekresjon er fortsatt uklart. Hvilken diett komponenter utløse post-måltid sekresjon av nesfatin-en? Dette spørsmålet forblir uadressert. Hovedfokuset i denne studien er å finne ut hvordan ulike næringsstoffer kan modulere NUCB2 /nesfatin-1 in vitro
i helstøpt magen ghrelinoma (MGN3-1) celler fra mus og in vivo
i mannlig mus. Våre resultater fra våre in vitro
studier indikerer at MGN3-1 celler reagerer forskjellig på næringsstoffer i sekresjon NUCB2 /nesfatin-en og ghrelin. Tilsvarende gjør akutt eller kronisk inntak av næringsstoffer innflytelse NUCB2 mRNA uttrykk og NUCB2 /nesfatin-en utgivelse i en diett bestemt måte.

Materialer og metoder

Etikk erklæringen

All studier med dyr holdt den kanadiske Council of Animal Care retningslinjer, og ble godkjent av Animal forskningsetikk styret for University of Saskatchewan (Protocol Antall 2012-0033).

In vitro
studier

mus mage ghrelinoma (MGN3-1) celler [17] ble dyrket i DMEM (Invitrogen, Ontario, Canada; katalogw95-040) som ble supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Catalogue|84 ) og 1% penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml) (Invitrogen, Catalogue—40-122) ved 37 ° C i 10% CO _{2. Ved 80% konfluens, ble MGN3-1 cellene sådd ut på 6 x 10 ^{6 celler /brønn i en 12-brønns plate og studiene ble utført når cellene var 80-90% sammenflytende. Hver studie ble gjentatt tre ganger og data fra tre studier ble slått sammen for å oppnå et n = 9-12 brønner /behandling. For å bestemme hvorvidt glukose hadde en effekt på en dose- og tidsavhengig måte, ble cellene inkubert i 1 time og 2 timer med 5,6, 25, 50, og 100 mM glukose DMEM media. Den komplette vekstmedium av MGN3-1 celler krever at de skal være økende på et høyt glukosenivå som er 25 mM. I forhold til de studier med fettsyrer og aminosyrer, vi utført disse studier ved bruk av DMEM ved lave glukosenivåer (5,6 mM), siden bruk av en høy glukosemedium (25 mM) kan maskere virkningen av de respektive næringsstoffer på NUCB2 /nesfatin -1 sekresjon og syntese. Med hensyn til langkjedede fettsyrer, testet vi effekten av tre forskjellige fettsyrer ved hjelp av linolensyre (Sigma-Aldrich, Ontario, Canada; Produktet # L2376), oktansyre (Sigma-Aldrich; Produktet # C2875) og oleinsyre (Sigma -Aldrich; Produkt # O1383). Cellene ble inkubert i 4 timer med hver fettsyrer på 0, 1, 10, 100 uM. Vi brukte L-tryptofan (Sigma-Aldrich; Produktet # T8941) for å teste effekten av en aminosyre på NUCB2 sekresjon og syntese. Cellene ble inkubert i 4 timer med L-tryptofan ved 0,7, 1, 10 mM. L-tryptofan er til stede i kontrollmediet (5,6 mM glukose DMEM) ved en minimumsdose på 0,7 mm, noe som er vesentlig for deres vekst tilstand.}}

In vivo-studier

for den kroniske tilførsel av dietter inneholdende varierende mengder av spesifikke næringsstoffer, alder og vekt-matchet (5 uker gamle, gjennomsnittlig kroppsvekt: 20 gram) hann C57BL /6-mus (Charles River Laboratories, Quebec, Canada) ble huset individuelt for 17 uker i en 12 timer lys: 12 timer mørke-syklus (lysene av på 19:00 og på 7 am), temperatur og luftfuktighet kontrolleres vivarium. Mus ble delt inn i fire grupper matet med en kontroll (n = 6), høy karbohydrat (n = 7), høy protein (n = 7), og med høyt fettinnhold (n = 7) diett med ad libitum
adgang til vann og deres spesifikke diett. Alle dietter ble kjøpt fra Forsknings dietter (New Brunswick, NJ). Kaloriinnholdet i kosten var: kontroll (Produkt # D12451): 4.73 kcal /g med 20% energi fra protein, 35% energi fra karbohydrater og 45% energi fra fett; høy karbohydrat (Product # D12450J) hadde 3,8 kcal /g med 20% energi fra protein, 70% energi fra karbohydrater og 10% energi fra fett; høy protein (Product # D08091802) hadde 3,8 kcal /g med 60% energi fra protein, 30% energi fra karbohydrater og 10% energi fra fett, og høy fett (Product # D12492) hadde 5,2 kcal /g med 20% energi fra protein, 20% energi fra karbohydrater og 60% energi fra fett. Alle musene ble foret med kontrolldietten for en uke før start av deres spesifikke dietter. Matinntak, kroppsvekt, og blodsukkerverdier Post 4 timer fort ble målt en gang i uken i 17 uker

For akutt administrering av næringsstoffer, alder og vekt-matchet (5 uker gamle, gjennomsnittlig kroppsvekt.: 20 gram) mannlig C57BL /6 mus (Charles River Laboratories, St Constant, QU, Canada) ble plassert individuelt for 1 uke og 2 dager i en 12 timers lys: 12 timer mørke-syklus (lysene av på 19:00 og på 7 AM ), temperatur og luftfuktighet kontrolleres vivarium. Musene ble akklimatisert i en uke ved ankomst, og hadde ad libitum adgang til vann og vanlig mus chow i 11 dager. Siden vi utfører en akutt diett studie, vi trengte dyrene å akklimatisere til oralt inntak prosedyren. Vi akklimatisert musene til denne prosedyren ved gavaging dem med vann fra springen i 2 dager før den eksperimentelle dag. På 12 ^{th dag, ble musene fastet i 4 timer, og ble gavaged med en spesifikk væske diett. Musene ble delt inn i 4 grupper: Høy protein (Isopure Protein Drink, Zero Carb - Mango fersken smaken; naturens beste, Clifton Park, New York; n = 7), High fett (Splendido, kaldpressede Extra Virgin Olivenolje, Presidentens valg , Canada, n = 7), High karbohydrat (D-glukose, BioShop; Catlogue # GLU501.500; n = 7), og vann (vann fra springen; n = 7). På dagen av studien, ble 200 mikroliter av den ovennevnte næringsstoffer /vann administrert til musene ved oral sonde. Blodglukoseavlesninger ble tatt ved 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 og 120 minutter, og blod ble oppsamlet ved 15, 30, 60, og 120 minutter for ELISA analyse for å bestemme sirkulerende nivåer av NUCB2 /nesfatin -1. Vev (mage, tynntarm [tolvfingertarmen], tykktarm og lever) ble samlet inn fra hver mus ved avslutning av studien (dyp isofluran dødshjelp fulgt av cervical forvridning). For å opprettholde konsistens, timing og varigheten av hvert forsøk, operasjoner og prøvetaking ble holdt konstant for alle studier.}

Total RNA Utvinning og cDNA syntese

Celler eller vev ble samlet inn fra hver studie sammenligne NUCB2 mRNA uttrykk. Fra mus som gjennomgikk den kroniske diett studien, vev (mage, tynntarm, tykktarm og lever) ble høstet umiddelbart etter avliving. Totalt RNA ble ekstrahert fra MGN3-1 celler og vev, ved hjelp av TRIzol RNA isolering reagens (Invitrogen). RNA renhet ble validert av optisk tetthet (OD) absorpsjon ratio (OD 260 nm /OD 280 nm) ved hjelp av en Nanodrop 2000c (Thermo, Vantaa, Finland). Kun prøvene med en absorpsjons-forhold som er større enn 1,8 ble anvendt for cDNA-syntese. Syntese av cDNA ble utført med iScript cDNA syntese kit som anvist av produsenten (BioRad, Canada).

RT-PCR og kvantitativ Real Time PCR

RT-PCR og QRT-PCR for NUCB2, ghrelin, og RT-PCR for PC 1/3 og PC 2 ble gjennomført i henhold til reglene beskrevet i tabell 1, ved hjelp av CFX Connect real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). For QRT-PCR-analyse, ble mRNA uttrykk for NUCB2 normalisert ved hjelp av beta-aktin som husholdningsgenet. PCR-produkter for NUCB2 i magen, leveren og tykktarmen og disse genene (NUCB2, ghrelin, PC 1/3 PC og 2) i de MGN3-1 cellene ble underkastet elektroforese i 1% agarosegel for å bekrefte transkripsjoner forsterket. Basert på tidligere studier [4], anvendte vi beta-aktin som en intern kontroll for å normalisere signal av NUCB2 mRNA. Ved bruk av total RNA hvor mRNA kvantifisering var veldig presis, de kritiske grenseverdier for beta-aktin viste ingen variasjon. Relativ NUCB2 mRNA-ekspresjon ble normalisert med beta-aktin fra den samme prøven i henhold til Livak metoden [31].

immunocytokjemi og Mikros

MGN3-1 ble cellene dyrket i et kammer Labtek Slide System (Nalge Nunc International, Rochester, New York) og fikk lov til å vokse til nær konfluens. Celler ble vasket med 1 x fosfatbufferoppløsning (PBS; 2 x 5 minutter, 25 ° C) og fiksert i 4% paraformaldehyd (PFA) oppløsning i 1 x PBS i 10 minutter ved 25 ° C, fulgt av en annen vasking med 1 x PBS ( 3 x 5 minutter, 25 ° C). De fikserte celler ble permeabilisert i en oppløsning av 0,3% Triton-X (Bioshop, Burlington, Ontario, Canada) i 1 x PBS i 5 minutter ved romtemperatur. Platene ble inkubert i blokkeringsbuffer inneholdende 10% geiteserum i 1 x PBS i 1 time ved romtemperatur. Cellene ble så inkubert i primært antistoff (tabell 2) ved 4 ° C over natten. Lysbilder ble vasket med PBS (3 × 5 minutter, 25 ° C) og inkubert med sekundært antistoff (tabell 2, den PC1 /3 antistoff var en generøs gave fra Dr. Iris Lindberg, University of Maryland School of Medicine) i 4 timer ved romtemperatur. Til slutt ble objektglassene vasket med PBS (3 x 5 minutter, 25 ° C) og montert med Vectashield monteringsmedium inneholdende 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Canada).

Celler ble sett ved hjelp av et Nikon Eclipse-Ti invertert fluorescens mikroskop (Nikon, Mississauga, Ontario, Canada) og bildene ble tatt med et Nikon DS-Qi1 MC kamera (Nikon). Bilder ble analysert ved hjelp av NIS-Elements grunnforskning programvare (Nikon) på en Dell HP Workstation. Bilder vist er representative celler farget for ghrelin, NUCB2, PC 1/3 og PC2. For høy oppløsning, ble cellene sett, analysert og bilder tatt med en Leica TCS SP5 konfokalmikroskop.

Western Blot analyse, Immunohistochemistry og Fluorescensmikroskopi

For å bekrefte tilstedeværelse av nucleobindin-2 (NUCB2) i tarmen og leveren, tre, 3 måneder gamle C57BL /6 hannmus ble anvendt. Kort fortalt ble lever, og små og store tarmen samlet, og skilt for Western analyse eller immunhistokjemi. Vev for Western blot homogenisert i T-PER vev protein Ekstraksjonsreagens (Thermo Scientific,̑10) etterfulgt proteinkonsentrasjonen bestemmelse ved Bradford assay. Prøvene ble fremstilt i 1 x Laemmli-buffer inneholdende 0,2% 2-merkaptoetanol (Bio-Rad,¡-0737 og -0710) og deretter ble kokt ved 95 ° C i 5 minutter etterfulgt av vortex-blanding. Hele prøvevolumet (20 ul) hver inneholdende 50 ug protein eller syntetisk rotte nesfatin-1 (ABGENT, 1 ug /ul, som tidligere ble brukt i 4, 29) ble applisert på en gel, og drives i en Mini-Protean TGX 8-16 % gradient gel (Bio-Rad,Lj-1104). Etter separering ble proteinene overført til et 0,2 um Biotrace nitrocellulosemembran (Pall Life Sciences,đ77-000) og deretter membranen ble blokkert i 1 x RapidBlock oppløsning (AMRESCO, # M325). NUCB2 protein deteksjon ble utført ved hjelp av kanin anti-nesfatin-en (Katalognummer H-003-22, 1:500 fortynning, Phoenix Pharmaceuticals, California) og GAPDH protein ble detektert ved bruk av kaninantiserum rettet mot mus GAPDH (AbDSerotec, # AHP1628 ) fortynnet 1:1000. Som sekundært antistoff, geite-anti-kanin-IgG (H + L) HRP-konjugat (Bio-Rad,ª-6515) fortynnet 1:3000 ble anvendt. For protein visualisering membranen ble inkubert i 5 min i Clarity Western ECL substrat (Bio-Rad,ª-5061) og avbildes med ChemiDoc MP bildesystem (Bio-Rad,ª-8280) med chemiluminescence deteksjon. Membran stripping i mellom protein deteksjon ble utført ved bruk av Restore Plus western blot stripping buffer (Thermo Scientific,ǐ30). Precision pluss protein to xtra standarder (Bio-Rad,¡-0377) ble benyttet som molekylvekt markører.

For immunhistokjemiske studier vev innsamlede ble fiksert i 4% formaldehyd i 24 timer ved 4 ° C. Fikseringsmiddel ble erstattet med etanol (tre 70% etanol), hver etterfulgt av en 10 minutters inkubasjon ved 4 ° C. Vev ble deretter lagret i 70% etanol ved 4 ° C og ble behandlet og seksjonert på Prairie Diagnostic Services Inc. (PDS Inc., Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan). Parafinsnitt av 4 mikrometer tykkelse ble forberedt for farging. Disse snitt ble deparaffinized med xylen (inkubert to ganger i 100% xylen; 5 minutter, 25 ° C) og rehydrert i en gradert etanolserie (inkubert to ganger i 100% etanol, og en gang i hver 95% etanol, 70% etanol, 50% etanol; 2 minutter hver, 25 ° C). Snittene ble deretter inkubert med 3% hydrogenperoksyd i destillert vann for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet (30 minutter ved værelsestemperatur). Seksjonene ble deretter blokkert med serumfritt protein blokk-reagens (DAKO Corporation, California) i 10 minutter før den ble inkubert med primære antistoffer. Disse delene ble deretter inkubert med kanin anti-nesfatin-1 (Katalognummer H-003-22; 1:500 fortynning, Phoenix Pharmaceuticals, California) i 24 timer ved romtemperatur. Alle Objektglassene ble deretter vasket tre ganger med 1 x PBS og inkubert med geite-anti-kanin-Texas Rødt-IgG (Red-Nesfatin-1; Katalognummer TI-1000, 1:100 fortynning, Vector Laboratories, California) sekundært antistoff i 1 time ved værelses temperatur. Alle grunnskoler og videregående antistoffer ble fortynnet i antistoffdiluent reagent (DakoCytomation, Mississauga, Ontario). Objektglassene ble vasket tre ganger med 1 x PBS og syv ganger med destillert vann. Til slutt, ble platene montert med Vectashield medium som inneholder atom fargestoff DAPI (blå, Vector Laboratories, Burlingame, California). Snittene ble sett under et Nikon Eclipse Ti-E invertert fluorescens mikroskop (Nikon Canada, Mississauga, Canada). Bilder ble tatt med et Nikon DS-QI1 MC avkjølte monokrom kamera koblet til en Dell HP Work datamaskin og NIS elementer grunnforskning bildebehandlings (Nikon Canada, Mississauga, Canada). Bare representative bilder av små og store tarmen flekker for NUCB2 /nesfatin-en med DAPI vises i resultatene delen.

Nesfatin-1 /NUCB2 i serum og Media

For å undersøke næringsavhengige endringer i NUCB2 /nesfatin-en sekresjon fra MGN3-1 celler, media ble samlet etter bestemte ruge perioder. For å forebygge celleavfall ble prøvene sentrifugert (13 000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C) og toppen 700 ul ble lagret ved -20 ° C inntil nesfatin-en måling. For måling av sirkulerende NUCB2 /nesfatin-1, blod ble oppsamlet ved 7 a.m (like etter den lette fasen starter), 13:00 (i midten av den lette fase) og ved 7 p.m (før begynnelsen av den mørke fase). Blodprøver ble tillatt å levre seg på is, og serum ble separert ved sentrifugering (7000 opm i 9 min ved 4 ° C) og lagret ved -20 ° C, inntil analyser ble utført. NUCB2 /Nesfatin-en sekresjon nivåer i mediene ble målt ved hjelp av Nesfatin-1 (1-82) (Rat) ELISA kit (Katalognummer EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., California). Grensen for analysesensitivitet var 1,2 ng /ml for nesfatin-1, med detekterbare rekkevidde 0,1 til 1000 ng /ml. Mengden av immunoreaktivt materiale ble bestemt ved å bruke en ikke-lineær regresjon kurvetilpasning, som ble brukt til å kvantifisere og sammenligne konsentrasjonen av NUCB2 /nesfatin-1 sekresjon i serum og mediaprøver.

NUCB2 /Nesfatin- 1 i serum og media og Total ghrelin nivåer i media

For å undersøke næringsavhengige endringer i NUCB2 /nesfatin-en og total ghrelin sekresjon fra MGN3-1 celler, media ble samlet etter bestemte ruge perioder. For å forebygge celleavfall ble prøvene sentrifugert (13 000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C) og toppen 700 ul ble lagret ved -20 ° C inntil NUCB2 /Nesfatin-1 og total ghrelin måling. Blodprøver ble tillatt å levre seg på is, og serum ble separert ved sentrifugering (7000 opm i 9 min ved 4 ° C) og lagret ved -20 ° C, inntil analyser ble utført. NUCB2 /Nesfatin-1 sekresjon nivåer i serum og media ble målt ved hjelp av Nesfatin-1 (1-82) (Rat) ELISA kit (Katalognummer EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., California). Grensen for analysesensitivitet var 1,2 ng /ml for nesfatin-1, med detekterbare rekkevidde 0,1 til 1000 ng /ml. Tilsvarende ble de totale ghrelin sekresjon nivåer i media målt ved hjelp av ghrelin (rotte, mus) EIA kit (Katalognummer EK-031-31, Phoenix Pharmaceuticals Inc, California). Grensen for analysesensitivitet var 1,16 ng /ml for total ghrelin, med detekterbar område fra 0-100 ng /ml. Mengden av immunoreaktivt materiale ble bestemt ved å bruke en ikke-lineær regresjon kurvetilpasning, som ble brukt til å kvantifisere og sammenligne konsentrasjonen av NUCB2 /nesfatin-1 sekresjon i serum og mediaprøver.

Statistical Analysis

Analyser av kvantifiserte QRT-PCR og ELISA data ble utført ved bruk av One-Way ANOVA etterfulgt av Tukey multippel sammenligningstest. GraphPad Prism versjon 5 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, CA, USA) ble brukt for statistiske analyser og grafer. Betydning ble tildelt da p < 0,05. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM.

Resultater

NUCB2, PC 1/3 og PC-2 mRNA uttrykkes i MGN3-1 celler og NUCB2 mRNA uttrykkes i magen, leveren, liten tarmen og tykktarmen av hannmus

Vi identifiserte uttrykk for NUCB2 (202 bp), prohormone konvertase 1/3 (400 bp), og prohormone konvertase 2 (406 bp) mRNA i MGN3-1 celler (fig. 1A). NUCB2 (202 bp) mRNA-ekspresjon ble også påvist i magen, leveren, tynntarmen og tykktarmen hos hann C57 /BL6 mus (Fig. 1B). Absolutte nivåer av NUCB2 mRNA-ekspresjon i magen var høyere enn NUCB2 mRNA-ekspresjon i leveren, tynntarmen og tykktarmen (fig. 1C).

MGN3-1 celler er immunopositive for ghrelin, NUCB2 /Nesfatin-1 , PC 1/3 og PC 2

Fluorescensmikroskopi vises MGN3-1 celler farget med anti-nesfatin-1 antistoff (Texas-Red fig. 2B) og anti-ghrelin antistoff (FITC-grønne; fig. 2A) viste klart samlokalisering (gul, fig. 2C) av nesfatin-en og ghrelin immunoreaktivitets. Men noen ghrelin-positive celler var ikke immunreaktive for nesfatin-1 (Fig. 2C). MGN3-1 celler viste PC 1/3 immunoreaktivitets (Texas Red Fig. 2D) og PC 2 immunoreaktivitets (Texas Red, Fig 2E.). DAPI (blå) farget kjernen i alle celler, inkludert de cellene ikke positive for proteinene studert. Slides farget med sekundært antistoff alene (Fig. 2F) hadde ingen immunoreaktivitets. Confocal avbildning viste MGN3-1 celler farget med anti-nesfatin-1 antistoff (Texas-Red, fig 3A.) Og anti-ghrelin antistoff (FITC-grønne; Fig. 3B) viste klart samlokalisering (gul, Fig. 3C) av nesfatin-en og ghrelin immunoreaktivitets. Negativ kontroll er farget med bare sekundære antistoffer alene (Fig. 3D).

NUCB2 protein uttrykk i tykktarmen, tynntarmen og leveren fra hannmus

NUCB2 protein er uttrykt i tykktarmen, tynntarm og lever fra hannmus som viser tydelig band for NUCB2 tilsvarende ca 50 kDa. Rotte nesfatin-1-peptid anvendt som en positiv kontroll er vist som et distinkt bånd som tilsvarer omtrent 10 kDa (figur 4A;. Venstre bildet). Men ingen band som viser ferdigbehandlet nesfatin-en var synlige på 10 kDa i vevsprøver (fig 4A. Venstre bildet). Vi har også funnet bånd på omtrent 47 kDa på undersiden av 50 kDa-båndet i tynntarmen og leveren, men ikke i tykktarmen (figur 4A;. Venstre bildet). En distinkt band for GAPDH brukt som kontroll vaktmester-genet er observert ved 37 kDa vist i alle vev (figur 4A;. Høyre bilde). NUCB2 /nesfatin-en immunoreaktivitets er funnet i slimhinnecellene tynntarmen (figur 4B,. Venstre bilde) og tykktarmen (figur 4B,. Høyre bilde).

Effekter av glukose og L-Tryptofan på NUCB2 mRNA uttrykk i, og NUCB2 /nesfatin-en sekresjon fra MGN3-1 celler

celler inkubert på 100 mM glukose DMEM hadde en høyere NUCB2 mRNA uttrykk enn celler inkubert på 5,6, 25 og 50 mm DMEM glukosekonsentrasjoner på en time etter inkubasjon (fig. 5A). 2 timer etter inkubasjon celler inkubert ved 100 mM DMEM var signifikant høyere i NUCB2 mRNA ekspresjon enn celler inkubert ved 5,6 og 50 mM glukose DMEM (fig. 5C). På en time (fig. 5B) og 2 timer (fig. 5D), var det ingen signifikante forskjeller i NUCB2 /nesfatin-en sekresjon. NUCB2 mRNA-ekspresjon var signifikant høyere i celler inkubert ved 10 mM L-tryptofan (fig. 5E) i forhold til celler inkubert ved 0,07 og 1,0 mM L-tryptofan. NUCB2 /nesfatin-1-sekresjon fra celler inkubert ved 1,0 og 10,0 mM L-tryptofan var betydelig høyere enn celler inkubert ved 0,7 mM L-tryptofan (fig. 5F).

Effekt av linolensyre, oktansyre og oljesyre syre på NUCB2 mRNA-ekspresjon i, og NUCB2 /nesfatin-1-sekresjon fra cellene MGN3-1

Vi fant NUCB2 mRNA-ekspresjon betydelig redusert i celler behandlet med 1, 10 og 100 uM oleinsyre (fig. 6E) i forhold til kontrollen. Ingen endringer ble observert i NUCB2 mRNA i celler behandlet med linolensyre (fig. 6A) og oktansyre (Fig. 6C). Videre NUCB2 /nesfatin-1 sekresjon var uforandret i celler behandlet med forskjellige doser av linolensyre (fig. 6B), oktansyre (fig. 6D), og oleinsyre (fig. 6F).

Effekt av L-tryptofan, linolensyre, oktansyre og oljesyre uavhengig på ghrelin mRNA uttrykk i, og total ghrelin sekresjon fra MGN3-1 celler

Ingen endringer i ghrelin mRNA (S1A figur) og total ghrelin sekresjon (S1B figur ) ble funnet når cellene ble behandlet med forskjellige doser av glukose stolpe 1 time inkubasjon. Ghrelin mRNA-ekspresjon var signifikant høyere i celler inkubert ved 1 mM L-tryptofan (Fig. 7A) i forhold til celler inkubert ved 0,07 og 10 mM L-tryptofan. Ingen signifikant forskjell i total ghrelin sekresjon fra celler behandlet med forskjellige doser av L-tryptofan (fig. 7B). Vi fant ingen forandring i ghrelin mRNA-ekspresjon (Fig. 7C), men total ghrelin sekresjon var høyt fra celler inkubert ved 100 uM linolensyre (fig. 7D) i forhold til kontroll, 1 og 10 uM doser. Ingen endringer i ghrelin-mRNA (fig. 7E) og total ghrelin sekresjon (fig. 7F) ble funnet når cellene ble behandlet med forskjellige doser av oktansyre. I mellomtiden ghrelin-mRNA (fig. 7H), og total ghrelin sekresjon (fig. 7I) var signifikant høyere i celler behandlet med 100 uM oljesyre, sammenlignet med kontrollen, og en 10 uM oljesyre.

Kronisk effektene av næringsstoffer på NUCB2 mRNA uttrykk og serum NUCB2 /nesfatin-1 i mus

kroppsvekt, matinntak og blodsukkerprofil mus fôret på ulike dietter er vist i S2 figur. Mus matet på en høy fett diett hadde betydelig lav uttrykk for NUCB2 mRNA i magen i forhold til de fôres på en kontroll, høy protein eller høy karbohydrat dietter (fig. 8A). Det var ingen signifikant forskjell i ekspresjonen av mRNA NUCB2 i tynntarmen mellom mus foret med en kontroll, høy protein, karbohydrat med høy eller høy-fett diett (fig. 8B). Mus foret på høy protein og høy fett dietter har relativt lav uttrykk for NUCB2 mRNA i tykktarmen enn mus som fikk mat på (Fig. 8C) kontroll eller høy karbohydrat dietter. Mus matet på en høy protein diett hadde en betydelig lav uttrykk for NUCB2 mRNA i leveren enn mus som fikk mat på de andre dietter (Fig. 8D). På 7 a.m, var det ingen forskjeller i serum nesfatin-1 /NUCB2 nivåer i mus matet forskjellige dietter (Fig. 9A). På en pm, høy karbohydrat diett matet mus hadde betydelig høyere serum nesfatin-1 /NUCB2 i omløp (Fig. 9B). Serum nesfatin-1 /NUCB2 var betydelig lavere i mus matet høy karbohydrat, høy protein eller høy fett, sammenlignet med kontroll diett matet mus ved 19:00 (Fig. 9C).

Akutte effekter av næringsstoffer på NUCB2 mRNA uttrykk , blodsukker og serum NUCB2 /nesfatin-1 i mus

det var ingen signifikante endringer i uttrykket av NUCB2 mRNA i magen (fig. 10A), tynntarm (fig. 10B), tykktarmen (fig . 10C) og lever (fig. 10D) mellom mus matet på en høy protein, høy karbohydrat, høy fett eller vann.

• PLoS ONE: Hva slags Capsule endoskop er egnet for en Controllable selvgående Capsule endoskop? Experimental Study Ved hjelp av en svinekjøtt magen modell for klinisk Application (med videoer)
• PLoS ONE: Mage Temperatur Records Avslør Nursing Atferd og overgang til Solid matforbruket i en Unweaned Mammal, Harbour Seal Pup (Phoca vitulina)