PLOS ONE: Expressão Condicional de Wnt9b em Células SIX2-positivos Disrupts estômago e rim Function

Abstract

Durante o desenvolvimento do rim, a sinalização Wnt canônica ativa diferenciação, enquanto o fator de transcrição SIX2 mantém a piscina progenitor. Estes sinais opostos para ajudar a regular a formação de nefrónios e assegurar o complemento total de nefrónios são formados. Uma vez que estes dois factores controlar diferentes destinos no mesênquima renal, a hipótese de que a sobre-expressão de Wnt9b
em SIX2
-expressing células iria perturbar a formação dos rins e pode alterar as decisões de diferenciação celular em outros tecidos. Nós criamos um rato transgénico que condicionalmente expressa o ligante Wnt canônica no rim em desenvolvimento, Wnt9b
. O transgene é ativado por recombinase cre e expressa GFP. Nós testado pela primeira vez a sua actividade biológica usando Hoxb7-cre
e descobriu que transgénico Wnt9b foi capaz de induzir genes de diferenciação e de resgatar o desenvolvimento renal em Wnt9b ^{- /-
camundongos homozigotos deficientes. Em contraste, a expressão de Wnt9b
em células usando SIX2-cre
causado desconforto gastrointestinal e insuficiência renal grave em ratos adultos. rins transgênicos teve numerosos túbulos cística e valores de creatinina elevada (0,652 ± 0,044) em comparação com camundongos selvagens (0,119 ± 0,002). Estes animais também apresentaram um esfíncter malformado do piloro, refluxo duodeno, e uma transformação do estômago distal para proximal destino. As alterações de expressão de genes observados para o Wnt9b: EGFP
transgene foram comparados com um alelo β-catenina estabilizado para determinar que Wnt9b está a activar a via Wnt canónica nos tecidos analisados. Estes resultados demonstram que a expressão de Wnt9b
em SIX2
células -positivas perturba decisões destino celular no rim e do trato gastrointestinal}

Citation:. Kiefer SM, Robbins L, Rauchman M (2012) expressão condicional de Wnt9b em SIX2
Cells -positivo Disrupts estômago e função renal. PLoS ONE 7 (8): e43098. doi: 10.1371 /journal.pone.0043098

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 29 de fevereiro de 2012; Aceito: 17 de julho de 2012; Publicado: 17 Agosto, 2012 |

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health subvenção R01 DK067222 (http://nih.gov/) e da American Heart Association Fundada 0840117N Investigator (http://www.heart.org) para MR. SK foi apoiado por uma concessão de Saint Louis Fundo de Investigação Presidencial University (www.slu.edu). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A via de sinalização Wnt canónica é um regulador chave do destino celular, proliferação celular, e a adesão de células durante o desenvolvimento e durante a vida adulta. Numerosos mediadores positivos e negativos foram identificados que trabalham em conjunto para alcançar a regulação apertada da sinalização β-catenina. O paradigma central é que citoplasmática β-catenina é sequestrado em um complexo de destruição, fosforilado por GSK3β, e orientados para a via da ubiquitina destruição na ausência de um sinal de Wnt. inibe a fosforilação de Wnt ligação e destruição de β-catenina, permitindo-se translocar para o núcleo para afectar a expressão do gene alvo com factores TCF /LEF (revisto por MacDonald et ai. [1]). modelos numerosos rato foram criados para estudar esta via, incluindo tanto ganho e perda de alelos de função de Wnts, receptores Wnt, β-catenina, e os TCF /LEF transcrição reguladores. Estes modelos têm descoberto papéis essenciais para a sinalização canônica Wnt no osso, cabelo, intestino, sangue e câncer [2]. Um tema que emerge desses estudos é que muitos processos biológicos são extremamente sensíveis à força da sinalização Wnt canônico.

Esta regulação apertada da sinalização Wnt canônico é essencial para o desenvolvimento do rim. Durante as fases iniciais da formação do rim, Wnt9b é segregada a partir do botão uretérico e sinais para células progenitoras no mesênquima tampa para induzir a diferenciação nefrónio. O tratamento com cloreto de lítio ou activação de β-catenina pode induzir a diferenciação nefrónio na ausência do botão uretérico e Wnt9b, o que sugere que um aumento de sinalização de Wnt canónica é suficiente para este evento indutivo [3], [4]. Algumas células mesenquimais proliferar tampão para manter as células progenitoras que são necessários para iterações subsequentes do presente processo [5]. Este equilíbrio entre a manutenção progenitor e da indução da diferenciação é de suma importância para garantir que o rim constitui o complemento total de néfrons [5], [6], [7], [8], [9].

Vários factores expressos no mesênquima tampão têm sido mostrados para antagonizar a diferenciação de Wnt-estimuladas incluindo o factor de transcrição SIX2
. Supressão de SIX2
resulta em diferenciação ectópica, o esgotamento dos progenitores cap mesenquimáticas e agenesia renal [9]. Embora o mecanismo exacto ainda não é conhecido, uma hipótese tem sido proposta pelo qual níveis elevados de sinalização Wnt canónica conduzir o compromisso com a diferenciação enquanto que a actividade elevada SIX2 nas mesmas células mantém o destino progenitoras [7]. Nós criamos um novo modelo de rato para sobre-expressar condicionalmente Wnt9b para ativar a via de sinalização Wnt canônica. Temos utilizado este modelo para testar se o aumento da atividade Wnt9b é suficiente para perturbar o equilíbrio entre progenitores e diferenciação no mesênquima tampa.

Um segundo local onde tanto a atividade SIX2 e sinalização Wnt desempenhar um papel importante é o esfíncter pilórico . O esfíncter pilórico é formada na extremidade distai do estômago e funciona como uma válvula para permitir a digestão dos alimentos antes da sua entrada no duodeno. A disfunção do esfíncter pode resultar em refluxo do conteúdo duodenal para o estômago que levanta um risco aumentado de cancro gástrico e metaplasia [10], [11]. Esta região é também o local de anomalias congênitas, incluindo a doença de refluxo duodeno primária rara e estenose do piloro defeito mais comum nascimento [12]. deficiência SIX2
leva a agenesia do esfíncter pilórico e antagonizar a atividade de Wnt com Sfrp1 e Sfrp2 é necessário para o padrão do estômago [13], [14]. Isto levou-nos a supor que a actividade de Wnt canónica deve ser estreitamente regulada no piloro semelhante ao que tem sido proposto no rim. Para testar isso temos usado SIX2
-cre para ativar o Wnt9b
transgene no SIX2
expressando domínios nos rins e no estômago.

O condicional Wnt9b
alelo transgénico aqui relatado expressa Wnt9b Comprar e GFP quando ativado por recombinase cre. É biologicamente activa e capaz de resgatar a formação de rim em Wnt9b ^{- /-
embriões. Superexpressão de Wnt9b
no broto ureteral rim é capaz de induzir genes associados à diferenciação de cap mesênquima, mas não sofre mesenquimais-to-epitelial de transição (MET) para produzir estruturas vesiculares morfologicamente distintas. Wnt9b
activação transgene no SIX2
células -positivas provoca cistos nos rins e uma transformação das regiões do estômago distal para proximal destino estômago. Comparação de Wnt9b
transgénicos para um alelo que produz proteína estabilizadas β-catenina demonstra alterações genéticas dose-reactivos e sugere que estas estirpes representam uma série de alelos que deve ser valioso para modular a sinalização de Wnt canónica em outros tecidos.}

Resultados

Os ratinhos transgénicos expressam Wnt9b quando ativado por recombinase cre

O transgene Wnt9b foi construído com uma cassete LOX-STOP [15] para criar uma Wnt9b condicionalmente ativo que depende cre recombinase de expressão (Fig. 1A). Uma vez activado, o Wnt9b expressa transgene é distinguível de Wnt9b endógena, pois contém uma etiqueta de epitopo de hemaglutinina da gripe C-terminal e células transgénicas exibirão GFP fluorescência devido à cassete IRES-EGFP. Para testar a fidelidade do transgene, examinámos a expressão CRE-dependente em células em cultura e in vivo em embriões (Fig. 1B). Marcadas com epítopo Wnt9b era detectável em lisados ​​de células co-transfectadas com o transgene e um plasmídeo CRE, e não em transfecções de sozinho o transgene. Da mesma forma, lisados ​​a partir de embriões que foram positivos para ambos Wnt9b e β-actina-cre transgenes continha Wnt9b-FLU enquanto individuais transgênicos Wnt9b não o fez. fluorescência da GFP foi observada em embriões Wnt9b duplamente positivas /β-actina por CRE e não em Wnt9b da mesma ninhada (Fig. 1C-F). O nível de Wnt9b transgênica expressão correlacionada com a intensidade da fluorescência da GFP para cada linha fundador. (Fig. 1D). Quatro linhas fundadoras independentes foram incapazes de produzir ao vivo β-actina-cre ^{tg /+, Wnt9b tg /+ duplas filhotes heterozigotos, demonstrando que a expressão Wnt9b elevada onipresente é embrionário letal. Análise dos estágios embrionários revelaram que β-actina-cre tg /+, Wnt9b tg /+ duplas embriões heterozigotos foram detectados a menos do que o esperado frequências mendeliana em E11-E12. Um único embrião heterozigótica dupla foi observada a partir de um dos fundadores com muito elevado de expressão (Fig. 1A, n = 23, a frequência esperada de 25%) e 16% foram observados a partir de um dos fundadores diferente (n = 25). Wnt9b /ß-actina-Cre duplas embriões transgênicos tinham corações menores, com acúmulo de sangue, sugerindo insuficiência cardíaca como causa da morte.}

Transgênicos Wnt9b é biologicamente ativa

Para determinar se transgênica Wnt9b é biologicamente ativa, testamos se era capaz de substituir o tipo selvagem Wnt9b
durante o desenvolvimento renal. Wnt9b <sup>- /-
embriões apresentam alta penetrância fenda palatina e fenótipos agenesia renal (Fig. 2). Ativação de Wnt9b transgênica no broto ureteral com Hoxb7
-cre resgatado formação de rim, mas não palato fechamento na E14.5 em todos Hoxb7
-cre tg /+, Wnt9b
- /-, Wnt
9b tg /+ embriões (n = 7). Esse resgate específica de rim confirma que a expressão transgénica Wnt9b é dependente da ativação cre, pois o paladar não expressa Hoxb7
-cre. PCR quantitativa de tipo selvagem, Wnt9b - /- Comprar e Wnt9b - /-
, Wnt9b tg /+ rins transgênicos revelou que transgênico Wnt9b
foi expresso em níveis 2.3- vezes mais elevados do que o gene do tipo selvagem, enquanto que a expressão de Ret
foi inalterada (Fig. 2 G-I). A capacidade de Wnt9b transgênica para sinalizar ao mesênquima para substituir o tipo selvagem Wnt9b
atividade confirma que é biologicamente activos in vivo.</sup>

A riqueza de dados mostrou que Wnt9b e β-catenina sinalização são sinais indutores críticos que iniciam a diferenciação da tampa mesênquima em vesículas renais epitelizadas [4], [8], [16]. Wnt9b produzido no botão uretérico activa a via de sinalização Wnt canónica no mesênquima adjacente e resulta na expressão de genes que regulam mesenquimais a transição epitelial (MET). Portanto, nós testamos se superexpressão de Wnt9b
no broto ureteral seria um sinal para o mesênquima para activar a expressão do gene MET e promover um maior indução de néfrons. Wnt9b
foi overexpressed no broto ureteral usando Hoxb7
-cre: EGFP. embriões E12.5 foram genotipados por análise quantitativa PCR para determinar se eles foram hemizygous ou homozigotos para o Wnt9b
transgene e os rins foram coletados para análise da expressão gênica. Detectamos um aumento dependente da dose no Wnt9b
que foi acompanhada por uma activação proporcional da expressão dos genes alvo Wnt9b, Wnt4
, PAX8
, e Fgf8
em três piscinas independentes de rins transgênicos (Fig. 2J). SIX2
é expressa em indiferenciado (cap) mesênquima e é regulada negativamente como a diferenciação das vesículas se segue [17]. SIX2
expressão de mRNA não é afetado em Hoxb7
-cre, Wnt9b
transgênicos duplas. Da mesma forma, os genes ureteral bud, Ret
e Wnt11
, não são significativamente alterada pela superexpressão de Wnt9b
. A sobre-regulação de genes específicos do mesênquima confirma que Wnt9b transgénico é capaz de sinalizar a partir do botão uretérico para induzir genes importantes para TEM, no entanto, nenhuma evidência histológica de vesículas renais epitelializado ectópicas foi evidente (dados não mostrados). Isto sugere que a sobre-regulação de Wnt9b
no botão uretérico é suficiente para a activação de genes no mesênquima, mas não para a diferenciação morfológica das vesículas renais.

misexpression de Wnt9b perturba a função renal e formação esfíncter pilórico ativando canônica β-catenina sinalização

o paradigma emergente no rim é que há um equilíbrio delicado entre progenitor auto-renovação e ativação de diferenciação [6], [7], [9]. A via /β-catenina Wnt9b é necessário para a diferenciação e suprime SIX2 diferenciação no passo inicial de compromisso. Portanto, a hipótese de que a capacidade de promover a SIX2 decisões fate oposto daqueles activados pela actividade elevada β-catenina pode ser um tema comum em desenvolvimento. Testamos essa possibilidade pela ativação de transgênicos Wnt9b
com SIX2
-cre. Os transgênicos duplas expressar Wnt9b
nas mesmas células que expressam SIX2 Comprar e poderia interromper processos que estão coordenadamente regulados no rim e outros tecidos. SIX2-cre ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
ratos exibiram perigo no desmame e medições de peso corporal foram reduzidas em 39% em quatro semanas (14,5 ± 3,4 gramas, p < 0,001) em comparação com cre-negativos Wnt9b tg /+
ninhada (23,6 ± 0,7 gramas). análise fenotípica revelou que esta redução no peso corporal foi devido a malformações no sistema gastrointestinal e os rins, dois locais de SIX2
-cre expressão (Fig. 3).}

Vários cistos de diferentes tamanhos eram visíveis no córtex e na medula dos rins heterozigotos duplos (Fig. 4, n = 11/11). Os cistos foram localizados predominantemente no córtex e medula externa e eram de origem túbulo proximal como demonstrado por LTL-coloração. A doença cística foi primeiro evidentes logo após o nascimento (P7-10) nos segmentos proximais do nefrónio (dados não mostrados). Estes animais heterozigotos duplos apresentaram níveis elevados de creatinina sérica em (0,652 ± 0,044, p < 0,005) em comparação com o controle littermates (0,119 ± 0,002) tão cedo quanto ~ 3 semanas de idade, indicando insuficiência renal grave. animais mais velhos com doença avançada também continha cistos derivados de segmentos mais distais, incluindo a alça de Henle (Tamm-Horsfall-positivo). Em todos os animais com insuficiência renal avançada examinados, observamos muitos cistos derivados do ducto coletor que expressavam Aquaporin 2 ou ligados D. Biflorus
-lectin. Desde SIX2
-cre não é expressa na conduta de recolha, esta dilatação é provavelmente secundária à dilatação em segmentos mais proximais. A presença de cistos renais em Wnt9b
animais transgênicos reforça a conclusão de que a ruptura do sistema de sinalização Wnt causa a doença cística [7], [18], [19].

Apesar de cistos nos rins eram não está presente até depois do nascimento, a regulação positiva de sinalização Wnt canônica era aparente na E12.5 quando SIX2
-cre é inicialmente expressa. a expressão da proteína foi aumentada em LEF1 agregados pré-tubulares e estruturas renais vesículas nas transgénicos duplos e foi ainda aumentado em numerosas vesículas formadas ectópica em rins estabilizadas p-catenina (n = 3, Fig. 5). O aumento da dose de resposta na expressão LEF1 suporta dados que Wnt9b está agindo embora o Wnt canônica via de sinalização no rim em desenvolvimento [7] publicado. A falta de estruturas vesiculares ectópicas no Wnt9b
transgênicos sugere que o Wnt9b
alelo apresenta um efeito moderado sobre a sinalização β-catenina quando comparado ao alelo β-catenina estabilizado.

O segundo fenótipo contribuindo para a redução do peso corporal em SIX2-cre ^{tg /+
, Wnt9b desconforto gástrico tg /+
heterozigotos casal foi. fluido amniótico amarelo foi observada no estômago de transgénicos duplos e não transgénicos da mesma ninhada, em individuais (n = 6, Fig. 6). Isto indicou que o refluxo duodenogástrico estava a ocorrer e pode ser devido a formação anormal esfíncter pilórico. O esfíncter entre o estômago eo duodeno foi alongada e alargada no duplo transgênica (Fig. 6, inserção). O antagonista do TGF-p, Nephrocan, que é normalmente expressa em um padrão muito restrito em E16.5, foi expandido em transgénicos duplos, sugerindo que a região do esfíncter não foi adequadamente restringida. Esta morfologia alongada foi suportada por coloração imuno-histoquímica de a camada de músculo liso que forma a parede muscular densa circundante do piloro (Fig. 6 E, F). Em controles transgênicos individuais, a musculatura mais espessa foi encontrada onde o tecido apresenta o mais constrição ao nível do esfíncter (linha). Nos transgênicos duplas, foi observada musculosidade grosso, mas esta região foi deslocada da área que foi o mais apertado.}

defeitos Mis-padronização também foram observadas através da análise de marcadores específicos que distinguem entre o proximal (H ^{+ /K + ATPase) e a região distai (azul Alcian) do estômago. O estômago proximal (corpus) contém H + /K + ATPase-expressando células parietais que são excluídas da região antro-piloro. Por outro lado, o antro-piloro contém células da mucosa que se coram com azul Alcian que não são encontrados na região proximal [20]. Os transgênicos casal exibiu persistente H + /K + ATPase coloração e ausência de Alcian mucosa azul-positivos no estômago-piloro antral indicando que a região distal é mis-modelado ao destino proximal pelo Wnt9b
expressão. coloração azul Alcian de células caliciformes no intestino estava intacto em transgênicos, tanto individuais e duplos, porque SIX2
-cre não é expressa no duodeno. Esta mis-padronização sugere que, semelhante ao paradigma no rim, a sinalização β-catenina canônica especifica um destino, a região de pança, e padrões de atividade SIX2 a identidade distal. Isto é suportado pelos domínios de expressão destes genes repórter, desde uma sinalização Wnt canónica exibe uma elevada actividade apenas na pança, e SIX2
está confinado ao estômago e piloro distal [13], [14].}

Se a sinalização de Wnt canônico é responsável pelo refluxo gastroduodenal em SIX2-cre ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
transgênicos casal, em seguida, as malformações observado deve ser recapitulada em um rato modelo que expressa uma β-catenina estabilizado no mesmo domínio ( CTNNB1 ex3 /+
, [21]). Após a activação CRE, este alelo previne a degradação proteolítica do β-catenina e seria esperado para elevar a sinalização de Wnt canónica para um grau mais elevado do que o ligando Wnt9b sozinho. Whole montagem análise in situ dos estômagos E12.5 revelou três genes, Grem1
, NKX 2,5
, e GATA3
, que normalmente são expressos em uma faixa fina demarcando o região que passará a ser o esfíncter (n = 8, a Fig. 7). A expressão ectópica de Wnt9b
suprimido o antagonista BMP Grem1
eo fator de transcrição GATA3
nesta região, e estes genes foram ainda reprimidos quando a sinalização β-catenina foi aumentada. Uma expansão dependente da dose foi observada para o factor de transcrição Nkx2.5
em ambos os mutantes. Os genes que foram localizadas exclusivamente para o intestino ( vilina
) ou para a pança ( Bmp4
) não foi alterada em qualquer mutante (dados não mostrados). O aumento da sinalização de Wnt canônica no estômago antral e piloro foi confirmada pelo isolamento desta região e realizar PCR quantitativa. Os genes canônicos alvo Wnt que são regulados positivamente no alelo β-catenina estabilizado, LEF1
e Axin2
, foram também aumentadas na região pilórica de SIX2
-cre tg /+, Wnt9b tg /+ transgênicos duplas [ LEF1
, 2,0 ± 0,25 e Axin2
, 1,4 ± 0,06 (n = 6)]. Juntas, as mudanças de expressão gênica de dose de resposta observados na região pilórica no Wnt9b
transgênicos e os embriões β-catenina estabilizados demonstram que o aumento da sinalização de Wnt canônica perturba estômago distal e desenvolvimento esfíncter pilórico.}

Discussão

Estes resultados descrevem a criação de um novo modelo de camundongo que condicionalmente activa a sinalização Wnt canônico. O Wnt9b
transgene é indutivel por exposição a recombinase CRE e expressa GFP como um marcador de indução. Ele também mantém a actividade biológica completa, uma vez que pode salvar Wnt9b ^{- /-
fenótipos no rim. Estes ratos foram mantidos em nossa colônia de mais de um ano e induzir Wnt9b
expressão mediante criação de múltiplas estirpes cre diferentes. Temos utilizado esta nova estirpe para ativar a sinalização de Wnt em células -positivas SIX2
e encontraram efeitos deletérios no rim e do estômago.}

No rim, Wnt9b é secretado a partir do epitélio ureteral bud para induzir as células progenitoras tampão mesênquima adjacentes para iniciar a diferenciação. Em apoio a este modelo, o nosso in vivo ganho de função estudos mostram que Wnt9b
regula positivamente marcadores precoces de diferenciação vesícula renal tais como Wnt4
, Fgf8
e PAX8
. No entanto, apesar de genes vesícula renais são induzidas pela Wnt9b
transgene, não observamos evidências morfológicas de formação de vesículas renal aumentada ou ectópica, conforme relatado por SIX2
mutantes [9]. Além de um sinal indutivo Wnt, factores que mantêm a piscina progenitoras renais (por exemplo, SIX2
) deve também ser regulada negativamente para induzir completamente a formação de vesícula renal. SIX2
expressão não foi alterada no nosso Wnt9b
transgénica e pode assim explicar porque o aumento no Wnt9b não resultou em vesículas renais ectópicas. ectópica indução de marcadores de vesículas renais é induzido por activação de β-catenina em SIX2
mesênquima metanéfrico -positivo usando o alelo β-catenina estabilizado [4], portanto, a diferença entre estas duas experiências ganho-de-função pode estar relacionada com o grau em que eles ativam a atividade Wnt canônico. Além disso, é provável que a activação da sinalização por canónica Wnt9b no mesênquima metanéfrico induz a inibição do feedback, como observado em outros tecidos que respondem Wnt, evitando assim a indução do programa de diferenciação completa [22]. Dados recentes suportam a ideia de inibição do feedback desde Wnt9b sinalização /β-catenina é necessário não só para a diferenciação de mesênquima metanéfrico, mas também, paradoxalmente, é necessário o mesmo sinal para manutenção ou expansão de células progenitoras da piscina renal [7]. Especulamos que a β-catenina estabilizado, actuando a jusante na via, pode contornar estes mecanismos de regulação. Estas possibilidades podem ser testados em estudos futuros no que comparar a ativação de genes a jusante em células progenitoras renais usando o Wnt9b
transgene e estabilizado camundongos β-catenina ganho de função.

Perturbações na canônica via de sinalização Wnt foram mostrado ser importante na patogénese de doença renal cística (revisto por Patel et ai. [23]). a expressão transgénica de um β-catenina estabilizado ou deficiência de APC no epitélio tubular renal leva à doença renal cística, apoiando a conclusão de que a sinalização de Wnt canónica ectópica é suficiente para cistogénese [18], [19]. insuficiência renal e dilatação cística em SIX2
-cre ^{tg /+, Wnt9b tg /+ heterozigotos duplos suporta ainda a hipótese de que upregulated sinalização Wnt canônica provoca cistos. A interrupção da sinalização de Wnt não canónicas (PCP) via também é importante na formação de quistos renais [24]. Assim, é possível que a formação de cistos no nosso modelo não é simplesmente devido à ativação da sinalização canônica, mas é o resultado da ruptura do equilíbrio relativo entre a sinalização canônica e não canônica. Em apoio a esta ideia, os genes que são mutantes nas formas hereditárias da doença cística ( PKD1
, PKD2
, PKHD1
, Inversin
) para localizar os cílios e estes organelos foram recentemente mostrado ser capaz de regular o equilíbrio entre a sinalização de Wnt canónica e não canónicas [25], [26].}

Houve um fenótipo renal grave, embora Wnt9b
expressão de ARNm é aumentada ~ 2 vezes na nossa transgene, indicando que nível relativamente baixo, activação persistente desta via leva a disfunção renal. Este nível de regulação positiva de Wnt9b no broto ureteral usando Hoxb7
-cre não produzem cistos, sugerindo que cistogénese nos dutos coletores em SIX2
-cre ^{tg /+, Wnt9b tg /+ transgênicos duplo é provavelmente um efeito secundário de segmentos tubulares dilatadas (dados não mostrados). Em apoio a esta, na pós-natais dia 7-10 animais, a doença cística é evidente em apenas segmentos tubulares proximais ao ducto coletor. Semelhante a doença renal policística em pacientes, os ratinhos transgénicos desenvolveram insuficiência renal grave, embora a maioria dos néfrons não desenvolvem cistos. Isso levanta a questão de saber se túbulos renais sem cistos evidentes são anormais e contribuir significativamente para a incapacidade funcional progressiva nesses transtornos. Estudos recentes demonstram que os adultos epitélio do túbulo renal Wnt9b expressar, receptores Frizzled e /6 co-receptores LRP5 que são capazes de mediar a sinalização de Wnt canónica em resposta a lesão isquémica aguda [27]. Neste cenário, a sinalização Wnt promove a reparação e regeneração tubular. No entanto, a actividade de sinalização de Wnt também tem sido implicada na promoção da fibrose renal após uma lesão, tal como no modelo UUO [28]. Em geral, estes estudos destacam a importância de regular a sinalização de Wnt no rim adulto para equilibrar respostas benéficos, tais como a reparação /regeneração e respostas inadaptadas levando a fibrose e disfunção orgânica crônica.}

A região pilórica do estômago representa um limite crítico que separa estômago do intestino. encerramento do esfíncter quando um bolo alimentar entra no estômago permite que a digestão antes de trânsito para o intestino delgado. A base molecular para a formação desta região discreta não é bem compreendida, mas alguns detalhes são emergente. Estes resultados sugerem que um controlo apertado da sinalização Wnt é vital para o desenvolvimento do piloro. actividade de Wnt canónica é detectado na região do fundo e do corpo (corpo) mas excluídas do estômago distal e piloro [13]. Em Barx1
- /- ratos, o estômago é pequeno, o limite antral-corpus é turva e há agenesia do esfíncter pilórico. estudos de recombinação tecido elegantes sugerem que estes fenótipos resultar da perda de expressão do Wnt antagonistas Sfrp1 e Sfrp2. No entanto, desde deficiência Barx1
tem efeitos globais sobre o desenvolvimento intestino anterior, não era claro se a regulação negativa da actividade Wnt canônica é especificamente necessária para a formação do piloro. Nossos estudos testado mais diretamente essa possibilidade, visando a atividade Wnt ectópica a uma região restrita apenas anterior ao piloro com SIX2
-cre.

Nós descobrimos que a atividade Wnt ectópica perturba especificamente formação do piloro esfíncter na ausência de defeitos globais em desenvolvimento no estômago. Deste modo, a sub-regulação de actividade de Wnt canónico é necessário para o padrão região pilórica que separa estômago do intestino. A expressão ectópica do ligando Wnt9b e estabilizado β-catenina em ratos transgénicos poderiam superar os efeitos da secretados endógenos antagonistas Wnt Sfrp1 /2, de acordo com o modelo proposto por Kim et al [13]. Semelhante aos nossos resultados, em SIX2
mutantes há uma redução na expressão de Nkx2.5
e Gremlin
, genes que são importantes para o desenvolvimento do esfíncter pilórico em pinto [14] , [29]. Isto sugere que o SIX2
e Wnt
regular uma cascata genética comum no esfíncter pilórico presuntivo. Postulamos que uma importante função de SIX2
pode ser a de interpretar sinais Wnt canônico em diferentes contextos de desenvolvimento.

sinalização Wnt canônica regulada também tem sido demonstrado que afetam baço e pâncreas desenvolvimento [30]. Em apoio disto, baço e pâncreas hipoplasia também foi observada em SIX2
-cre, Wnt9b
ratinhos bi-transgénicos (dados não mostrados). Desde SIX2
-cre não é expressa nesses tecidos, isto sugere que os sinais provenientes do mesênquima posterior estômago pode afectar o baço e pâncreas durante o desenvolvimento. Isto suporta a hipótese de que a região pilórica pode actuar como um organizador para a formação destes órgãos acessórios. Durante o desenvolvimento, as células precursoras do baço transitoriamente associar com a região pilórica, antes da sua migração para a esquerda do estômago onde eles condensam [31]. Embora nós não detectou SIX2
-cre expressão no primórdio do baço ou mesotélio, não podemos excluir que a expressão transitória de SIX2
-cre nessas regiões é responsável por defeitos no baço e pâncreas . Futuros estudos são necessários para testar diretamente essas possibilidades.

Em resumo, temos desenvolvido um novo modelo de mouse que permite a expressão temporal e espacial da Wnt9b. No rim em desenvolvimento, transgênico Wnt9b
pode induzir início TEM expressão gênica em SIX2
progenitores renais -positivas, mas não é suficiente para ativar o programa de diferenciação completa. expressão persistente de Wnt9b em SIX2
células -positivas leva a cistos nos rins e falência de órgãos grave. No estômago, a atividade β-catenina Wnt ectópica na região pilórica altera a formação do esfíncter e padronização estômago distal. Juntos, estes resultados destacam a importância de um controlo apertado da atividade Wnt e sugerem que SIX2 e β-catenina estão envolvidos na padronização de órgãos em diferentes contextos.

Materiais e Métodos

Ética declaração

os estudos com animais foram aprovados pelo comitê de cuidados com os animais e utilização de Saint Louis University (protocolo 1460) e do St. Louis VA (protocolo 0305). Todos os procedimentos que envolvem animais estavam em conformidade com institucionais bem-estar animal regulamentos, normas e políticas

Ratos

ratinhos transgénicos Wnt9b
foram cruzados para cada uma das três linhas de cre diferentes [32. ]. 1) CRE β-actin- foi utilizado para expressar Wnt9b ubiquamente (Fig 1, [33]) 2) Hoxb7
-cre:. EGFP foi utilizado para sobre-expressar Wnt9b na sua localização no rim endógeno, o ureter broto (Fig 2, [34].), e 3) o CCB SIX2
-cre: EGFP transgene foi usado para expressar Wnt9b exogenamente no estômago e do rim (Figuras 3, 4, 5, [. ,,,0],35]).

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