LIM фактор транскрипции гомеодоменовый Isl1 направляет нормальное развитие привратника путем ориентации Gata3

LIM фактора транскрипции гомеодоменовый Isl1 направляет нормальное развитие привратника путем ориентации Gata3
Абстрактный
фон
Аномалии в развитии привратника или в сократительной функции привратника вызывают рефлюкс дуоденального содержание в желудке и увеличивают риск желудочного метаплазии и рака. Аномалии пилорической также связаны с врожденными дефектами, например, относительно общей неонатальной гипертрофической пилорического стеноза и первичной дуоденогастральным рефлюкса. Таким образом, понимание пилорического развития имеет большое клиническое значение. Здесь мы исследовали роль фактора транскрипции LIM гомеодоменовый Isl1 в привратника развития.

Результаты экспертизы выражения Isl1 в развитии желудка мыши с помощью иммуногистохимии, вся гора Ситу
гибридизации в режиме реального времени количественный ПЦР показал, что Isl1 высоко экспрессирована в развитии желудка мыши, главным образом, в гладких мышц слоя привратника. Выражение Isl1 также исследовали с помощью иммунофлуоресценции в гипертрофической стеноза привратника человека, где были обнаружены большинство гладких мышечных клеток, чтобы выразить Isl1. Isl1 функция
в развитии эмбрионального желудка исследовали с использованием тамоксифен-индуцируемый Isl1
модель нокаута мыши. Isl1
дефицит привел к почти полному отсутствию пиларическим наружного продольного слоя мышц в эмбриональный день 18,5, что согласуется с Gata3
нулевой фенотипа мыши. Иммунопреципитации хроматина, люциферазы анализы и электрофоретической подвижности сдвига анализы показали, что Isl1 обеспечивает нормальное развитие привратника путем непосредственного таргетинга Gata3
.
Выводы
Это исследование показывает, что Isl1-Gata3
транскрипции нормативная ось имеет важное значение для нормальное развитие привратника. Эти результаты являются весьма клинически значимыми и могут помочь лучше понять пути, ведущие к пилорического болезни.
Ключевые слова
α-актин гладких мышц Gata3 Isl1 привратника фон
позвоночного кишки является замечательной структурой, которая заглатывает и переваривает пищу, поглощает питательные вещества, а также удаляет продукты жизнедеятельности. Кишечник берет свое начало от простой трубчатой ​​структуры, состоящей из трех зародышевых листков, включая нижележащего эндодермы, окружающей висцеральной мезодермы и эктодермы [1-3]. У эмбрионов мышей, кишечник становится рисунком вдоль передне-задней, спинной-вентральной, слева направо, и радиальных осей. Кишечник трубка состоит из передней кишки, средней кишки и задней кишки вдоль его передне-задней оси [4, 5]. По мере продвижения развития, нежелезистый приводит к пищевода, желудка, печени, легких и поджелудочной железы. Кишка образует тонкую кишку и Толстый кишечник развивается в толстой кишке [1, 5-8].
Желудок происходит от задней кишки. Желудок морфологически отличает от передней кишки трубки вокруг эмбрионального дня 9.5 (E9.5) и расширение до желудка мезенхимы позволяет область желудка, чтобы быть видимым начало в E10.5 [9]. Мезенхимальные клетки желудка дифференцируются в четырех различных концентрических слоев, в том числе собственной пластинке слизистой оболочки, мышечная слизистая, а также круговой и продольной гладкой мускулатуры на разных стадиях эмбрионального развития [10]. По E11.5, желудок резко увеличены. Желудок гладких мышц дифференцируется в Е13, с отчетливым слоем альфа-актин гладких мышц (α-SMA) -позитивных клеток, появляющихся и круговой мышечный слой, образуя на всем протяжении желудка [11]. Слой гладких мышц утолщается в суженной перспективный регион пилорический сфинктер при температуре около E14.5 [2, 9]. На E18.5, пилорический сфинктер начинает функционировать в предотвращении рефлюкса дуоденального содержимого в желудок [9].
Задней или привратника части желудка является анатомический стык между желудком и двенадцатиперстной кишки. В конце привратника, отчетливые клапанные створки пилорический сфинктер можно увидеть [2]. В нормальных физиологических условиях, желудок, зависит от его перистальтических сокращений измельчить и вонзил частично переваренной пищи, и привратник желудка опирается на утолщенной пилорический сфинктер, чтобы контролировать поток пищи в тонкую кишку. Аномалии в развитии привратника или в сократительной функции привратника вызвать рефлюкс содержимого двенадцатиперстной кишки в желудок и увеличить риск желудочного метаплазии и рака [12, 13]. Аномалии привратника связаны с врожденными дефектами [14-16]. Таким образом, большое внимание было уделено элементам регулирования и путей развития желудка, особенно привратника и развития пилорического сфинктера.
Предыдущие данные в куриных предположил, что костного морфогенетического белка (BMP) сигнализации регулирует мезенхимальных экспрессию Nkx2.5
и Sox9
, которая влияет на характер пиларическим эпителия, но не оказывает никакого влияния на привратника гладких мышц [5, 17], предполагая, что передача сигналов мезенхимальных неизвестными факторами влияет на пилорический эпителиального фенотипа. У мышей, молекулярные механизмы формирования привратника мало понимали, с относительно небольшим числом факторов, необходимых для нормального развития пилорического того, были идентифицированы. Те, которые были включать Sox9
[17], Six2
[9], Bapx1
[18], Nkx2.5
[3, 17], Gremlin
[9], и Gata3
[19, 20]. Абляция фактора транскрипции гомеодоменов, Six2
, выраженное в заднем животе, разрывает утолщение привратника слоя гладких мышц и уменьшает сужение привратника сфинктера. Кроме того, потеря Six2
устраняет Sox9
выражение, и уменьшает Nkx2.5
и GREMLIN
выражение в привратника, хотя это выражение впоследствии восстанавливается [9], предполагая, что Six2
, Sox9
, Nkx2.5
и Gremlin
необходимы для развития привратника. Кроме того, Nkx2.5
, Sox9
и Gata3
являются ко-экспрессируются в дорсальной пилорического внешней продольной мышцы (ОЛМ) слоя, который созревает между E14.5 и E16.5. После удаления Nkx2.5
или Gata3
, спинной пилорического ОЛМ практически отсутствует, а сужение привратника сфинктер ослабляется [20].
Лим гомеодоменовый (LIM-HD) фактор транскрипции Isl1 был первоначально обнаружено, действуют в качестве гена инсулина, энхансер связывающего белка [21]. Isl1 состоит из двух тандемных LIM доменов и гомеодомена. Гомеодоменовый, с его спиралью поворот спирали структуры, связывается с регуляторными последовательностями ДНК генов-мишеней, в то время как LIM домены в основном участвуют в белок-белковых взаимодействий, которые регулируют активность LIM-HD [22]. Isl1 играет решающую роль в определении клеток, пролиферации и дифференцировки в нервной системе [23, 24], сердце [25], и гипофиз [26]. Кроме того, экспрессия Isl1 была обнаружена в желудочном мезенхимы [27, 28] и желудочно-кишечного эпителия в обоих эмбриональных и взрослых мышей [29]. Тем не менее, роль Isl1 в развитии желудка еще предстоит изучить. В настоящем исследовании мы рассмотрели Isl1 выражение в желудке. была высоко выражена Isl1 в задней желудка на ранних стадиях развития и в основном ограничивается гладкомышечных клетках привратника. Для изучения Isl1
функцию в развитии желудка, мы использовали тамоксифен индуцируемого модель нокаута мыши. Индуцибельная модель была необходима, потому что Isl1 - /- мутанты
умирают приблизительно E10.5 из-за дефектов в формировании сердца. Наши результаты показывают, что Isl1 имеет жизненно важное значение для формирования пиларическим ОЛМ слоя при желудка органогенеза.
Результаты
Isl1 выражается в эмбриональном желудка мыши
Мы исследовали Isl1
уровни мРНК в эмбриональном желудка мыши по вещественно время количественной ПЦР (RT-КПЦР) и вся гора на месте
гибридизация (WISH). Isl1
мРНК первоначально была обнаружена на E11.5 с помощью RT-КПЦР. Isl1
достиг самого высокого уровня в E13.5, а затем резким снижением на E14.5, и не было никаких существенных изменений во взрослую жизнь (дополнительный файл 1: Рисунок S1a). Этот результат был похож на предыдущий доклад [29]. Локализация Isl1
экспрессии мРНК была исследована с использованием WISH. Мы выполнили Isl1
WISH в эмбриональном животе на E11.5, E13.5 и E14.5. На E11.5, Isl1
был локализован в задней половине живота (дополнительный файл 1: Рисунок s1b). Тем не менее, Isl1
WISH сигнал был гораздо сильнее и конденсируется в привратника на E13.5 (рис 1А). По мере развития желудка, привратника продолжали выражать Isl1
и выражение Isl1
продлен до предполагаемого пилорический сфинктер в E14.5 (дополнительный файл 1: Рисунок S1b). Тем не менее, Isl1
WISH сигнал значительно ослаблены от E13.5 к E14.5. Эти Isl1
результаты WISH согласился с результатами Isl1
RT-КПЦР. Рисунок 1 Isl1 выражается в развитии желудка мыши. (A) Эмбриональные анализ желудка WISH показал, что Isl1
выражение было ограничено привратника на E13.5 (стрелка). (B) Иммуногистохимическое окрашивание для Isl1 в желудке. Отрывки из эмбрионов были расположены в ростральной до хвостового последовательности на E11.5 и E13.5, и экспрессия Isl1 в основном локализуется в мезенхиме задней желудка. На E14.5 и E18.5, была высоко выражена Isl1 в гладкомышечных клетках привратника, хотя были некоторые Isl1-позитивных клеток в собственной пластинке слизистой оболочки (стрелки). Увеличенные изображения в штучной упаковке регионов показаны ниже исходных изображений. D, двенадцатиперстной кишки; Лив, печени; Па, поджелудочной железы; St, желудок. Шкала баров исходных изображений: 100 мкм; масштабные линейки увеличенных изображений:. 50 мкм
Затем мы оценивали экспрессию белка Isl1 с помощью иммуногистохимии. Результаты показали, что Isl1 в основном локализуется в мезенхиме задней желудка от E11.5 к E13.5, затем была выражена Isl1 в гладкомышечных клетках привратника (рис 1B и дополнительный файл 1: Рисунок S1c), а также обнаруживается в собственная пластинка слизистой оболочки (рис 1B, наконечники стрел). У взрослых желудок мышей, наблюдалось лишь несколько Isl1-положительных клеток в слое гладкой мускулатуры. (Дополнительный файл 1: Рисунок S1c)
Isl1-положительные клетки экспрессировали совместно с альфа-актин гладких мышц в эмбриональный желудка мыши
чтобы увидеть, была ли экспрессия Isl1 связано с гладкой развитие мышц привратника, мы исследовали экспрессию Isl1 и с помощью иммунофлюоресценции ранних маркеров гладких мышц α-SMA. Результаты показали, что доля Isl1-положительных клеток, экспрессирующих α-SMA постепенно увеличивается (рисунок 2). На E11.5, не были обнаружены α-SMA-позитивных клеток, хотя Isl1 была высоко выражена в мезенхиме задней желудка. На E14.5, подмножество Isl1-позитивных клеток, главным образом, те, во внутренней круговой мышцы (ИВМ) привратника, были α-SMA положительным. По E16.5, пилорического ОЛМ уже подвергся дифференциации [20]. На E18.5, большинство Isl1-положительных клеток в привратника были α-SMA положительным. Isl1 выражение сохраняется в зрелом привратника МКД и ОЛМ, и клетки собственной пластинки также выразил Isl1 (Дополнительный файл 1: Рисунок S2). Кроме того, экспрессия Isl1 исследовали в человеческих образцах гипертрофической пилорического стеноза с помощью иммунофлуоресценции, и результаты показали, что также была выражена Isl1 в мышечных клетках привратника (дополнительный файл 1: Рисунок S3) человека гладкими. Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что Isl1 могут участвовать в образовании пилорический сфинктер. Рисунок 2 Двойной иммунное для Isl1 и α-актин гладких мышц у мышей гладкомышечных клеток спинного привратника. Isl1 и α-SMA коэкспрессией в клетках гладких мышц при E11.5, E14.5 и E18.5. Желтые пунктирные линии обозначают эпителиальной базальной мембраны, белые толстые пунктирные линии обозначают и ICM OLM границу, и белые пунктирные линии обозначают OLM и границы поджелудочной железы. Красное окрашивание Isl1, зеленое окрашивание альфа-SMA, и DAPI ядерной counterstaining (ДНК) синего цвета. α-SMA, α-актин гладких мышц; ИВМ, внутренняя круговая мышца; ОЛМ, внешняя продольная мышца; Па, поджелудочной железы; St, желудок. Шкала баров:. 50 мкм
Isl1 выражение эффективно абляции в Isl1
MCM /F
-inducible нокаутные мыши
Чтобы исследовать эффекты Isl1
абляции на развитие желудка, мы использовали Isl1 <бр> MCM /F
-inducible Cre (Isl1
MCM /Del
) мышей (рис 3А) и Isl1
F /+ т
льда в качестве контроля использовали [30, 31]. Эмбрионы были генотипирование с помощью ПЦР на E18.5 (дополнительный файл 1: Рисунок S4) и неповрежденным или мутант Isl1
мРНК отличался полуколичественный ПЦР (рис 3B). Рисунок 3 Эффективность Isl1 абляции в желудках Isl1 MCM /Del желудках мутантных мышей на E18.5. (A) Тамоксифен-индуцируемый Cre рекомбинантному вырезают последовательности ДНК между двух LoxP
сайтов. (B) Isl1
уровни РНК были абляции в Isl1
MCM /DEL
мутантных желудков, как видно по полуколичественной ПЦР. Isl1
F /+ т
льда показал пару продукт на 592 базовый тогда как Isl1
MCM /DEL
мышей Сформировавшаяся пара продукт на 303 базовый. (C) Isl1 была значительно понижающей регуляции на уровне белка в Isl1
MCM /DEL
мутантных желудков, как показано с помощью вестерн-блоттинга. Экспрессия эмбрионов на E11.5, использовали в качестве положительного контроля. (D) экспрессии белка Isl1 в Isl1
F /+ а
й Isl1
MCM /Del
эмбриональных привратника. экспрессия Isl1 была значительно уменьшена в Isl1
MCM /DEL
эмбриональных желудков, как видно иммунофлюоресценции. Изображения в Isl1
F /+ а
й Isl1
MCM /Del
были обработаны на одном слайде и фотографировали при той же экспозиции. Увеличенные изображения боксового областей показаны на правой стороне присоединяемых картин. Желтые наконечники стрел показывают типичные Isl1-позитивные клетки, и белые наконечники стрел показывают типичные Isl1-отрицательные клетки. Желтые пунктирные линии обозначают эпителиального базальную мембрану. Шкала баров:. 50 мкм
Вестерн-блот-анализ показал, что уровни белка Isl1 в эмбриональном желудке Isl1
MCM /DEL
мышей были значительно ниже, чем в Isl1
F /+ м
лед (рис 3C). Результаты иммунофлуоресцентного продемонстрировали значительно снижается Isl1 окрашивание в привратника из Isl1
MCM /DEL
мышей по сравнению с контрольной группой (Рисунок 3D). Эти данные свидетельствуют о том, что Isl1
выражение было эффективно понижающей регуляции в Isl1
MCM /Del
мутантные желудки.
Пилорического аномалии в Isl1
MCM /F
мутантов <бр> Чтобы исследовать эффекты Isl1
абляции на развитие желудка, мы сравнивали морфологические и гистологические различия между Isl1
MCM /Del
и Isl1
F /+ s
tomachs на E18.5. На E18.5, наблюдалась желтая жидкость в Isl1
MCM /DEL
желудки, но не в желудках Isl1
F /+ л
ittermates (рис 4A, звездочка) , Гистологическое исследование показало, что спинной пилорического слой гладких мышц был значительно тоньше в привратника из Isl1
MCM /DEL
мышей по сравнению с контрольной группой (4В). Мы исследовали экспрессию и распределение a-SMA в обоих Isl1
MCM /DEL
мутанты и Isl1
F /+ р
ylorus. Результаты иммунофлуоресценции показали, что дефицит Isl1 привело к почти полному отсутствию пиларическим ОЛМ слоя на E18.5, а оставшиеся клетки были слабо организованы (рис 5A, отмеченные звездочкой). Кроме того, сужение пилорического сфинктера был ослабляется в Isl1
MCM /DEL
мутантные желудки по сравнению с сужением в Isl1
F /+ s
tomachs (Рисунок 5В) , Кроме того, мы проанализировали экспрессию гладких мышц специфического белка Calponin-1 на E18.5 и иммунофлюоресценции результаты показали, что потеря Isl1 также привело к почти полное отсутствие Calponin-1 выражение в спинном привратника ОЛМ слоя, похожий на результат с альфа- SMA (Дополнительный файл 1: Рисунок S5). Sox9 выражается как в эпителии и мезенхимы [9] и необходим для развития ОЛМ и формирования пилорический сфинктер сужением [20]. Наши результаты показали, что иммунофлюоресценции Sox9 оставались на нормальном уровне в эпителии желудка Isl1
MCM /DEL
мышей на E14.5 и E18.5 (рис 6, Arrowheads), но область привратника гладких мышц экспрессирующие Sox9 была значительно уменьшена в Isl1
MCM /DEL
мутанты на E14.5 (рис 6A, звездочками) и отсутствует при E18.5 (рис 6В, отмеченные звездочкой). Таким образом, Isl1
требовалось для Sox9
экспрессии в спинных пилорических OLM клеток. Эти результаты указывают на то, что Isl1 имеет решающее значение для регулирования развития мыши пилорического гладких мышц. Рисунок 4 Морфологические и гистологические изменения в развитии желудка Isl1 MCM /Del мутантов. (A) Гросс и микроскопические доказательства дефектов желудка в Isl1
MCM /DEL
мышей. Всего смонтировать мнения на E18.5 в Isl1
F /+ A
Н.Д. Isl1
MCM /DEL
желудки мыши. Isl1
MCM /DEL
мутантные желудки не хватало функциональной пилорического сфинктера (Arrowhead), тем самым позволяя рефлюкса жидкости, как наблюдается у мутантных эмбрионов. Желтая жидкость обозначается звездочкой. (B) гематоксилином и эозином окрашивания Isl1
F /+ а
Н.Д. Isl1
MCM /DEL
привратника мыши на E18.5. Спинные привратника гладкая мышца (черная коробочный область) занимает видное место в /+ е
mbryos Isl1
F, но был гораздо тоньше в Isl1
MCM /DEL
эмбрионов. Остальная часть привратника была гистологически нормальной. Зеленые пунктирные линии обозначают эпителиального базальную мембрану. Увеличенные изображения в штучной упаковке регионов приведены ниже оригинальных фотографий. Шкала баров оригинальных фотографий: 200 мкм; масштабные линейки увеличенных изображений: 50 мкм. H &. E, гематоксилином и эозином
Рисунок 5 потере Isl1 нарушает образование спинного пилорического внешней продольной мышцы. (А) иммунофлюоресценции Isl1 и a-SMA в Isl1
F /+ а
й Isl1
MCM /Del
эмбриональных привратника на E18.5. Потеря Isl1 привело к почти полной потере a-SMA-положительных клеток в спинном пилорического ОЛМ (звездочки). Желтые пунктирные линии обозначают эпителиальной базальной мембраны и белые пунктирные линии обозначают ICM и OLM границу. Красное окрашивание Isl1, зеленое окрашивание альфа-SMA, и DAPI ядерной counterstaining (ДНК) синего цвета. Шкала баров: 50 мкм. (B) α-SMA иммунофлюоресценции Isl1
F /+ а
й Isl1
MCM /Del
эмбриональных привратника на E18.5. По сравнению с Isl1
F /+ е
mbryos, пилорического сфинктера Сужение был шире в Isl1
MCM /DEL
животных. Измерения сфинктера сужений показаны. Желтые бары разграничить привратника и выделить заметную разницу в ширине между Isl1
F /+ а
й Isl1
MCM /DEL
образцов. Данные представляют собой среднее ± SEM (п
= 6 мышей в группе), * P
&л; 0,05 (Стьюдента
-test). Шкала баров: 50 мкм. α-SMA, α-актин гладких мышц; ИВМ, внутренняя круговая мышца; ОЛМ, внешняя продольная мышца. Рисунок 6
Потеря Isl1 устраняет пилорического внешней продольной мышцы выражение Sox9 спинной. (A) Двойной иммунное для Isl1 и Sox9 в спинном привратника на E14.5. При отсутствии Isl1, область клеток мезодермы (звездочками) экспрессию Sox9 был меньше. (B) Двойной иммунное для Isl1 и Sox9 в спинном привратника на E18.5. Индуцибельная Isl1 Нокаут эффективно устранить Isl1 выражение, с сопутствующей потерей экспрессии Sox9 в спинном OLM клетках (звездочки). Выражение Sox9 было нормальным в эпителии желудка на обоих этапах (наконечники стрел). Желтые пунктирные линии обозначают эпителиальной базальной мембраны и белые пунктирные линии и отдельный ICM OLM. Красное окрашивание Isl1, зеленое окрашивание Sox9 и DAPI ядерной counterstaining (ДНК) синего цвета. Шкала баров: 50 мкм. ИВМ, внутренняя круговая мышца; Olm, внешняя продольная мышца.
Экспрессия и распределение генов белка продукта 9.5 (PGP9.5), кишечно системы маркеров нервной [32], была цела на E18.5 в Isl1
MCM /Del
мутантные желудки (Дополнительный файл 1: Рисунок S6). Панкреатической и дуоденальной гомеобоксный ген 1 (Pdx1) выражается в эпителиальных клетках антральном-пилорический сегмента и ростральной двенадцатиперстной кишки [33]. Наши результаты иммунофлуоресценции показали, что экспрессия Pdx1 была одинаковой в Isl1
MCM /Del
мышей по сравнению с контрольной группой на E18.5 (Дополнительный файл 1: Рисунок S7). Кроме того, было установлено желудка и двенадцатиперстной мыши эпителиальной граница между E14.5 и E16.5 [34], этот период, совпадающий с развитием ОЛМ слоя [20]. Мы проверили целостность кишечника эпителиальной привратника желудка границы-мала при E18.5 путем изучения экспрессии кишечника специфических эпителиальной маркера Cdx2 [19]. Наши результаты показали, что иммуногистохимия положение эпителиальной привратника границы в Isl1
MCM /DEL
мышей была аналогична контрольной группы (дополнительный файл 1: Рисунок S8). Эти результаты указывают на то, что потеря Isl1 не влияет на иннервацию или эпителиальную развитие привратника.
Потеря Isl1 не влияет на пролиферацию или апоптоз пилорического внутренней круговой мышцы и наружные клетки продольных мышц
Чтобы увидеть, была ли выражение Isl1 связанной с ними к клеточной пролиферации привратника, мы исследовали совместной локализации Isl1 и пролиферативную маркера бромдезоксиуридин (BrdU) с помощью иммунофлюоресценции в Isl1
F /+ т
льда. Наши результаты показали, что BrdU-позитивные клетки были плотные в E11.5 и рассеяны по регионам ИВМ и OLM на E14.5 и E18.5 (дополнительный файл 1: Рисунок S9A). Кроме того, доля пролиферирующих и OLM ICM клеток существенно не отличалась от Isl1
MCM /Del
и Isl1
F /+ т
льда на E18.5 ( Дополнительный файл 1:. Рисунок S9b)
Чтобы оценить потенциальное влияние на апоптоз, мы исследовали расщепляется каспазы 3 выражение на E18.5, и наши результаты иммунофлуоресценции показали, что не было никаких каспазы 3-позитивных клеток в привратника МКД или OLM слоя из Isl1
MCM /Del
и Isl1
F /+ т
лед (Дополнительный файл 1: Рисунок S10). Эти данные указывают на то, что Isl1 абляция не влияет на пролиферацию или апоптоз привратника МКД и клеток OLM.
Потеря результатов Isl1 в пониженную экспрессию Gata3
, Gremlin
и Nkx2.5

Так как а числа факторов, в том числе Bapx1
[18], Barx1
[35], Gata3
[19, 36], Gremlin
[5], Nkx2.5
[2] и Six2
[9], как сообщается, участвовать в регуляции пилорического развития, мы исследовали влияние потери Isl1 на экспрессию этих генов в E14.5 и E18.5. Результаты RT-КПЦР показали, что потеря Isl1
не влияет на экспрессию Bapx1
или Barx1
на любом E14.5 или E18.5 (рис 7а, б). На E18.5, α-SMA
и Six2
уровни мРНК были значительно ниже в Isl1
MCM /DEL
мышей по сравнению с контрольной группой (7b) Рис. В обоих E14.5 и E18.5, Nkx2.5
, Gata3
и GREMLIN
уровней мРНК в желудке Isl1
MCM /DEL
мышей были ниже средства управления (фиг.7А, Б). Gata3
уровни мРНК были приблизительно на 70% уменьшилось на обоих этапах, рассмотренных (7А, В). Основываясь на этих результатах, мы исследовали Isl1
, Gata3
, Gremlin
и Nkx2.5
выражение в Isl1
MCM /F
мутанта и Isl1
F /+ s
tomachs с использованием WISH. Результаты показали, что экспрессия каждого из этих генов в основном ограничивается пилорической, как и ожидалось; Gata3
выражение было более уменьшено в мутантных желудков; и Gremlin
и Nkx2.5
только имели тонкие изменения (рис 7E, F). Isl1
и Gata3
выражение были наиболее сильно влияет (рис 7С, D). Эти результаты согласуются с данными RT-КПЦР и предполагают, что Isl1 регулирует экспрессию Gata3
, Gremlin
и Nkx2.5
. Рисунок 7 Аберрантная экспрессии генов в hindstomach в Isl1 MCM /Del мутантов. (A) RT-КПЦР анализ уровней мРНК hindstomach обогащенные факторов транскрипции на E14.5 указывает на значительное снижение α-SMA
, Six2 Nkx2.5
, Gata3
и GREMLIN
мРНК в Isl1
MCM /DEL
мутантные желудки (п
= 4). Все результаты были нормализованы к уровням GAPDH
мРНК. (Б) ОТ-КПЦР анализ уровней мРНК hindstomach обогащенным факторов транскрипции на E18.5 указывает на значительное снижение Nkx2.5
, Gata3
и GREMLIN
мРНК в Isl1
MCM /DEL
мутантные желудки (п
= 4). Все результаты были нормализованы к уровням GAPDH
мРНК. Данные представляют собой среднее ± SEM (n = 6
мышей на группу). * P &
л; 0,05 по сравнению с Isl1
F /+
; ** P
&л; 0,01 по сравнению с Isl1
F /+
(Стьюдента
-test). (CF) анализ мРНК WISH подтвердил потерю Isl1
, Gata3
, Gremlin
, и экспрессия Nkx2.5
мРНК на E14.5 в Isl1
MCM /DEL
мутанта желудки. Isl1
и Gata3
мРНК были сильно понижающей регуляции в Isl1
MCM /DEL
мышей, в то время как Gremlin
и Nkx2.5
выражение слегка уменьшались. Стрелки указывают на пилорического сфинктера.
Isl1 цели Gata3
и активирует транскрипцию
Gata3
селективно экспрессируется в привратника развивающегося эмбриона мыши [19, 20]. Экспрессия обоих Isl1
и Gata3
мРНК наблюдалась в привратника на E14.5, но будет ли Gata3 и Isl1 выражены в одних и тех же клетках не была исследована. Таким образом, мы исследовали экспрессию Isl1 и Gata3 с помощью иммунофлюоресценции анализа. Результаты показали, что Isl1 и Gata3 белки были совместно выражены в одних и тех же клетках привратника на E14.5 и E18.5 в Isl1
F /+ с
ontrol желудки (рисунок 8). Кроме того, область выражения Gata3 была значительно меньше в Isl1
MCM /DEL
мутант пилорический слой гладких мышц при E14.5 (фиг.8А) и она была утрачена в E18.5 в пилорического ОЛМ слое (фиг.8В). Таким образом, Isl1
требовалось для Gata3
выражение в спинном привратника ОЛМ слоя. Для исследования, регулирует ли Isl1 развитие привратника путем непосредственного регулирования Gata3
, мы провели анализ биоинформатике геномной локуса Gata3. Помощью мыши Gata3
ген содержит несколько предполагаемых Isl1 элементов реагирования (АТТА /TAAT) при -2,832 пар оснований (п.о.) до +1,002 б.п. от сайтов инициации транскрипции [37]. Мы определили 10 областей, которые содержали привязки сайта (рисунок 9а) предполагаемую Isl1 и 10 пар соответствующих праймеров были сконструированы для амплификации этих областей следующие иммунопреципитации хроматина (CHIP) исследований с использованием антител к Isl1. Иммуноосажденного геномной ДНК получали из пилорического областей мышиных эмбрионов на E14.5. Из 10 предполагаемых областей связывания Isl1, две отдельные области, в -2,558 б.п. до -2,303 б.п. (Р1 область) и -1,081 б.п. до -855 б.п. (P6 область), были заняты белком Isl1. Этот результат был подтвержден полуколичественного ПЦР (рис 9В) и складчатой ​​метода обогащения (рис 9c). Рисунок 8 Потеря Isl1 устраняет спинной пилорического выражение внешней продольной мышечной Gata3. (A) Двойной иммунное для Isl1 и Gata3 в спинном привратника на E14.5. Область мезодермальных клеток (звездочки), выражающая Gata3 был меньше в Isl1
MCM /DEL
привратника, чем Isl1
Fl +
. (B) Двойной иммунное для Isl1 и Gata3 в спинном привратника на E18.5. Индуцибельная Isl1 Нокаут эффективно устранить Isl1 выражение, с сопутствующей потерей экспрессии Gata3 в спинном OLM клетках (звездочки). Желтые пунктирные линии обозначают эпителиальной базальной мембраны и белые пунктирные линии обозначают границу ICM и OLM. Белый стрелолист указывает на неспецифическую пятно. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Редкая причина желудочно-кишечных phytobezoars: Diospyros лотоса
• Фактор транскрипции FOXO4 подавляется и подавляет пролиферацию опухоли и метастаз при раке желудка