Ploche ONE: Mir-26a potláča rast nádoru a metastáz zacielením FGF9 v rakoviny žalúdka

abstraktné

Role Mir-26a v nádorových bunkách zdalo kontroverzné v predchádzajúcich štúdiách. Až doteraz role MIR-26a u karcinómu žalúdka zostáva definovaný. V tejto štúdii sme zistili, že mier-26a bola silne downregulated v karcinómu žalúdka (GC), tkanív a bunkových línií, a jeho hladiny expresie boli spojené s lymfatických uzlín a klinickej fáze, rovnako ako celkové prežitie a replase prežitie bez GC , Tiež sme zistili, že ektopická expresia MIR-26a inhibuje proliferáciu buniek GC a GC metastáz in vitro stroje a in vivo
. Ďalej sme identifikovali nový mechanizmus MIR-26a potlačiť rast GC a metastáz. FGF9 bolo preukázané, že je priamym cieľom MIR-26a, s použitím luciferázového testu a western blot. FGF9 zvýšená expresia v MIR-26a-vyjadrujúce buniek by mohla zachrániť invázie a rast defektov Mir-26a. Okrem toho, expresia MIR-26a nepriamo úmerná úrovni FGF9 bielkovín v GC. Celkovo vzaté, naše údaje naznačujú, že mier-26a funguje ako nádorový supresor vo vývoji GC a progresie, a drží sľub ako prognostického biomarkeru a potenciálny liečebný cieľ pre GC

Citácia :. Deng M, Tang Hl, Lu xh, Liu My, Lu Xm, Gu YX, et al. (2013) MIR-26a potláča rast nádoru a metastáz zacielením FGF9 v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 8 (8): e72662. doi: 10,1371 /journal.pone.0072662

Editor: H. Sunny Sun, Ústav molekulárnej medicíny, Taiwan

prijatá: 29. marca 2013; Prijaté: 12.07.2013; Uverejnené: 28.augusta 2013

Copyright: © 2013 Deng et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený dotáciou z povahy vedeckej nadácie Číny (81101526, 31100936) a Guangzhou Medical College lekár začne Foundation (2012C11). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

miRNA sú endogénne exprimovaný, malé nekódujúca RNA, ktoré negatívne regulujú expresiu génu spôsobujúce degradáciu cieľovej mRNA, inhibícia translácie týchto mRNA alebo oboch [1]. miRNA sa zúčastňuje kľúčových bunkových procesov, ako sú odpovede na stres, vývoja, diferenciácie, apoptózy a proliferácia [2]. Zmenené expresie miRNA bola popísaná v početných nádorových ochorení, vrátane prsníka [3], [4], pľúc [5], pečeň [6], žalúdka [7], hrubého čreva [8], [9] mozgu, leukémia [10], a lymfóm [11]. Stále väčší počet štúdií ukázalo, že miRNA môže fungovať ako onkogény alebo nádorových supresor, a sú často ich poškodeniu v nádoroch [12], [13]. V tomto ohľade, onkogénne miRNA sú často up-regulované, zatiaľ čo miRNA tumor potlačujúci sú downregulated v nádoroch. Napríklad, nech-7 bolo popísané, že v underexpressed karcinómu pľúc, a zamerať sa na onkogénne Ras [14], [15]. Máme už bolo skôr oznámené, že mier-216B je silne downregulated v nosohltane karcinómu a tlmí rast nádorov zacielením KRAS [16]. Na rozdiel od toho onkogénne MIR-17-92 zhluk miRNA sú up-regulované v rôznych nádoru [17], a vykonávaná expresiu týchto miRNA v dobre študovanej Eμ-myc transgénnym myšiam modeli bunkového lymfómu B výrazne urýchľuje nástup a progresie ochorenia [18]. Avšak úloha Mir-26a v nádorových bunkách sa zdalo sporné, pretože sa jedná o nádorový supresor v hepatocelulárneho karcinómu [19], rakoviny prsníka [20] a nosohltanu karcinóm [21], [22], ale je onkogén v glióm [23 ] a cholangiokarcinom [24]. Až doteraz role MIR-26 u karcinómu žalúdka bol definovaný.

V tejto štúdii sme skúmali, MIR-26a expresie v normálnych a 40 párované GC vzoriek pomocou kvantitatívnej RT-PCR (QRT-PCR) analýzy , Bolo zistené, mier-26a, ktoré majú byť pevne downregulated v GC tkanivách v porovnaní s tým priľahlých normálnou žalúdočné tkaniva. Tento výsledok bol ďalej potvrdený in situ hybridizácia na mikroskopických sústav tkanív sa skladá z 126 prípadov GC tkanív a 41 prípadov susediacich normálnych tkanív. Okrem toho sa znížil Mir-26a bola spojená so zlou prognózou a môžu nezávisle predpovedať celkové prežívanie (OS) a replase prežívanie bez známok (RFS) v rakoviny žalúdka. Funkčné štúdie odhalili, že mier-26a potlačil rast GC buniek a metastáz zacielením FGF9.

Výsledky

MIR-26a, ktorý Downregulated v rakovina žalúdka u ľudí

Pomocou QRT-PCR spôsob, hladiny MIR-26a boli detekované v 40 pároch na žalúdočné rakovinu tkanív a ich spárovaných okolité tkanivá, ako aj bunkových línií žalúdka. Z 40 pacientov s karcinómom žalúdka, približne 70% (28 z 40 pacientov) nádorov odhalili viac ako dvojnásobné zníženie hladín MIR-26a, s 5,76-násobnom zníženie voči susedným normálnych tkanív, čo naznačuje, že zníženie mir -26a bol častý udalosť v ľudskom GC (obr 1A). Okrem toho, mier-26a expresie bola znížená vo všetkých žalúdočných nádorových bunkových línií (MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, a BGC-823), v porovnaní s nemalígna žalúdočnej bunkové línie GES-1 (obr 1B). Pre ďalšie overenie výsledkov, pokiaľ ide o biologickú úlohu MIR-26a do ľudského žalúdka karcinogenézy sme použili in situ hybridizácia k vyhodnoteniu Mir-26a expresiu v 126 GC a 41 nenádorových tkanív na tkanivových mikročipov (TMA). Výsledky ukázali, že expresia skóre MIR-26a bola v porovnaní s normálnymi tkanivami (Obrázok 1C) významne znížila v GC. Ďalej sme určili potenciálne klinicko dopady zmeneného MIR-26a výrazu. Klinické vzorky boli rozdelené do nízkou expresiou a vysokou expresiou skupín založených na Mir-26a expresných skóre väčšie alebo menšie ako medián. V súlade s vyššie uvedených údajov, z 41 celkom normálne žalúdočnej vzoriek, 35 (85%) malo vysokú expresiu MIR-26a. Naproti tomu 60% (76 126) vzoriek karcinómu žalúdka mal nízky negatívny expresie MIR-26a. Zo 126 jedincov s GC, 38 boli negatívne na lymfatických uzlín, a 45% z týchto pacientov mala nízky negatívny expresie MIR-26a (tabuľka 1). Osemdesiat osem pacientov bolo pozitívnych na lymfatických uzlín, a 67% z nich sa ukázalo, downregulaci alebo stratu MIR-26a (Tabuľka 1). Navyše sme zistili, že nízka expresia Mir-26a v 37% a 77% nádorov žalúdka klasifikovaných ako fáza I /II a fázy III /IV, v danom poradí (tabuľka 1). Preto MIR-26a výraz inverzne koreluje s lymfatických uzlín a klinickej fáze ( P
= 0,019 a P Hotel < 0,001, príslušne). Avšak, mier-26a nekoreluje s vekom, pohlavím, diferenciácie buniek, alebo hĺbka invázie (T) fázy. Tieto výsledky naznačujú, že mier-26a by mohlo zohrávať kľúčovú úlohu pri GC metastázy a progresie.

Znížená MIR-26a koreluje s Poor klinickej prognózy

Pre ďalšiu analýzu významu MIR-26a z hľadiska klinickej prognózy, analýza prežitia podľa Kaplan-Meiera bola vykonaná za použitia pacienta celkové prežívanie a prežívanie bez relapsu. Výsledky ukázali, že pacienti s nízkym Mir-26a prejave mal kratšie medián OS a RFS, než tomu bolo u pacientov s vysokým Mir-26a výrazu (21,6 mesiacov proti 39,0 mesiacov P Hotel < 0,001 OS; 15,2 mesiacov vs. . 31.6 mesiacov, P
= 0,002 pre RFS, obr 1D). Použili sme Cox proporcionálny nebezpečnosť regresia ďalej zhodnotiť vzťah medzi MIR-26a prejavu a prognózou. V jednorozmerné analýze, lymfatických uzlín, TNM štádiu, a hladiny Mir-26a boli významne spojené s operačným systémom a RFS (tabuľka 2, 3). Výsledný model multivariačný bolo zistené, že celkové prežitie významne závislé od lymfatických uzlín, TNM štádiu, a hladiny Mir-26a (tabuľka 2), a bez relapsu doby prežitia urobil z lymfatických uzlín a hladiny Mir-26a (tabuľka 3).

MIR-26a Potláča GC Rast a metastázy

berúc na vedomie inverzný koreláciu medzi hladinou Mir-26a a metastáz, sme skúmali vplyv MIR-26a opätovné vyjadrenie o migrácie a invázie schopnosťou GC bunkové línie. Dve GC bunkové línie (SGC-7901 a AGS) s relatívne nízkou bazálnej expresie MIR-26a (obrázok 1B) boli infikované buď s Mir-26a alebo kontrolného lentivirus a vybrané s 5 mg /l puromycinu po dobu dvoch týždňov. Ďalšie, hojenie rán bola vykonaná skúška a skúška Transwell. Ako sa dalo očakávať, že nadmerná expresia MIR-26a významne potlačené bunkovú migráciu a inváziu schopnosti (obrázok 2A, B, obr S1).

Na preukázanie účinku Mir-26a na rast GC, sme vykonali GC teste bunkovej proliferácie. Test proliferácie ukázali, že ektopická expresia Mir-26a v SGC-7901 a AGS oslabenej bunkovej proliferácie v porovnaní s kontrolnými bunkami (obrázok 2C). Okrem toho, mimomaternicové MIR-26a výraz inhibuje tvorbu schopnosť kolónií v mäkkom agare (obrázok 2D). Potom sme vykonali analýzu bunkovej apoptózy a bolo zistené, že zvýšená expresia Mir-26a v SGC-7901 indukovanú apoptózu buniek (obrázok 2E).

Ďalej sme testovali, či MIR-26a by mohol hrať úlohu v tvorbe nádorov pomocou holé myši xenografe modely. Zistili sme, že nadmerná expresia Mir-26a v SGC-7901 buniek významne potlačený rast nádoru u holých myší (obrázok 3A, obr S2). Potom, SGC-7901 bunky infikované buď MIR-26a alebo kontrolných lentivirsus boli injikované do chvostovej žily u nahých myší skúmať pľúcne metastázy. Ako je znázornené na obrázku 3B, podstatne nižšie množstvo makroskopických pľúcnych metastáz bolo možné pozorovať v Mir-26a expresiou buniek ako kontrolné bunky. Tieto výsledky naznačujú, že mier-26a môžu potláčať rast GC a metastáz.

MIR-26a Priamo Ciele a inhibuje FGF9

Ak chcete porozumieť tomu, ako MIR-26a potláča rast GC a metastáz, sme použili tri algoritmy (Targetscan, Pictar a Miranda), aby pomohla identifikovať MIR-26a ciele v žalúdočných rakovín človeka. Týchto cieľových génov, ktoré boli predpovedané všetky tri algoritmy (tabuľka S1), FGF9 priťahuje pozornosť ihneď, ako sa podieľa na vzniku nádorov alebo metastáz [26] - [28]. klonovaný sme plnej dĺžky FGF9 3'-UTR do luciferázového reportérového vektora. Luciferase Assay bolo zistené, že mier-26a priamo viazaný na FGF9 3'-UTR, a ktorými sa výrazne zníži luciferázové aktivity (obrázok 4A). Avšak mutácie z domnelých MIR-26a miest na 3'-UTR FGF9 rušia luciferázy reagovať na Mir-26a (obrázok 4A). Sa priamo posúdiť vplyv Mir-26a na FGF9 expresie sme vykonali analýzu western blot. Ako je vidieť na obrázku 4B, lentivirový indukovaná ektopická MIR-26a dramaticky potlačiť úrovne FGF9 proteín v SCG-7901 a AGS buniek. Okrem toho, Vyradenie MIR-26a, prostredníctvom transfekcia anti-MIR-26a, v GES-1 bunky zvýšené hladiny FGF9 proteín (obrázok 4B, obr S1). Dohromady tieto výsledky ukazujú, že FGF9 je priamym downstream cieľ pre mier-26a v GC buniek. Uvedené výsledky nás prinútilo skúmať, či MIR-26a potláča rast GC a metastáz cez potláčanie FGF9 výraz. Pre tento účel, FGF9 bol znovu vyjadrená v Mir-26a-transfekciou SGC-7901 bunky. V MIR-26a-exprimujúce bunky, re-expresia FGF9 zachránil invázie a rast vady Mir-26a (obrázok 4C, D, E). Nakoniec sme testovali, či MIR-26a expresie koreluje s úrovňami FGF9 bielkovín v GC. Došlo k inverzný korelácia medzi úrovňou FGF9 proteínu, čo je indikované imunohistochemického farbenia a mier-26a expresie hodnotená in situ hybridizácia na 126 GC tkanivách na TMA, ako je použitý vyššie (obrázok 4F; Figure1C). Naše zistenia ukazujú, že mier-26a má vlastnosti sú v súlade s funkciou nádorového supresor. Schopnosť modulovať úroveň FGF9 by mohlo vysvetliť, prinajmenšom čiastočne, prečo MIR-26a inhibíciu rastu GC a metastáz.

Diskusia

MIR-26a patrí k Mir-26 rodiny, ktorá obsahuje iného členského mir-26b, z ktorých oba house identickú sekvenciu s výnimkou 2 rôznych nukleotidov zrelých miRNA. Mier-26a je funkčná miRNA, ktorá sa zaslúžila predchádzajúcom vyšetrovaní [29]. Je známe, že mier-26a hrá významnú úlohu v raste, vývoji a diferenciácii rôznych tkanív [29]. Niekoľko štúdií ukázalo, že mier-26a expresie v neporiadku v rade ľudských nádorov [19], [22], [24], [30], [31]. Avšak, žiadny z týchto štúdií sa vzťahuje k rakovine žalúdka. V tejto štúdii sme použili QRT-PCR a ISH ukázať, že hladiny MIR-26a žalúdočné rakovinové tkanive boli významne nižšie ako v nenádorových tkanív. Okrem toho hladiny MIR-26a boli spojené s klinickom štádiu a prítomnosť metastáz lymfatických uzlín. Kaplan-Meierovej analýzy prežitia ukázala, že pacienti, ktorých primárne nádory zobrazená nízka expresie MIR-26a mal kratšie OS a RFS v GC. Okrem toho, Cox proporcionálne nebezpečenstvo regresná analýza ukázala, že znížená Mir-26a v nádoroch bol silným a nezávislým prediktorom kratšie OS a RFS. Na základe údajov na báze pole, to bolo skôr oznámené, že kombinácia niekoľkých miRNA môžu byť užitočné ako prognostických markerov v karcinómu žalúdka [32], [33]. Okrem toho, jeden-miRNA, ako je MIR-218, môže byť prognostickým indikátorom [34]. Avšak, tieto miRNA boli skúmané len v niekoľkých málo pacientov s karcinómom žalúdka. Tu, mier-26a môžu byť užitočné ako prognostický marker predvídať prežitie a recidívy u karcinómu žalúdka.

Táto štúdia ukázala, že ektopická expresia Mir-26a v GC buniek znížená migráciu, inváziu, proliferáciu a rast kolónie ako i indukovanú apoptózu. Okrem toho údaje in vivo preukázali, MIR-26a inhibovala nádorový rast a metastázy. Tieto in vitro a in vivo dáta v ďalšom naznačila, že mier-26a funguje ako nádorový supresor rakoviny žalúdka. Niekoľko štúdií podporujú naše výsledky. Napríklad tento miRNA znížená NPC tkanivách a môžu tlmiť rast buniek a tumorigeneze zacielením EZH2 [22]. Hepatocelulárny karcinóm tiež vykazuje zníženú expresiu MIR-26a [19]. Systémové podávanie tejto miRNA v myšiam modeli HCC pomocou adeno-asociovaný vírus (AAV), vedie k inhibícii proliferácie nádorových buniek, indukciu apoptózy špecifické pre nádor, a dramatické ochranu pred progresie ochorenia bez toxicity [35]. Avšak, rôzne Nedávne štúdie ukázali, onkogénne rolu Mir-26a v nádoroch, ako je glióm a cholangiokarcinom. Huse et al. hlásil, že mier-26a bola nadmerne vystavený u high-grade gliómov a priamo cielená [23] Ptení. Podobne bolo zistené, že mier-26a, aby sa nadmerne exprimuje v ľudských tkanivách cholangiokarcinom a podporovať rast cholangiokarcinom aktiváciou B-katenin [24]. Tieto výsledky naznačujú, že kontroverzné role MIR-26a bola možná nádor špecifické a vysoko závislé od svojich cieľov v rôznych nádorových buniek. Rôzne štúdie ukázali, že Ptení [23], EZH2 [21], [22], SMAD1 [36], CDK6 a cyklin E1 [37] sú potenciálnymi downstream cieľové gény pre mier-26a. V tejto štúdii, FGF9, nové priame a funkčné cieľom MIR-26a, bol identifikovaný v GC. FGF9, tiež známy ako gliových aktivačný faktor, je jedným z 23 členov vysoko konzervované rodiny FGF. Ako vylučovaný, glykozylovaný 26-kDa proteín, má mitogénnu účinky na celý rad rôznych typov buniek [26]. FGF9 Ukázalo sa, že sa podieľa na rôznych rakovín, ako sú ovariálne endometrioid adenokarcinóm [26], hepatocelulárny karcinóm [27] a karcinómu prostaty [28]. V našich štúdiách sme potvrdili, že FGF9 bolo priamym cieľom Mir-26a v GC buniek. Ak chcete zistiť, či MIR-26a potláča rast GC a metastáz cez potláčať FGF9 výraz, sme zistili, že nadmerná expresia FGF9 mohol zachrániť invázie a rast defektov Mir-26a. Tieto výsledky naznačujú, že mier-26a GC inhibuje rast a metastázy čiastočne cielenie FGF9.

vzaté, sme pozorovali downregulaci MIR-26a do buniek karcinómu žalúdka a ukázal, že mier-26a môže pôsobiť ako nezávislý prediktor OS a RFS. Ďalej sme zistili, že mier-26a má potenciu potlačiť rast GC a metastáz reguláciou FGF9. Naše zistenia naznačujú, MIR-26a funguje ako nádorový supresor v GC a drží sľub ako prognostického biomarkeru a potenciálny terapeutický cieľ pre GC.

Materiály a metódy

Cell Culture

žalúdočné epiteliálne bunkové línie GES-1 bola zakúpená od pekinského inštitútu pre výskum rakoviny (Peking, Čína). V GC bunkové línie MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, a BGC-823 boli získané z čínskej akadémie lekárskych vied (Peking, Čína). Tieto bunky boli udržiavané pri teplote 37 ° C v atmosfére 5% CO _{2 v RPMI-1640 (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901), DMEM (GES-1) alebo F12 ( AGS) médiu doplnenom 10% fetálneho teľacieho séra, penicilínu a streptomycínu (Gibco BRL, NY, USA). Všetky transfekcia použité Lipofectamine 2000 ((Invitrogen, Carlsbad, USA)).}

klinických vzoriek

Všetky tkanivové vzorky použité v tejto štúdii boli zhromaždené z Hunan zemskej Tumor nemocnice (Changsha, Hunan, Čína). Písomný informovaný súhlas bol získaný od všetkých účastníkov štúdie. Táto štúdia bola schválená etickou komisiou z Guangzhou Medical University zdravotnícke orgány. Zhromažďovanie a použitie tkanív dodržal postupy, ktoré sú v súlade s etickými normami, ako sú formulované v Helsinskej deklarácie

Tkanivové vzorky od 40 pacientov s rakovinou žalúdka (23 samcov a 17 žien;. Medián veku 59 rokov; rozsah 40-84 rokov) boli použité pre kvantitatívne PCR v reálnom čase (qRT-) analýza PCR. Resekciou rakovinové tkanivá (tumor) a spárovaný uzavreté normálne žalúdočné tkaniva (normálne) boli okamžite znížiť, zmrazí v kvapalnom dusíku a uchovávané pri -80 ° C do extrakcie RNA.

Tkanivové mikročipy (TMA), skladajúci sa z 126 GC a 41 priľahlé normálne žalúdočné tkaniva, boli použité pre analýzy situ hybridizácia. Priemerný vek pacientov s karcinómom žalúdka pri diagnóze je 57 rokov (rozmedzie 31 až 82). Priemerné sledovanie celkového prežívania (OS) a bez relapsu prežitie (RFS) bol 22 mesiacov a 15 mesiacov, resp. Všetky údaje o 126 vzoriek GC, vrátane veku, pohlavia, nádoru mieste, histologického stupňa, hĺbka invázie (T) fáza, klinickom štádiu, a lymfatických uzlín boli získané z klinických a patologických záznamov a zhrnuté v tabuľke 2. doplnkové

Kvantitatívny RT-PCR analýza

Celková RNA bola extrahovaná z buniek za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen, Carlsbad, USA). Reverznej transkripcie a QRT-PCR reakcie boli vykonané za použitia qSYBR-zelený PCR kit (Qiagen, Germantown, USA) a U6 snRNA bola použitá ako vnútorná kontrola. Fold zmena bola stanovená ako 2 ^{-ddCt. Ct je čiastkové číslo cyklu, pri ktorom fluorescencie každej vzorky prechádza pevný prah. DdCt bola vypočítaná odpočítaním DCT referenčnej vzorky (špárovanie non-nádorového tkaniva pre chirurgické vzorky a GES-1 buniek po dobu šiestich bunkových línií karcinómu žalúdka) od DCT každej vzorky. Sekvencia špecifických primérov pre mier-26a a U6 snRNA boli 5'-CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3 'a 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3', resp.}

in situ hybridizácia a imunohistochémia

Detekcia MIR-26a, in situ hybridizácia s využitím DIG-značený uzamknutej nukleovej kyseliny (LNA) na báze sondy špecifické pre mier-26a (Exiqon, Vedbaek, Denmark) bola vykonaná v súlade s pokynmi výrobcu a U6 snRNA bol použitý ako pozitívna kontrola. Brie fl y, mikroskopické sústavy tkanív sklíčka boli zbavené parafínu, ošetrila proteinázy K (5 min v 2 ug /ml proteáza K), premyté v PBS a potom blokované endogénnej peroxidázy s 3% H 2O _{2. Hybridizácia bola vykonaná pri 52 ° C cez noc, po pridaní 50 nM DIG-značených sond, LNA nasleduje premytie stringence v SSC nárazníky. Po blokovanie (2% ovčej sérum a 2 mg /ml BSA v PBS s Tween-20) pri teplote miestnosti, sa sonda-cieľový komplex bola vizualizované s použitím anti-DIG-POD protilátky, a DAB komplex.}

imunohistochémia bola vykonaná na mikroskopické sústavy tkanív úsekoch s použitím anti-FGF9 protilátky (Santa Cruz, CA, USA). Komplex bol vizualizovaný pomocou streptavidin /peroxidáze a DAB komplex, a jadra kontrastne hematoxylínom. In situ hybridizácia a imunohistochemické výsledky boli hodnotené podľa intenzity (0-4) a percento farbenie (0-100%). Relatívna expresia sa získa vynásobením intenzity v percentách. Sklíčka boli analyzované dvoma nezávislými patológov.

rekombinantný vektor

Rekombinantný lentiviry obsahujúce MIR-26a prekurzorov alebo zakódované sekvencie boli zakúpené od SunBio (Shanghai, Čína). Luciferázy analýzu, plné dĺžky FGF9 3'-UTR bola amplifikovaná z ľudskej krvi genómovej DNA a potom klonovaný do spodnej oblasti svetlušiek kazety Luciferase v pMIR-REPORT luciferázy vektora (Ambion, Austin, TX, USA). Zodpovedajúce mutované konštrukty, v ktorých boli prvých šesť nukleotidov komplementárnych k Mir-26a-semien oblasti mutované lokálne cielenú mutagenéza (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Konštruovať FGF9 exprimujúce vektor, FGF9 ORF cDNA bol zakúpený od GeneCopeia (Rockville, MD, USA) a subklonován do eukaryotického expresného vektora pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).

Luciferase Reporter Assay

MIR-26a alebo ťahanice lentiviry a pMIR-3'UTR vektor boli kotransfekovány do HEK-293T buniek. Renilla luciferázy svetlušky a aktivity boli merané s Dual-Luciferase Reporter systému (Promega, Madison, WI), 24 hodín po transfekciu. Luciferázy svetlušiek aktivita bola normalizovala Renilla expresie luciferázy pre každú vzorku. Každý experiment bol vykonaný v troch opakovaniach.

Western Blot

Western blot bola vykonaná tak, ako bolo opísané skôr [16]. Stručne povedané, proteínové lyzáty boli separované 10% SDS-PAGE, a elek-trophoretically prevedené na PVDF (polyvinylidendifluoridovou membránu). Potom bola membrána inkubovaná s myšou protilátkou proti anti-FGF9 protilátkou (Santa Cruz, CA, USA) a potom HRP (chrenová peroxidáza) značená kozia anti-myšou-IgG (Santa Cruz, CA, USA) a detekované chemiluminiscencie. β-aktínu bol použitý ako kontrolný proteín-nakladanie.

Cell proliferation Assay

Bunky boli nanesené na 12-jamkové doštičky v požadovaných koncentráciách buniek. Počty buniek boli odhadnuté trypsinizaci buniek a vykonávania analýzy pomocou Coulter Counter (Beckman Coulter, Fullerton, USA) v uvedených časových bodoch v troch vyhotoveniach.

Cell migrácie a invázie testy

Migrácia buniek bol skúmaný pomocou testov hojenie rán. Umelý "rana" bol vytvorený na splývajúcu bunkovej monovrstvě a fotografie boli nadobudnuté za použitia inverzného mikroskopu (Olympus, Tokyo, Japonsko) po 24 hodinách.

V prípade testu invázie buniek, bunky boli vrúbľovať na bazálnej membráne matrix prítomná vo vložke z kultivačnej doštičky 24-jamkové (ES matice, Chemicon, Temecula, CA) a fetálne hovädzie sérum bolo pridané do dolnej komory ako chemoatraktantu. Po ďalších 48 hodinách non-invazívne bunky a matrix ES boli jemne odstránené vatovým tampónom. Invazívne bunky umiestnené na spodnej strane komory boli zafarbené kryštálovou violeťou, spočítané a zobrazený.

Colony Formation Test

Six-jamkové doštičky boli pokryté vrstvou 0,6% agar v médiu doplnenom 20% fetálnym bovinným sérom. Bunky (1 x 10 ^{4) boli pripravené v 0,3% agare a nasadené v troch opakovaniach. Potom, čo boli doštičky inkubované pri 37 ° C po dobu dvoch týždňov, kolónie boli počítané.}

Apoptóza Analýza

apoptotické bunky boli hodnotené Annexin V-FITC a propidium sfarbenie jódom (BD, USA ) a analyzované FACS Calibur nástroje (BD, USA). Získané dáta boli analyzované s použitím FlowJosoftware.

Myš modelu xenoimplantátu

Model rakovina žalúdka u holých myší bol postavený, ako bolo opísané skôr [25]. Zhodnotiť úlohu MIR-26a pri tvorbe nádorov, SGC-7901 bunky infikované MIR-26a alebo zakódovanie vírusy boli namnožené a očkujú subkutánne do chrbtových bokov holých myší (5 v každej skupine). Veľkosť nádoru sa merala každých 5 dní. Po 30 dňoch boli myši zabití, boli vykonané pitiev a nádory boli zvážené. Nádorové objemy boli stanovené podľa nasledujúceho vzorca: A x B ^{2/2, kde A je najväčší priemer a B je priemer kolmý k A. Pre testovanie účinku MIR-26a je na nádorových metastáz, SGC-7901 bunky infikované s Mir-26a alebo ťahanice vírusy boli injikované do chvostovej žily holých myší (6 v každej skupine). Po 45 dňoch boli vykonané pitiev. Počty mikrometastáz v pľúcach za HE-morený úsek v jednotlivých myší boli analyzované morfológiu pozorovanie. Experimentálne protokoly boli schválené Výborom pre zvierat výskum v oblasti ochrany Guangzhou lekárskej univerzity. boli sledovaní pre starostlivosť o zviera a laboratórne pokyny Štandardné.}

Štatistická analýza

Porovnanie medzi skupinami sa analyzovali t-
testu a x ^{2 testu. Celkové krivky prežitie a bez relapsu krivky boli vynesené za použitia metódy Kaplan-Meier, s log-rank testu použitého pre porovnanie. Prežitie bolo merané od deň operácie. Premenné s hodnotou P Hotel < 0,05 v závislosti na jednorozmerné analýze boli použité pri následnom viacrozmerné analýzy založenej na Cox modeli proporčne rizík. korelačný skúšku Spearmanův boli použité pre vyhodnotenie pairwise výraz koreláciu medzi Mir-26a a FGF9 v GC tkanivách. Všetky rozdiely boli štatisticky významné na úrovni P
≤ 0,05. Štatistické analýzy boli vykonané pomocou SPSS15.0 softvéru.}

Podporné informácie
Obrázok S1.
QRT-PCR sa merala hladina expresie Mir-26a v SGC-7901 a AGS bunky infikované MIR-26a lentivirus, ako aj GES-1 buniek transfektovaných s inhibítormi Mir-26a
doi :. 10,1371 /journal.pone .0072662.s001
(TIF)
obr S2.
QRT-PCR sa merala hladina MIR-26a expresie nádorových tkanivách získaných z holých myší 30. deň po injekcii nádorových buniek. Všetky údaje sú uvedené ako priemer ± SEM
doi :. 10,1371 /journal.pone.0072662.s002
(TIF)
Tabuľka S1.
Cieľové gény, ktoré boli predpovedané všetkými tromi algoritmy (Targetscan, Pictar a Miranda)
doi :. 10,1371 /journal.pone.0072662.s003
(XLS)
tabuľke S2.
Charakteristiky pacientov s rakovinou žalúdka
doi: 10,1371. /journal.pone.0072662.s004
(DOC)

Poďakovanie

Ďakujeme J Ma a CK Wang za ich technickú pomoc.

• Ploche ONE: ERCC1 a ERCC2 varianty Predpovedať prežitia u karcinómu žalúdka u pacientov
• Ploche ONE: klinický význam MYT1L polymorfizmy génu v čínskych pacientov s žalúdočnej Cancer