Analiza genomske profil želodca raka difuzna tipa

Genomsko analizo profil želodca raka difuzna tipa
Abstract
Ozadje
raka na želodcu, je tretji smrtonosno med vseh rakov po svetu. Čeprav se je pojavnost raka na želodcu intestinalnega tipa zmanjšala pojavnost razpršenega tipa še vedno narašča in njegovo napredovanje je notoričen agresiven. Obstaja dovolj informacij o različicah genoma raka difuzna tipa želodca, ker so njegove celice ponavadi meša z normalnih celic, in to z nizko celularnost je dosegla, da je težko analizirati genom.
Rezultati
smo analizirali celotne genome in ustrezne exomes raka želodca difuzna tipa, z uporabo ujema tumorja in običajnih vzorcev iz 14 razpršenega tipa in pet intestinalnega tipa bolnikov z rakom želodca. Somatske razlike najdemo v rak želodca difuzna tipa jih primerjamo s tistimi črevesne tipa in že poročali variant. Določimo povprečno exonic somatsko stopnjo mutacij dveh vrst. Smo našli povezan voznik kandidat gene, in opredeli sedem nove somatske mutacije CDH1
, ki je znana želodčni rak, povezan gen. Tridimenzionalna analizo strukture mutiranega E-kadherina proteina kaže, da bi ti novi somatske mutacije povzročijo precejšnje funkcionalne motnje kritičnih kalcija vezavna mesta v EC1-2 križišča. Kromosomska analiza nestabilnost kaže, da je Mdm2
gen poveča. Po temeljitem strukturno analizo romana fuzijskega gena TSC2
je opredeljena -RNF216
, ki lahko hkrati motijo ​​tumor-omejevalno poti in aktivirati tumorigeneze.
Sklepi
Poročamo genomske profil difuzna tipa želodcu raka, vključno z novimi somatskih razlike, novega fuzijskega gena in ojačanje in črtanje nekaterih kromosomskih regij, ki vsebujejo onkogeni in tumor valov.
Ozadje
raka želodca uvršča kot tretji najpomembnejši vzrok za globalno smrtnosti zaradi raka [1]. Histopathologically lahko želodčni rak (GC), se razvrstijo v dve kategoriji glede na morfološke razlike: intestinalnega tipa GC (MVK) in razpršeno tipa GC (DGC) [2, 3]. MVK je običajno povezana s Helicobacter pylori
okužbe, in je še posebej pogosta na Japonskem in v Koreji [4-6]. DGC je enakomerno porazdeljena geografsko in vsebuje agresivnih klinične oblike, kot linitis plastica, ki imajo slabo prognozo, zlasti pri mladih [7, 8]. Genomske DNA spremembe, ki vodijo v GC se lahko zgodi zaradi različnih okoljskih dejavnikov tveganja, kot so kajenje prehrana z veliko soli in tobaka [9]. Čeprav je pojavnost MVK vztrajno zmanjšuje že več desetletij (44% zmanjšanje od 1978 do 2005), DGC od leta 1978 hitro povečal (za 62%), do leta 2000, do leta 2001-2005 [10] rahlo upada. Kljub kumulativno dokaz, da medvladna konferenca in DGC razvili s pomočjo različnih rakotvornih poti [11, 12], podrobni podatki genomske lestvice DGC primanjkuje zaradi omejene razpoložljivosti kliničnih vzorcev in nizko stopnjo čistosti prebivalstva rakave celice.
Za datum, so bile ugotovljene zelo malo genov, povezanih z GC podtipov. V CDH1
gen, ki kodira E-kadherina beljakovine, so najbolj znane gene, povezane z dedno DGC (HDGC) [13-16]. Genetsko presejanje za te mutacije je bilo predlagano, da bi diagnosticirali zgodnji pojav VS [17]. E-kadherina disfunkcija, mutacije, izguba heterozigotnosti in promotorja hypermethylation povzročil, je najbolj uveljavljena pomanjkljivost v GC začetku in razvoju [18-20]. Zveza študija genoma vsej pokazala, da so polimorfizmi v izvornih prostate celica antigen gena (PSCA
) močno povezana z občutljivostjo za DGC [21]. Metoda temelji na mikromrež, pa je omejena na posamezne razlike nukleotidov, in ne more zaznati kopiranja nevtralno strukturne razlike (SVS). Dve nedavni študiji poročala o GC exomes in pokazali, da so mutacije v ARID1A
gena pogosto zazna GC s mikrosatelitno nestabilnost in Epstein-Barr virusa (EBV) -positive GK [22, 23]. Ne analizo GC podtipov bila izvedena, in večina analiziranih vzorcih v študijah so pri bolnikih z MVK.
Naslednje generacije sekvenciranja (NGS) je omogočila raziskovalcem, da zazna razlike povezano bolezni in pomagal odkriti temeljne mehanizme razvoja bolezni. Zlasti lahko cel genom sekvenciranje (WGS) zazna večino genomske različice, vključno SVS, kot intrachromosomal in interchromosomal prerazporeditve. Alternativno sta celi exome sekvenciranje (WES), metoda ujeli ciljno zaporedja, se lahko uporabijo za visoko globine sekvenciranje velikega števila vzorcev pri razmeroma nizkih stroških [24], čeprav le enojnih variacij nukleotidnih (SNVs) in majhnimi vložki ali izbrisi (indels) je mogoče določiti z uporabo te metode. WGS in WES imajo vsaka svoje prednosti in slabosti, in številne nedavne študije so uporabili obe metodi [25-27].
Tukaj vam predstavljamo podrobno opredelitev DGC genomov iz izravnane tumorja in običajnih vzorcev, ki jih ustvarjajo cele genomske profile sledi Wes . Uporabili smo vzorce krvi kot normalno kontrolo kot v predhodnih študijah [28-31]. Da bi našli DGC specifične razlike, so IGC genomi tudi analizirali in primerjali z nihanjem, opredeljenih v genomi DGCs. Tridimenzionalna analiza struktura proteinov je bila opravljena za nove somatskih mutacij v CDH1
gena, in to opredeliti kritične regije, ki so funkcionalno spremenila mutacij. Poleg tega smo ugotovili novo fuzijski gen, ki bi lahko bila vključena v tumorigeneze.
Rezultati in razprava
celega genoma in exome sekvenciranja
tumorje in izravnanih normalnih vzorcev (kri) od 14 bolnikov s DGC (v clinicopathological značilnosti od teh bolnikov je prikazano v tabeli S1 v dodatni datoteki 1), ki so bili vsi relativno majhni (mediana starost 38 let) korejske ženske, so sekvenco uporabo Illumina HiSeq 2000, ki se proizvaja v paru-end, 90-osnovno in 101-bazo DNK bere. Poleg tega je bilo pet parov tumorja in izravnane normalnih vzorcev bolnikov z MVK (mediana starosti 42 let) izpostavljeni zaporedja DNK; ena od teh vzorcev je bilo ugotovljeno kasneje kot primer mikrosatelitnih nestabilnosti (MSI), zato je bil izključen iz analize mutacije. Noben od vzorcev imeli družinsko zgodovino raka, in podtipi so histopathologically potrjena. Samo Tumorske celice so bile zbrane s macrodissection po Hematoxylin barvanjem.
Za celotno analizo genoma, v povprečju 92 gigabaze (GB) na vzorcu so bili proizvedeni na približno 32-krat globino zaporedja, ko je dosegel 3,5 terabases (TB), ki skupaj, in so preslikan z referenčnim genom (NCBI graditi 37, hg19) po stopnji za preslikavo več kot 94,5% (za statistiko zaporedja, glej dodatno datoteko 1: Tabela S2). Uporaba končnega 3.3 TB preslikan prebere, genomske podatkovne baze profil je bil zgrajen za odkrivanje SNVs, kopirati različic številko (CNVs), in SVS. Ker je celična čistost vzorca tumorja je zelo pomemben element pri analizi raka genoma, je bila ovrednotena z uporabo metode izračuna, v hiši (glej Materiali in metode; glej dodatno datoteko 1: Tabela S3 in slika S1). Čeprav smo poskušali zbrati le tumorske celice, naši vzorci še vedno pokazali visoko stopnjo stromalni primesi. Da bi povečali natančnost odkrivanja mutacije v genih regijah, tudi v vzorcih z nizko čistosti, so dodatno WES nastopil na približno 103-krat zaporedja globine v povprečju, ki proizvaja skupno 17 podatkov zaporedja Gb. Zajeta WES pokriva 93,1% od gensko območju na 10-krat ali bolj poglobljeno, in to kritje je podobna tisti od prej poročali exome podatkov o GC [22, 23].
Združevanje podatkov DS in WES, smo zaznali somatskih spremembe v vzorcih DGC, in jih primerjali s spremembami medvladne konference (podatki so zbrani na sliki 1 kot cirkuški sliki). Če želite preveriti naše podatke, smo združili in jih analizirali z že poročali podatke exome iz dveh različnih študij (24 medvladnih in 5 DGC vzorcev, ki ne vključuje MSI in mešanih vzorcev) [22, 23] in s paleto primerjalno genomsko hibridizacijo (CGH) podatkov ( 16 MVK in 14 DGC vzorcev) [32]. Čeprav te študije uporabljajo predvsem MVK in jih vključiti le majhno število DGC vzorcev, bi jih dopolnjujejo naših podatkih so kontrole (z zagotavljanjem večje število podatkov medvladne konference in odpravo specifičnosti tkiva). V kombiniranem CCD smo primerjali razlike v spremembah med vzorci DGC in žita. Slika 1 Celotna porazdelitev genom somatskih mutacij in podvajanje ali brisanje dogodkov v želodcu raka difuzna tipa (DGCs). Vse somatskih mutacij, vključno podvajanje /črtano dogodkov, ki so bile ugotovljene v 14 DGC genomov, so združeni v cirkusu ploskvi. Od zunaj navznoter, parcela ima naslednje značilnosti: kromosomske ideograma, pogostost kumulativnih ojačevanja ali brisanje dogodkov (črni, ojačitev; rdeče, izbris), in število somatskih niso sinonim posameznih različic nukleotidnih (nsSNVs), indels, in SNVs na spletnih mestih za vsak gen. Črni trikotniki kažejo visoko mutirani geni. Orange trikotniki označujejo onkogeni in modri trikotniki označujejo tumorja valov.
Identifikacija SNVs difuzna-tip značilnih in indels
v vsakem vzorcu para, smo ugotovili približno 3,7 milijona SNVs, ki so bile preverjene s pomočjo polimorfizma posameznih nukleotidov (SNP ) čipi (Povprečna stopnja skladnost: 99,2%; glej dodatno datoteko 1: Tabela S4), in približno 0.690.000 indels (za podrobnosti glej dodatno datoteke 1: Tabela S5 in tabela S6). Prvi smo ocenili mutacijski frekvenco obeh vrst GC na enem nivoju nukleotidov (glej dodatno datoteke 1: Slika S2 a, b). Somatskih mutacij spekter Prevladovala je C > T (G > A) se prehodi v obeh vzorcih DGC in IGC, in bilo nobenih pomembnih razlik v mutacijskih kontekstih med obema vrstama GC, v skladu s prejšnjimi študijami GC [23, 30]. Ko smo analizirali dva prej poročali exome nabore podatkov, smo ugotovili, da je spekter razmerja nukleotidov nadomestno podobno naših podatkih (glej dodatno datoteko 1: Slika S2C, d).
Čeprav je mutacija spekter DGC podoben MVK so posamezne mutacije v prizadetih genov drugačna. Z odštevanjem mutacije najdemo v normalnih krvnih genomov, smo identificirali 922 non-sinonim SNVs (nsSNVs) kot somatskih mutacij v 18 vzorcih tumorjev (glej dodatno datoteke 1: Tabela S7; glej dodatno datoteko 2). Povprečna stopnja mutacije 18 GK (1.97 mutacije /Mb) je bila primerljiva s tisto v drugih študijah o debelega črevesa, trebušne slinavke in jeter, raka [33-35]. Od 847 mutiranih genov, ki so jih 922 nsSNVs prizadetih, 581 so bili v 14 primerih DGC, 288 je bilo v 4 primerih medvladne konference, in 22 (2,6%) je bilo skupno za obe vrsti. MSI vzorec, ki je bil izključen iz primerjalne analize, je pokazala približno šest krat več SNVs in indels kot ga je imel druge vzorce; Ta rezultat je v skladu s predhodnim poročilom [22]. Ko smo združili dva prej poročali exome nabore podatkov, smo ugotovili 967 in 2,077 somatskih nsSNVs v 19 DGCs in 28 medvladnih konferencah, v tem zaporedju. Somatskih stopnja mutacij na MVK (3.71 mutacije /Mb v 28 vzorcev) je bila višja kot pri DGCs (2.29 mutacije /Mb v 19 vzorcev) (glej dodatno datoteko 1: Tabela S8). Predhodno objavljene raziskave kažejo, da imajo melanoma in pljučnega raka visoke stopnje mutacijo, zaradi udeležbe močnih mutagenih [36]. Prav tako je možno, da je medvladna konferenca na to visoko stopnjo mutacij, ker je njeno tumorogen mehanizem lahko povezana bolj z okoljsko in /ali parazitskih mutagene snovi v primerjavi s DGC.
Za posameznih variantah, so domnevni raka povzročitelji geni napovedujejo voznika izračun gen rezultata (glej dodatno datoteko 1: Tabela 1 in Tabela S9). V CDH1
gen bilo ugotovljeno, da se obilno mutiran v DGC (P
= 1,29 × 10 -2), vključno s šestimi somatskih mutacij (tri missense, ene neumnosti, en premik okvirja in eno mutacij spoja na kraju samem) ki niso bili že poročali, pa je bil le en missense mutacija najdemo v vzorcih medvladne konference (tabela 2). Vseh sedem CDH1
somatske mutacije so bili preverjeni s Sanger sekvenciranja (glej dodatno datoteko 1: Tabela S10 in Tabela S11). V naših DGC vzorcev, je bilo 35,7% (5/14) CDH1
somatskih mutacij, in so poročali, da so frekvence CDH1
somatskih mutacij v občasnih DGCs razlikujejo od 3% do več kot 50% [19 , 37-40]. Potrjeno je bilo, da je v državah z visoko stopnjo sporadične GC (kot na Japonskem in v Koreji), se pogostost reproduktivnih mutacij v družinsko GK nizka v primerjavi s tisto v državah z nizko pojavnostjo [41, 42]. Zato domnevajo, da je bila celotna incidenca GC povezana tudi pogostost CDH1
somatskih mutacij. Poleg tega je bil eden reproduktivnih mutacija (T340A) v CDH1
najdemo v obeh tumorskih in ustreznih krvnih genomov iz dveh vzorcev (D-14, DGC M-01, MSI-tipa). Čeprav T340A je povzročitelj mutacije v HDGC [43], ti dve bolniki niso imeli družinsko zgodovino, kot so GC ali lobularnega raka dojke. Dve prejšnjih poročilih, ki analizirajo podatke exome za GC ni ugotovila CDH1
kot visoko uvrščen gena (samo en missense mutacij v vzorcu MSI MVK) [22, 23]. Ta razlika je lahko posledica majhnega števila vzorcev DGC v teh študijah (2 od 22 in 3 od 15 vzorcev je bilo DGCs, v tem zaporedju). V tem delu, PIK3CA
in TP53
, znana povezanih z rakom, gene, so bili najbolj pogosto mutirani geni v obeh DGC in MVK glej tabelo 1 in Tabele S9 v dodatni datoteki 1. Mutacije v dveh znano PIK3CA
dostopne točke (E545K in H1047L) so našli v štirih DGC vzorcih. Poleg tega je bil eden nsSNV mutacija (Q546K) sosednji E545K mutacije nahajajo v eni DGC vzorcu. Skupaj 5 od 14 DGC vzorcev (približno 30%) gojila nsSNVs v PIK3CA
, ki je onkogena katerega mutirano obliko izkazuje povečano kinaze, ki povzroča raka proliferacije celic [44]. Nato smo primerjali z nizko frekvenco (16-17%) od nsSNVs v PIK3CA
v poročilih s strani drugih [22, 23, 44] (ki je največkrat uporabljeni IGC vzorci) in rezultati naše skupne analize (31,5% za DGC 14,3% za MVK) (glej dodatno datoteko 1: Tabela S9). Zdi se, da lahko relativno visoke stopnje mutacijo PIK3CA
v DGC odražajo specifičnost mutacij v tem genu za to vrsto raka. Poleg tega trije vzorci (dve DGC in eden IGC) vsebovali nsSNV in izgubo kopijo TP53
, kar kaže na homozigoti izgubo funkcije v TP53
, kot smo že poročali [45]. SNP v genu PSCA
(rs2976329) so poročali, da je povezana s povečanim tveganjem za DGC v japonskih in korejskih prebivalstva [21]. To SNP je obogatil tudi v večini DGC vzorcev v naši raziskavi, (9 od 14 bolnikov), kar kaže, da so naši analizirani vzorci predstavljajo tipične bolnikov z DGC v vzhodni Aziji. Poleg tega je nesmisel mutacije (R1446 *) v ARID1A
gena, je bilo v enem DGC vzorcu (D-08). Čeprav mutacij v ARID1A
pogosto odkrite v MSI in EBV pozitivnih GK [22, 23], vzorec D-08 ni pokazala okužbe EBV in je vzorec MSI (M-01) ni imela ARID1A
genske mutacije ne. Iz razlike v voznika kandidatnih genih, 88 nsSNVs, 4 majhne indels in 2 SNVs v mestu spoja so bile preverjene s klasičnim Sanger zaporedje. Sedem od teh mutacij ni mogoče preskusiti, ker ne PCR, in preostalih 87 mutacij, je bilo 96,6% potrjena kot prave somatskih mutacij (glej dodatno datoteko 1: Tabela S10 in Tabela S11) .table 1 Top kandidatke voznik genov v 14 razpršenih -Type želodca raka
Gene
Vzorci, n
nsSNVs, n
SNVs v spoja mestu, n
Indels, n

P
-vrednost
Driver gene ocena
PIK3CA
5
5
0
0
3,63 × 10 -12
9.83
CDH1
5
4
1
1
4,64 × 10-10
8.02
SNRPN

2
2
0
0
1,86 × 10-07
5.60
TP53
2
2
0
0
4,88 × 10-07
5.36
CMKLR1
2
2
0
0
5,33 × 10-07
5,36
CYP2A7
2
2
0
0
1,53 × 10-06
4,99
GUCY1B3
2
2
0
0
1,97 × 10-06
4,99
PAPOLB
2
2
0
0
2,15 × 10-06
4.99
MYH9
3
3
0
0
2,27 × 10-06
4,99
FAM71B
1
2
0
0
2,51 × 10-06
4,99
C10orf90
2
2
0
0
3,76 × 10 -06
4.86
AKAP8
2
2
0
0
4,59 × 10-06
4,81
ZC3H12B

2
2
0
0
5,87 × 10-06
4,74
SFTA3
1
1
0
0
6,86 × 10-06
4.70
SENP7
2
2
0
0
7,65 × 10-06
4,68
TMPRSS6
2
2
0
0
8,38 × 10-06
4.67
PAGE2
1
1
0
0
9,94 × 10-06
4,62
Za dodatne genskih voznik seznamov, glej dodatno datoteko 1:. Tabela S9
Tabela 2 CDH1 spremembe v 18 gastrični rak
Vzorec

Tip
sprememba
CDH1
regija
D-01, T
CNV
Izguba
eksonov 1 do 16
D-02, T
SNV
N256S
Exon 6
CNV
Izguba
eksonov 1 do 16
D-03, T
SNV
Splice stran
Donator mesto intron 4
D-04, T
CNV
Izguba
eksonov 1 do 16
D-05, T
SNV
D257N
Exon 6
INS
S829fs
Exon 16
D-09, T
SNV
V252G
Exon 6
SV
Break točka
Intron 2
D -10 T
CNV
Izguba
eksonov 1 do 16
D-11, T
CNV
Izguba
eksonov 1 do 16
D-12, T
SNV
Q23 *
Exon 2
D-13, T
CNV
Izguba
eksonov 1 do 16
SV
Break točko
intronov 2 in 10
D-14, T
SV
Break točka
intronov 2, 5 in 9
I-01, T
CNV
Izguba
eksonov 1 do 16
I -02 T
CNV
Izguba
eksonov 1 do 16
I-03, T
SNV
D221G
Exon 5
SV
Break točka
introni 10 in 13
I-04, T
CNV
Izguba
eksonov 1 do 16
CNV, kopiranje razlike številko; INS, majhna vstavljanje; SNV, ena variacija nukleotidov; SV, strukturna sprememba.
Somatske razlike so se nato preslika na Kjotskega Enciklopediji genov in genomov (kegg) poti baze podatkov. Ta analiza je pokazala, da so mutirani geni DGCs značilno povezana s kalcijevim signalne poti (P ​​
= 7,00 × 10 -5; glej dodatno datoteko 1: Tabela S12 in Tabela S13). Nizek vnos kalcija lahko prispeva k GC razvoj [46]. Kalcij je bistvenega pomena za delovanje E-kadherina, ter izgubo oprijema E-kadherina posredovana sodeluje pri prehodu iz benigne lezije na invazivnega raka metastatskega [47]. Poleg tega so somatske mutacije močno povezana s poti, povezanih z nedrobnoceličnim rakom pljuč (P
= 1,00 × 10 -6 v DGC in P
= 4,24 × 10 -2 v MVK). Še posebej, genov, ki sodelujejo pri osrednjih adhezijskih poti, kot so ITGA
, PIK3CA
in PTEN
, so pogosto mutirani.
SV in analiza CNV
SVS zaznali so temeljile na diskordantno preslikan prebrati parov, in vse SVS, ki so bile prisotne v reproduktivnih genomov pacientov so bili izključeni. V povprečju smo našli 552 somatskih SVS na DGC vzorca parom (211 velikih vstavljanja, 264 velikih izbrisi, 27 zasukov, 44 intrachromosomal prenosi, in 6 interchromosomal translokacijami). Našli smo 664 somatskih SVS v vsakem vzorcu par MVK (285 velikih vstavke, 283 velikih izbrise 34 inverzije, 38 intrachromosomal prenosi, in 24 interchromosomal translokacije) (za podrobnosti za vsak vzorec, glej dodatno datoteko 1: Tabela S14 in slika S3). Poleg tega smo ugotovili, 2258 genov, ki se poškoduje, 1736 od teh je bilo samo v vzorcih DGC (podatkov za vsak vzorec, glej dodatno datoteko 1: Tabela S15 in glej dodatno datoteko 3). Tri zaviralnih genov FHIT
, WWOX
in MIPOL1
, ki so poročali v študiji prejšnjo GC [30], je bilo slabitev zaradi SVS (FHIT
v 11 vzorcih, WWOX
v 5 vzorcih, in MIPOL1
in 3 vzorci)
Fusion genov, ki jih je kromosomsko preureditev analizirali smo tudi, in so bile ugotovljene 19 fusion genov kandidatov (glej dodatno datoteko 1: Tabela S16), ki vključuje nove fuzije gen TSC2
-RNF216
, ki se nahajajo v enem vzorcu (slika 2a, b). TSC2
kodira tuberin protein smo že predlagali kot tumor supresorski gen vključen v cilju sesalca rapamicina (mTOR) pathway [48, 49]. Poleg tega je RNF216
, ki kodira E3 ubikvitin-protein ligaze, ki sodelujejo v funkciji citokinov s preprečevanjem trajno aktiviranje jedrskega faktorja (NF) -κB [50]. Rap GTPase aktivira protein (Rap-GAP) domena TSC2 beljakovin, ki je povezana z notranjo GTPase dejavnosti Ras povezanih beljakovin RAP1A in RAB5, je bilo uničeno s to kromosomsko translokacijo (slika 2c). Poleg tega cinkov prst področja iz RNF216 proteina niso bili izraženi v genu fuzije, zaradi premik okvirja, ki je povzročil prezgodnjo prekinitev. Uporabo obratnega transkripcija verižne reakcije s polimerazo (RT-PCR), čemur sledi analiza zaporedja je bila potrjena izražanje tega fuzijskega gena v pacientovem tkivu. Po testiranju dodatni niz 15 GC tkiv bolnikov, smo ugotovili 2 bolnikov izražajo fuzijski gen (slika 2d, e). To kromosomsko translokacijo lahko povzroči spremenjeno celično vedenje tako z ovirali normalno delovanje gena in povzroča ekspresije fuzijskega genskega produkta, ki bi lahko tekmujejo z normalnim genom. Gen fusion lahko konkurenčno moti zaviralnih poti in aktivirajo NF-κB posredovanega citokini signalizacijo. Slika 2 TSC2 - RNF216 fuzijski gen preloma. (A) Exon struktura TSC2
-RNF216
gen fuzije. Številke v poljih so EXON številke vsakega gena. Rdeče črte označujejo za fuzijo točk. (B) sestava protein domena fuzijskega proteina TSC2-RNF216. Rap-GAP domena TSC2 niso bila razdeljena, in RNF216 imel premika bralnega okvira mutacijo, ki povzroča prezgodnje prenehanje, ki ga interchromosomal premestitvijo. (C) Struktura TSC2 Rap-GAP domeno. Rdeča regija je preostala Rap-GAP domene regijo in sivi regija Rap-GAP domena, da se črta v TSC2
-RNF216
fuzijskega gena. (D) RNA sekvenca TSC2
-RNF216
gen fuzije. Položaj 136 je prikazana kot N. bodisi A ali G baza proizvaja kodon prenehanju (TAA ali TAG). (E) Preverjanje TSC2
-RNF216
fuzijski transkript v RNA (cDNA) s pomočjo PCR pomnoževanja in elektroforeze.
V DGCs, kromosomi 16, 17, 19, 20, 21 in 22 vsebujejo povečano količino blok delecij, medtem kromosomov 3, 7, 8 in 13 so pokazali znatno povečala podvajanja je (slika 1). Veliko zaviralnih genov, kot CDH1
, PLA2G2A, RUNX3
, SMAD2
in TP53
, se nahajajo v veliki meri izbrisanih kromosomskih regij. Predvsem somatska mutacija (nsSNV ali spoja mesto mutacije) in kopijo izguba število CDH1
so bili na splošno med seboj izključujeta: štirje od petih DGC vzorcev s somatsko mutacijo niso imeli izgub število kopij genov, in osem od devetih DGC vzorcev z neke CDH1
gen kopija izguba številka ni imela somatskih mutacij v CDH1
. Samo en vzorec (1/18, 5,6%) je tako spremembe (mutacije in kopiranje izgubo številko) sočasno, in ta ugotovitev sovpada s prejšnjih študij poroča, da sočasno uporabo spremembe v CDH1
so redke [19, 40, 51, 52] . Ko smo upoštevali SVS v CDH1
skupaj, smo ugotovili, da je treba za druge tri vzorce mutacij /kopiranje izgube število sočasno s SV je. Poleg tega se je število kopij za onkogena myc
so v petih DGC vzorcih povečala (glej dodatno datoteko 4), in kopijo število MET
so v treh DGC vzorcev [53] povečal. V onkogenov MOS
in ZHX2
dokazale tudi številne kopije dobiček v petih in štirih DGC vzorcev oz. Več kot polovica vzorcev (10 od 18) je pokazala kopiranja zmanjšanje številčno ARID1A
, ki je voznik gen za jajčnikov jasni karcinomom, in kromatin Prenavljanje v GC [22, 54, 55]. Znano je, da je večina GK z ARID1A
mutacij kažejo nižjo izražanje proteinov v primerjavi z GK brez ARID1A
mutacije [22]. Če je doziranje učinek pomembna v teh rakavih tkiv, kopiranje zmanjšanje števila ARID1A
bi bilo mogoče raka povezana faktor
Velik regijo kromosoma 12, smo pomnožili v treh DGC genomov.; teh treh genomov, vzorci D-01 T in D-02 T pokazali izrazito visoko ojačanja (slika 3a). Vzorci podvajanje je nekoliko drugačna: D-01, T imeli tandem podvajanje 3 MBP, medtem ko je imel D-02, T obrnjeno podvajanje 1 MBP (slika 3b, c). Del tega podvajati regije kodira gen mišje dvojni minut (Mdm2
). Navedeno je bilo, da v majhnem CCD je Mdm2
gen pogosto pomnožili [56], in da je ta gen povezan z več raka [57]. Mdm2
čezmernim jih gena ojačanje bila eksperimentalno potrjena z uporabo kvantitativne RT-PCR s tumorjem in sosednjih normalnih vzorcev tkiv v paru, ki se uporablja za NGS povzročil analize in normalne celične linije so bile vključene v primerjavo (slika 3d). Mdm2
overexpression pozitivni korelaciji s podatki analize števila kopij. Čeprav je bilo že poročali zaporedji CGH podatkov [32] relativno nizko resolucijo za odkrivanje CNV, smo uporabili te podatke za iskanje pristranskosti v spremembe genov številu kopij v vsaki histopatološko vrste. Številni kopija dobiček genov, ki kodirajo kalcijevih kanalov beljakovine (CACNG6
, CACNG7
in CACNG8
, P
= 4,24 × 10 -2) je bilo bistveno bolj pogosta pri DGC vzorcih (glej Dodatna datoteka 1: Tabela S17). Vse integrirane informacije sprememba je prikazana v dodatnih datotek (glej dodatno datoteke 1: Tabela S18 in tabeli S19; glej dodatno datoteko 5). Slika 3 podvajanju regija Mdm2 gena na kromosomu 12 v vzorcih D-01 T in D-02 T. (a) globina mapiranje ploskvah obeh kromosomov. (B) Lahki črne konice je bilo brati v globini vzporejanje 2000 širino na dnu. Y
-os kaže relativno globino. Vsaka enota predstavlja približno 30-krat zaporedja globino. (c) Gene pozicije in imena okoli pomnoženih regij. Črni pasovi kažejo genske lokacije. (D) Mdm2
ravni prepisovali v tumor in sosednjih normalnih vzorcev tkiv v paru in normalnih celičnih linijah. Kvantitativno RT-PCR smo uporabili za merjenje Mdm2
nivoje mRNA v vzorcih D-01 in D-02 (ki vsebuje ojačano Mdm2
regije), D-04, D-05, D-10, I-03, in I-04 (brez ojačanih Mdm2
regije), in tri normalne celične linije (HDF, HMEC in Hs 738.St/Int~~number=plural). Napaka palice so bili izračunani iz dveh ločenih poskusih trojnih reakcij.
3D strukturna analiza mutiral CDH1
Da bi razumeli, kako odkrite mutacije vpliva na beljakovinsko strukturo /funkcijo in aktiviranje nižji stopnji biološke poti vplivanja rakotvornosti smo analizirali tridimenzionalni ( 3D) strukture mutant E-kadherina beljakovin najdemo v enem MVK in pet DGC vzorcev (glej dodatno datoteko 2). V CDH1
gen kodira kalcija odvisni od adhezije celic glikoprotein in ima pet zunajcelične kadherina domen (ES1-EC5) (slika 4a). Znano je, da je potrebna interakcija med kadherina in kalcija za dimerizacijo, strukturne togosti in zaščito pred proteolitsko razgradnjo [58]. Mutacije v EC1-2 in EC2-3 križiščih je znano, da povzroča nepravilno kadherina lokalizacije in zmanjšano celično adhezijo [59]. Strukturna analiza je bila izvedena na štirih nsSNVs (D221G, V252G, N256S in D257N), razen za neumnosti SNV (Q23 *), ki premika bralnega okvira vstavitev (S829fs), in na mestu spoja (CHR16: 68842472) mutacij. Vse štiri nsSNVs so se nahajala v križišču med ES1 in EC2 (EC1-2 junction) (slika 4b, c), in tri nsSNVs (D221G, N256S in D257N) je bilo v regiji beljakovin, ki neposredno komunicira s kalcijevim ionom (Slika 4d e). To stanje lahko povzroči anomalije interakcije med kadherina domen. Sporočeno je, da A298t, D231K in D231A mutacije, ki imajo podoben strukturni položaj na EC1-2 križišču na somatskih mutacij najdemo v tej študiji, je pokazala zmanjšano delovanje celične adhezije [60, 61]. Drugo nsSNV mutacija, V252G, ki se nahaja v strukturi β-stanja kadherina, njegova stranska veriga je usmerjena proti notranjosti. Ker β-barrel strukture splošno vsebuje izmenično polarne in hidrofobne aminokisline, s hidrofobnimi ostanki usmerjenih proti notranjosti valja, da se tvori hidrofobno jedro in polarni ostanki usmerjen proti zunanji strani soda na površini-topila izpostavljena je tvorba hidrofobnega jedra lahko ovirajo V252G mutacije (slika 4e). Prejšnja študija exome poročali dve CDH1
mutacije, P127fs (premika bralnega okvira mutacija v DGC) in V694I (v MSI MVK) [22]. Dimerizacijo dveh kadherina molekul v obeh cis
ali trans konfiguraciji
prišlo na križišču med EC1-2 in EC1-2 [62], medtem ko mutacije na EC3-4 in EC4-5 križišča ni pomembno vplivalo celično adhezijo [59]. Val694 se nahaja v zanki območju med EC5 beta-soda in transmembranski regiji oddaljeno od EC1-2 in EC2-3 križiščih. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Mehanizmi prebavila metanola ekstrakt Melastoma malabathricum listov
• Večja pogostost cagA EPIYA-C fosforilacijo strani v H. pylori sevov iz prve stopinj sorodnikov raka želodca patients