PLOS ONE: Metabolomics kombination med multivariat data och Pathway Analys på potentiella biomarkörer i magsår och ingripanden Effekter av Corydalis Yanhusuo Alkaloid

Abstrakt

Metabolomics, systematisk analys av potentiella metaboliter i ett biologiskt prov, har blivit alltmer tillämpas upptäcka biomarkörer, identifiera störda vägar, mäta terapeutiska mål, och upptäcka nya läkemedel. Genom att analysera och verifiera signifikant skillnad i metaboliska profiler och förändringar av metabolit biomarkörer, metabolomik ger oss möjlighet att bättre förstå ämnet metaboliska vägar som kan klargöra mekanismen för traditionell kinesisk medicin (TCM). Corydalis Yanhusuo
alkaloid (CA) är en viktig del av Qizhiweitong (QZWT) recept som har använts för att behandla magsår i århundraden och dess mekanism är fortfarande oklart helt. Metabolitprofilering utfördes genom HPLC kombinerad med time-of-flight-masspektrometri (HPLC /ESI-TOF-MS) och i samband med multivariat dataanalys och pathway analys. Statistiken programvara Mass Profiller Prossional (MPP) och statistik metod inklusive ANOVA och principalkomponentanalys (PCA) användes för att upptäcka nya potentiella biomarkörer för att klargöra mekanismen för CA vid behandling av syra injicerade råttor med magsår. Förändringarna i metabolisk profilering återlämnades till sina basunvärden efter CA behandling enligt PCA poäng tomter. Tio olika potentiella biomarkörer och sju viktiga metaboliska vägar som bidrar till behandling av magsår upptäcktes och identifieras. Bland de vägar, sfingofosfolipid metabolism och fettsyremetabolismen relaterade nätverk var akut oroade. Kvantitativ realtid polymeraskedjereaktion (RT-PCR) -analys utfördes för att utvärdera uttrycket av gener relaterade till de två vägar för kontroll av de ovan angivna resultaten. Resultaten visar att förändrade biomarkörer och vägar kan ge bevis för insikt i läkemedelsverkningsmekanismer och göra det möjligt för oss att öka forskningsproduktiviteten mot metabolomik läkemedelsutveckling

Citation. Tianjiao L, Shuai W, Xiansheng M, Yongrui B, Shanshan G, Bo L, et al. (2014) Metabolomics kombination med multivariat data och Pathway Analys på potentiella biomarkörer i magsår och ingripanden Effekter av Corydalis Yanhusuo
Alkaloid. PLoS ONE 9 (1): e82499. doi: 10.1371 /journal.pone.0082499

Redaktör: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, USA

emottagen: 15 maj, 2013; Accepteras: 24 Oktober 2013; Publicerad: 15 januari 2014

Copyright: © 2014 Tianjiao et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av bidrag från Key Program för Natural Science Foundation i den stat (nr 81.241.111). Den Aglient och finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

konkurrerande intressen. Författarna förklarar att deras manuskript har inga relationer med Agilent Technologies Co, Ltd, i fråga om sysselsättning, rådgivning, patent, produkter under utveckling eller marknadsförda produkter etc. Detta är en del av ett master~s projektet och står bortsett från alla interna projekt. En av de motsvarande författare, Xiaorong Ran, är anställd av Agilent Technologies Co., Ltd., som hjälpte i studiedesignen, experiment och /eller analyser. Lei Wang är också anställd av Agilent Technologies Co., Ltd., som har övervakat studien och bidragit till att modifiera de grammatiska fel i manuskriptet. Författarna bekräftar att sysselsättningen med Agilent Technologoies inte förändrar deras anslutning till någon av de PLOS ONE politik om datadelning och material.

Introduktion

Magsår är en utbredd sjukdom som drabbar många människor över hela världen på grund av dess högre och högre sjuklighet. Enligt statistiken för 2005 var förekomsten av magsår upp till 80%, i synnerhet västvärlden. Den har 40-80% av återkommande frekvens över hela världen. Magsår hos människor uppstår ofta på grund av olika endogena och exogena faktorer som stress, rökning, näringsbrist, saltsyra, pepsin, Helicobacter pylori
, icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel används (NSAID), alkohol och infektion [1]. Även om dessa faktorer har tros vara inblandade i patogenesen av magsår, är ännu inte mekanismen för sårbildning exakt förstås [2], [3]. TCM har fått allt större acceptans över hela världen under de senaste åren och är allmänt anses vara naturlig och ofarlig [4], [5]. Terapier kollektivt kallade TCM används ofta för att behandla magsår, som innehåller kinesisk örtmedicin och recept etc.

QZWT recept består av Corydalis Yanhusuo
, Radix Glycyrrhizae Mössor och Radix Bupleuri
ect. har i stor utsträckning använts för att bota magsår i århundraden i Kina, på grund av dess betydande terapeutisk prestanda i klinisk tillämpning [8] - [10]. Vi renade CA från växter "Corydalis Yanhusuo W.T. Wang" med renhet 92%. De kemiska beståndsdelar i Corydalis Yanhusuo
har undersökts i vår tidigare studie. Tetrahydropalmatin, corydaline, protopine et al var de biologiska aktiviteterna av Corydalis Yanhusuo
. Strukturerna hos beståndsdelarna undersöktes. CA är känd för att vara den huvudsakliga aktiva komponenten i Corydalis Yanhusuo
[6], och visat sig ha antimagsårseffekt som används på kinesiska klinisk praxis under många år [7]. Det har också rapporterats att CA har antiinflammatorisk effekt [8], [9]. Emellertid är den detaljerade molekylära mekanismen för CA vid behandling av magsår inte väl förstådd.

För att förklara verkningsmekanismen av läkemedel, metabolomik metoden har använts i stor omfattning [10]. Metabolomics är en viktig komponent i systembiologi, särskilt vid bestämning av den globala metaboliska profilen genom att detektera tusentals små och stora molekyler i olika media som sträcker sig från cellkulturer till humana biologiska fluider, såsom urin, saliv och blod [11], [12] [13]. Den har en stor inverkan på utredning av upptäcka biomarkörer, och identifiera störda vägar på grund av sjukdom eller läkemedelsbehandling [14]. Genom att analysera och kontrollera de specifika tidiga biomarkörer för en sjukdom, metabolomik ger oss möjlighet att bättre förstå ämnet metaboliska vägar som kan klargöra verkningsmekanismen [15].

Nya framsteg av instrumentering och beräkning har möjliggjort samtidig analys av ett stort antal metaboliter. HPLC i kombination med MS har visat sig vara en effektiv kombination för metaboliter identifieringar och kvantifieringar grund av dess utmärkta upplösning och känslighet. Syftet med föreliggande studie var att få en systematisk vy för att dissekera den mekanism av CA som en effektiv behandling för magsår. De specifika och unika biokemiska vägar av läkemedelseffektivitet kan identifieras, när den kombineras med multivariat dataanalystekniker. Syftet med denna studie är att identifiera flera metaboliter som kan underlätta förståelsen av verkningsmekanismen av CA och hjälpa deras införlivande i framtida förbättringar av TCM terapi.

Material och metoder

2,1 Etiska riktlinjer

Alla experiment utfördes i enlighet med de godkända djurprotokoll och riktlinjer som fastställts av medicin etikkommittén för djurförsök i Liaoning University i traditionell kinesisk medicin.

2,2 djurhantering och Provberedning

Sju veckor gamla hanråttor SD väger 200-250 g, tillhandahölls av försöksdjuret centrum Dalian Medical University. Vården och hantering av råttor i enlighet med standarden på specifika patogenfria. Magsår inducerades i råttor i enlighet med metoden i en tidigare rapport med en lätt modifiering [16], [17]. Tre dagar efter framställning av magsår råttorna slumpmässigt i fem grupper: kontroll, modell, CA högdosgruppen (32,4 mg /ml), CA mitt dosgruppen (10,8 mg /ml) och CA lågdosgruppen (3,6 mg /ml). Alla råttor i grupper administrerades oralt av den aktiva gruppen lösning 1,5 ml en gång dagligen (modell och kontrollgrupper med saltlösning) under 7 dagar. Råttorna förbjöds någon mat under 12 timmar före försöken, men fick tillgång till vatten fritt.

På den sista dagen, råttor var djupt sövda och sedan offras. Blod uppsamlades, plasma och serum separerades via centrifugering vid 3000 rpm under 15 min vid 4 ° C. Plasmaprover uppsamlades och lagrades vid -80 ° C snabbfrystes i flytande kväve tills metabolomikanalyser utfördes. Därefter tillsattes magarna skära längs den större krökningen, tvättades med salin. Området för sår mättes med en kompass för att mäta sårindex. Området för magsår är lika med bredden på de ulcus gånger längden av såret. För histologisk utvärdering, var gastriska vävnadsprover fixerades i neutral buffrad formalin under 24 timmar. Magen sektionerna dehydratiserades med graderad etanol, passera genom xylen och inbäddas i paraffin. Paraffinsnitt (5 mm tjocklek) färgades med hematoxylin /eosin (HE). De andra mag ulcererade vävnader avlägsnades snabbt och frystes i flytande kväve tills extraktionen av total vävnad RNA.

2,3 Metabolic Profiling

2.3.1 Kromatografi.

Kromatografi genomfördes med hjälp av en Agilent 1100 series HPLC-system utrustat med kvartar pump, online-avgasare, autosampler och termostat kolumn utrymmet. Injektionsvolymen fastställdes till 4 mikroliter. Alla proverna hölls vid 4 ° C under analysen. Separationen utfördes på en 4,6 * 100 mm, Zorbax SB-C18-kolonn (Agilent, USA). Kolonntemperaturen inställdes på 45 ° C. De mobila faserna var sammansatta av 0,1% myrsyra i vatten (lösningsmedel B) och 0,1% myrsyra i acetonitril (lösningsmedel A), ökades flödeshastighet satt som 1 ml /min med delningsfaktorn 1:03 ades gradienten användes som på följande sätt: en linjär gradient av 70- 33% B under Start- 5,0 min, 33 -98% B under 5,0 till 12,0 min. Elueringsmedlet introducerades till masspektrometern direkt. Efter varje 10 prover injicering, var ett samlingsprov som QC provet följt av ett ämne injiceras för att säkerställa stabiliteten och repeterbarhet av LC-MS-system.

2.3.2 masspektrometri.

för masspektrometri, var Agilent 6220 TOF-MS med en elektro jonisering källa (ESI) i negativ-läge används. Flödeshastigheten hos döende gas (N2) var satt till 9 l /min. Nebulisatorn var satt till 45 psi. De andra optimala förhållanden var följande: döende gastemperatur på 350 ° C, fragment spänning på 120 V. Data samlades in i den fullscanningsläge från m /z 50 till 1050 amu över 0-12 min. De MS-data samlades i tyngd läge.

2.3.3 multivariat dataanalys.

Dataanalys procedur visas i fig. 1. Molecular Feature Extractor (MFE) algoritm i Mass Hunter Kvalitativ analys programvara användes för att extrahera molekylära funktioner-oidentifierade, oriktade föreningar - i var och en av uppgifterna. MFE-algoritmen söker mass signaler (joner) som är kovariant i tid, anser möjliga kemiska förhållanden (isotoper, addukter, dimerer, flera laddningstillstånd), och genererar en extraherade förening kromatogram och förening masspektrum för varje molekylär funktion. Den extraherade föreningen lista för varje fil exporterades som förening Exchange Format (CEF.) Fil för ytterligare Mass Profiler Professional (version B.2.00, Agilent) statistisk analys. De resulterande funktionen filer för varje prov bearbetades av ANOVA och PCA analys utnyttjar MPP programvara, som i linje, normaliseras, visualiseras och filtreras de molekylära funktioner (MFS), för vidare bearbetning [18], [19], [20], [ ,,,0],21]. Därefter hierarkisk klustring (villkor träd) appliceras på datafiler. Hierarkisk klusteranalys är en statistisk metod för att gruppera prover utan uppsikt i olika kluster eller grenar trädet. På detta sätt, är relationerna mellan de olika grupperna visas. Villkoret träd visades som en värmekarta. Identiteten av biomarkörer med betydande förändringar i grupperna bestämdes av ID Browser funktioner i MPP.

2.3.4 Biomarkers Identification.

identifiering av potentiella biomarkörer bestämdes av Q-TOF (Xevo G2). MS kollisionsenergin är 35ev och data erhölls i negativ jon-läge, var (MassLn1 V4.) Programvara x används för dataanalys. Identiteterna för de specifika metaboliter bekräftades genom jämförelse av deras masspektra med hjälp av elementarsammansättningsinformation som tillhandahålls av programvaran elementen information.

2.3.5 Nätverk och Pathway analys.

MPP programvara användes till alla betydande (mapp förändring > 2) upp reglerade och ner reglerade metaboliter och relaterade biologiska vägar. De potentiella markörer identifierats jämfördes med den exakta massförhållande laddning i vissa databaser, inklusive HMDB, Kegg, METLIN lipid MAPS och PubChem att upptäcka relaterade vägar. T-test och vik-alter användes för att bestämma den statistiska signifikansen i banorna. P-värde < 0,05 och mapp förändring > 2 ansågs vara kriterier för statistiskt signifikant och skulle väljas

2,6 Molecular Data

Totalt RNA extraherades från magen vävnader inklusive kontroll, modell och CA. grupper med en TRIZOL reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens anvisningar. cDNA syntetiserades från total-RNA (1

• PLOS ONE: den minskade Expression av Proangiogenic tillväxtfaktorer och deras receptorer i Gastric Sår av cirrospatienter
• PLOS ONE: In Vivo Antioxidant och antimagsårsaktivitet av parkia speciosa Etanolisk Leaf Extract mot etanol-inducerade magsår hos Rats