Expression av RON receptortyrosinkinas och dess samband med magcancer kontra normala mag vävnader

Expression av RON receptortyrosinkinas och dess anslutning med gastrisk karcinom kontra normala gastriska vävnader Bild Sammanfattning
Bakgrund
Recepteur d'origine Nantais (RON) är en receptor-tyrosinkinas som aktiveras av en serumhärlett, makrofagstimulerande protein (MSP) tillväxtfaktor och uttrycks i många maligna tumörer. Syftet med denna studie var att avslöja proteinuttrycksprofilen för RON och dess relation med kliniskt patologiska egenskaper hos magsäckscancer och prognos.
Metoder
Gastric cancer vävnad från 98 patienter, tillsammans med 29 exemplar av paraneoplastisk vävnad och 10 exemplar av normal magslemhinna, undersöktes genom immunhistokemi (IHC). Western blot-analys av 19 prover av magsäckscancer vävnad och motsvarande paraneoplastisk vävnad, 8 exemplar av normal magslemhinna och 2 exemplar av normala lymfkörtelprover detekterades också uttryck för en splitsningsvariant av RON, RONΔ165. Alla prover som erhölls tillsammans med patientuppföljning data som sträckte sig från 3 till 89 månader (median tid: 22 månader).
Resultat
Andelen positiva RON uttryck skilde sig signifikant mellan magcancer vävnader [56,1%, ( 55/98)] och paraneoplastiska vävnader [25,6% (8/29)] (p = 0,007). I kontrast, RON expression var frånvarande i normala magslemhinna prover. RON uttryck positivt korrelerad med den invasiva djupet av tumören (p = 0,019), noder perigastric lymfa metastaser (p = 0,019), och TNM steg (p = 0,001). Men RON uttryck var oberoende av tumörtillväxt mönster enligt Bormann kriterier (p = 0,209), histopatologiska grad (p = 0,196), och förekomst av fjärrmetastaser (p = 0,400). RON uttryck var inte relaterad till en patients överlevnad (p = 0,195). RONΔ165 starkt uttryckt i färskt magkarcinom vävnad, motsvarande paraneoplastisk vävnad och perigastric lymfkörtlar med metastaserad. Däremot var expression av RONΔ165 inte observerats i normal magslemhinna och normal lymfkörtel vävnadsprover.
Slutsats
RON expression är signifikant i gastrisk karcinom vävnad och motsvarande paraneoplastisk vävnad, men är inte uttrycks i normal magslemhinna. Uttryck av RONΔ165 liknande sätt observerades i magsäckscancer vävnad och i metastaser som finns i lymfkörtelvävnad. Vår hypotes är att RON och dess splitsningsvariant spelar en viktig roll i uppkomsten, progression och metastasering av gastrisk karcinom, och kan därför representera en användbar markör för att utvärdera den biologiska aktiviteten av gastrisk karcinom.
Bakgrund
sjuklighet från gastrisk cancer ökar varje år, medan debutåldern minskar. I Kina, är magcancer toppen elakartad tumör i båda kategorierna av sjuklighet och dödlighet [1]. Recepteur d'origine Nantais (RON) är en receptor (RTK) som hör till MET proto-onkogenen familj. Nyligen genomförda studier av ett RON knockoutmus Modellen visar att fullständig splittring av RON genen är embryonal letal [2], vilket visar att RON är viktigt i embryoutveckling. RON aktiveras av en serumhärlett, makrofagstimulerande protein (MSP) tillväxtfaktor, och studier har visat att RON uttrycks i många maligna tumörer och spelar en roll i deras förekomst och progression.
Zhou et al. [3] fann att RON uttrycks starkt i kolorektala karcinom, och de identifierade tre splitsvarianter av RON (RONΔ160, RONΔ165 och RONΔ155). Uttrycket av RON och dess varianter var i samband med utvecklingen av kolorektal cancer. Andra studier har visat att uttrycket av RON och dess splitsningsvarianter kan fälla ut kolon epitelial cellkolonibildning och öka deras livsduglighet. När uttryck av RON och dess splitsvarianter var måltavla för siRNA i rektala stammar tumörcell var spridning och metatasis signifikant mindre, samtidigt med ökad apoptos. Baserat på dessa data, RON och dess splitsvarianter är en hypotes att ha en viktig roll i uppkomsten, progression och metastasering av ändtarmscancer [4]. Likaså studier av RON uttryck i både bröst och urinblåsecancer vävnader har visat förhöjda nivåer av RON uttryck och en korrelation med histologisk grad [5, 6].
Såvitt vi vet bara har studerat roll RON i magcancer av Collesi et al [7]. I denna studie skarv variant av RON, RONΔ165, upptäcktes i magsäckscancer cellstam, KATO-III. RONΔ165 visades öka invasionen av gastric cancerceller, vilket tyder på en roll för skarv variant av RON i malign transformation av gastric celler till en cancer. I denna studie undersöker vi uttrycket av RON i magsäckscancer vävnad av 98 patienter som använde Envision immunohistokemi (IHC) metoden. För att undersöka uttryck av RONΔ165 utfördes Western blotting av färsk gastric carcinoma vävnad utförs. De patienter som ingick i vår studie följdes mellan 3 och 89 månader efter operation för att undersöka sammanslutning av RON uttryck, inklusive dess splitsningsvariant, till kliniskt patologiska egenskaper hos magsäckscancer och prognos. På grund av den komplexa patogenesen för gastrisk carcinom, har terapeutisk effektivitet inte visat sig vara mycket effektiv. Således är det viktigt att undersöka patogenesen för gastrisk carcinom att finna nya terapeutiska mål.
Metoder
patientprover
Paraffin inbäddade vävnadsprover från 98 patienter som genomgick kirurgi för patologiskt bekräftad gastrisk carcinom i första Anslutna sjukhuset College of Medicine i Zhejiang University mellan 1998 och 2003 erhölls. Gastric prover användas med tillstånd av patienterna och tillstånd från etiska kommittéer på sjukhus. Sjuttio män och 28 kvinnor i åldrarna från 21 till 76 år (medianålder 58 år), ingick i studien. Patient diagnos ingår 78 fall av sinus ventriculi cancer, 16 fall av gastric cardia cancer, och 4 fall av total gastric carcinoma. Post-kirurgi patologiska rapporter diagnostiserade 2 väl differentierade adenokarcinom, 21 måttligt differentierade adenokarcinom 69 dåligt differentierade adenokarcinom en klackring cellscancer, 2 slem adenocarcinom, och 3 svår dysplasi med cancerization. Enligt UICCTNM (1998), var den histologiska grad av proverna bestämdes att omfatta 26 steg I fall 14 fas II-ärenden, 30 stadium III fall och 28 stadium IV fall. Uppföljningsgraden för våra patienter var 92%, med 8 patienter inte tillgängliga för att slutföra uppföljningen. Den uppföljningsperioden var mellan 3 och 89 månader (median på 22 månader) efter operation. Tio prover av normal magslemhinna undersöktes som kontroller. Nitton prov av färskt magkarcinom vävnad, paraneoplastiska vävnad, och positiv perigastric lymfkörtelvävnad uppsamlades för Western blot-analys. Tio prover av normal magslemhinna ingick också som kontroller.
Immunohistokemi
Paraffin prover uppställd i 4 pm tjocka skivor som avparaffinerades, hydrerad och inkuberades under 20 minuter i 0,3% H 2O 2 för att inhibera endogen peroxidasaktivitet. För antigenåtervinning, togs prover inkuberades med 0,1 M citratbuffert (pH 6,0) och upphettades i en tryckkokare under 8 min. Efter sköljning i TBS, ades objektglasen inkuberades med 3% normalt donkey serum (NDS) i TBS under 20 min för att förhindra icke-specifik bindning av den första antikroppen. Anti-RON kanin monoklonal antikropp Ron β (C-20) (Santa Cruz Biotechnologies, USA) användes vid 1: 400. Envision kit (DAKO) användes enligt tillverkarens anvisningar, och bunden antikropp detekterades med hjälp av DAB. Prover också co-färgades med hematoxylin. Prover observerades under ett ljusmikroskop och en PBS enbart färgning prov användes som en bakgrundskontroll.
Bedömningskriterier för RON detektering genom immunhistokemi
Bedömningen av graden av färgning bestämdes under användning av en blindad utvärderingsförfarande av erfarna patologer. Hög effekt fält (400 ×) genom att använda standardljusmikroskop delades in i tio sektioner som var slumpmässigt görs. Tumörceller med buffy partiklar i intracytoplasm bedömdes som positiv, och den procentuella andelen positiva tumörceller och färgningsintensitet för varje prov registrerades. Tumörceller som inte färgas för RON uttryck bedömdes som negativt, celler som svagt färgade bedömdes som en måttlig färgning bedömdes med en två och starkt färgande prov bedömdes som 3. Av de positiva tumörcellerna upptäcks < 5% var negativa, mellan 5 och 24% bedömdes som en, 25-49% poängsattes med en 2, och > 50% bedömdes med en 3. Den kumulativa poängen av tumörcellerna identifierade i ett prov bestäms ett prov slutpoängen. Baserat på slutresultatet, var tumörvävnaden bestämdes vara negativa (poäng 0-2), eller positiv (poäng 3-6) för RON uttryck.
Protein immunoblotting
Femtio mikrogram totalt protein för varje prov separerades genom elektrofores på en 10% polyakrylamidgel och överfördes till PVDF-membran (Millipore). Detektion av RON-protein utfördes med användning av en anti-RON kanin monoklonal antikropp Ron β (C-20) (Santa Cruz Biotechnologies, USA) (1: 400). Antikroppsbindning visualiserades genom användning av en anti-kanin-antikropp konjugerad till pepparrotsperoxidas och en förstärkt kemiluminescens kit (ECL) (Biological Industries, Inc. Israel). β-aktin användes som en laddningskontroll.
Statistisk analys
SPSS 13,0 statistisk programvara användes för att identifiera den statistiska signifikansen av våra data med hjälp av fyrfaldiga tabeller eller R × C bord χ 2 test. Överlevnadskurvorna utvärderades med Kaplan-Meier-metoden och jämförelser av överlevnad testades med en log-rank test.
Resultat
RON uttryck i gastrisk vävnad och paraneoplastisk vävnad
RON protein observerades i cytolymph, men inte i kärnsystemet, av gastriska karcinomceller och typiskt framträdde som en buffy granulo-färgning (Fig. 1). Andelen positiva tumörceller och färgningsintensiteten för varje prov registrerades. För de 98 patientprover utvärderades, var RON expression observerades i 56,1% av de gastriska karcinomvävnader (55/98), men inte i prover av normal magslemhinna. I magcancer paraneoplastisk vävnad, som tillvaratogs från mag slemlager 0,5 cm från magcancer proverna var RON protein observerades hos 25,6% av proverna (8/29). Dessa data utgör en betydande statistisk skillnad i RON proteinuttryck mellan magsäckscancer vävnad och dess tillhörande paraneoplastisk vävnad (χ 2 = 7,290, p = 0,007). Figur 1 Detektion av RON-expression genom immunhistochemistry. A, H) Upptäckt av RON i en dåligt differentierad adenocarcinom prov. 200 × och 400 gångers förstoring. B, E) Förstorad bild av RON detektion i ett prov med lågt differentierad gastriskt adenokarcinom. 400 × och 200 gångers förstoring. C) Fastställande av RON i ett prov av klackring cellscancer. 400 gångers förstoring. D) Fastställande av RON i ett prov av måttligt differentierade adenocarcinom. 400 gångers förstoring. F) Fastställande av RON i ett prov av måttligt differentierade adenocarcinom. 200 gångers förstoring. G) Upptäckt av RON i ett prov av klackring cellscancer. . 400 gångers förstoring
RON proteinuttryck i förhållande till patologi magcancer
RON proteinuttryck befanns inte vara förknippad med kön, ålder, eller sjuka regionen (p Hotel > 0,05). Men i magcancer vävnader, desto djupare en cancer cell infiltrerat, var starkare RON-protein som uttrycks (p
= 0,019). RON-proteinuttryck konstaterades också att positivt korrelerar med perigastric lymfkörteln metastasering och klinisk patologi scenen med statistisk signifikans (p
= 0,019, p
= 0,001) (tabell 1). Däremot fanns inga signifikanta statistiska skillnader i RON uttryck med patologi gradering, Borrmann typ, eller förekomst av metastaser. Emellertid observerades att RON expression var starkare i Borrmann III /IV-gruppen (63,6%) än i Borrmann I /II-gruppen (53,8%), starkare i en avlägsen metastas gruppen (68,2%) än i den icke-avlägsen metastaser gruppen (52,6%), och starkare i histologiskt lägre differentierad grupp (52,4%) än i den måttligt och högt differentierad histologi grupp (39,1%). Det fanns inga signifikanta statistiska skillnader för dessa jämförelser (p = 0,209; p = 0,400; p = 0,196) (tabell 1) .table ett Förhållandet mellan RON uttryck för patologi parametrar
vid RON
RON
Χ2
p
(+) (%) Review ( -) katalog Invasive Djup
tidig magcancer
5 (29,4) katalog 12
infiltrerade till muskelskiktet
15 (51,7) katalog 14
7,795
p = 0,019
infiltrerade till serös hinna
35 (67,3) katalog 17
TNM Stage
Stage
14 (35,0) katalog 26
12,245
p = 0,001
Stage
41 (70,7) katalog 17
Metastaser till lymfkörtlarna
N0
11 (37,9) katalog 18
N1-3
44 (63,8)
25
5,535
p = 0,019
Borrmann Grade
I /II-gruppen
14 (53,8) katalog 12
III /IV grupp
35 (63,6 ) katalog 20
0,708
p = 0,400
övriga
6
11
Histologi Grade
Måttligt & mycket differentierad
9 (39,1) katalog 14
1,577
p = 0,209
Mindre differentierade *
39 (54,2) katalog 33
övriga **
0
3
fjärrmetastaser
M0
40 (52,6) katalog 36
1,675
p = 0,196
M1
15 (68,2) Review 7
* Inkluderar dåligt differentierad adenokarcinom, klackring cellscancer, mucinous adenokarcinom; ** Svår dysplasi med cancerization.
RON uttryck och överlevnad
För 90 patienter som ingick i denna studie som följdes efter operativt, sågs ingen signifikant statistisk skillnad i överlevnad hittades mellan patienter med RON-positiv magsäckscancer prover kontra RON-negativa gastriska karcinom prover (Fig. 2). Figur 2 Överlevnad kurva för RON + kontra RON-patienter.
detektion av RONΔ165 splitsningsvarianten
I 19 prover av färska gastric karcinomvävnader samlas, tillsammans med motsvarande paraneoplastiska vävnader, och patologiskt bekräftade perigastric lymfkörtlar med metastaserande, skarven variant av RON, RONΔ165, uttrycktes. Däremot var ingen expression av RON-protein observeras i normal magslemhinna eller normal lymfkörtelvävnad (Fig. 3, 4). Figur 3 Western blot-analys av RON uttryck i magsäckscancer vävnad, paraneoplastisk vävnad och perigastric lymfkörtlar. Duplikatprov av magkarcinom vävnad (T), paraneoplastiskt vävnad (P), och metastatisk lymfkörteln (L) vävnader analyserades för expression av RONΔ 165 (165 kDa). Normal magslemhinna (N) och normal lymfkörtel (NL) vävnadsprover jämfördes. β-aktin (44 kDa) användes som en laddningskontroll.
Figur 4 Western blot-analys av RON-expression i magkarcinom vävnad, paraneoplastiska vävnad, och normal magslemhinna. Duplikatprov av magkarcinom vävnad (T) och paraneoplastisk vävnad (P) analyserades för expression av RONΔ165 (165 kDa) och jämfördes med normala magslemhinna (N) vävnadsprover. Markör (M) och en positiv kontroll (PC) (160 kDa) inkluderades.
Diskussion
I den aktuella studien visar vi genom både IHC och Western blot, att RON expression inte är detekterbar i normal magslemhinna. Dessa observationer överensstämmer med resultat från Okino et al [8]. Men färgning av RON i karcinomvävnader och motsvarande paraneoplastiska vävnader genom IHC visade signifikant uttryck av RON i förhållande till normala magslemhinnan prover. Western blot-analys gav mer specifik information om RON uttryck med detektion av RONΔ165 i magcancer vävnader, motsvarande paraneoplastiska vävnader och lymfkörtlar med carcinoma metastaser. Dessa data indikerar att uttryck av fullängds RON, samt en variant av RON, uttrycks under processen med malign transformation av gastriska epitelceller. Baserat på dessa data och arbete i andra studier om vilken roll RON i tumörogena fenotyper, hypotes vi att RON kan fungera som en onkogen för att främja förekomsten, progression, invasion och metastas av magcancer.
Tidigare studier har visat att uttryck av RON korrelerar med invasion av tumörceller. Maggiora et al [9] rapporterade att RON uttrycktes i 55% av äggstockscancervävnader. Dessutom, om en äggstockscancer cellinje som starkt uttrycker RON induceras av MSP, tumörtillväxt och invasion är betydligt bättre. Baserat på dessa data, var det en hypotes att RON spelar en roll i utvecklingen av äggstockscancer. På samma sätt, Chan et al [10] visade att uttryck av RON främjat tillväxten och malign transformation av hud papillom, och Cheng et al [6] visade att starkt uttryck av RON i blåscancercellinjer korrelerade med ökad spridning och apoptos inhibition. Den senare studien visade också att uttrycket av RON i magcancer positivt korrelerad med den invasiva djup gastric cancercellen och lymfkörtlar metastasering, och nivån av uttryck ökade avsevärt med högre kliniska patologier av magcancer. Därför kan starkt uttryck av RON i magcancer vävnader fungera som en markör för att indikera en omvandling av normala celler till en malign fenotyp, som förknippas med ökad tumörcellinvasion och metastas, skulle vara förenad med en dålig prognos för långsiktig överlevnad. Närheten av gastric cancer vävnad till den epiteliala dysplasi i magen resulterar i att känsligheten hos epitelial dysplasi av magen till precancerous lesions. Därför genom att rapportera ett uttryck för RON i paraneoplastisk vävnad, som samlades ~ 0,5 cm från magcancer prover ger vi data för att stödja vår hypotes att RON spelar en viktig roll för att främja magcancer och kan tjäna som en markör för omvandlingen av vävnader till en malign fenotyp.
i tidigare studier som tittar på sambandet mellan RON uttryck och överlevnad, Lee et al [11] fann att MET och RON var oberoende prognostiska faktorer långsiktiga återfall av bröstcancer, och att exemplar positivt för MET och RON uttryck hade en signifikant lägre 10-års sjukdomsfri överlevnad. På samma sätt, Cheng et al [6] rapporterade en lägre överlevnad för blåscancer positivt för både MET och RON. Däremot fann vi att överlevnaden av patienter positiva för RON uttryck inte var lägre än överlevnaden för RON-negativa patientgruppen. Det är möjligt att överlevnaden av patienter med magsäckscancer kan påverkas av många faktorer, och våra uppföljningsdata inte var tillräcklig för att ge ytterligare insikt i vilka faktorer som kan vara viktigt.
Slutsats
Resultatet av detta studie visar att RON uttrycks i gastric cancer, men inte i normal magslemhinna. Dessutom uttrycket takten RON i magcancer korrelerar positivt med den invasiva djup, den kliniska patologiska stadiet, och omfattningen av lymfkörtelmetastaser. Vår hypotes är att RON spelar en viktig roll i uppkomsten, progression, invasion och metastas av magcancer, och kan därför vara en viktig markör för att bedöma den biologiska beteende magcancer. Resultaten av våra studier ger en grund för att ytterligare identifiera de mekanistiska detaljerna i roll RON i magcancer för att identifiera RON som ett terapeutiskt mål i magcancer.
Deklarationer
Tack
Detta arbete har finansierats av vetenskaplig forskning Grant Hälso Bureau of Zhejiang-provinsen (nr 491.010-W10380) (nr 2006B039) och Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen, Kina (nr Y2080168).
Authors 'ursprungliga lämnat filer för Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 12885_2008_1291_MOESM1_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 1 12885_2008_1291_MOESM2_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 2 12885_2008_1291_MOESM3_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 3 12885_2008_1291_MOESM4_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 4 Konkurrerande intressen
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande intressen.

• Laparoscopic justerbara bandad roux-en-y gastric bypass som en primär förfarande för super-super-feta (BMI > 60 kg /m2)
• Ökad risk för magcancer efter behandling av primär gastric diffusa stora B-cells lymphoma