Una posible implicación de hemo oxigenasa-1 mediada por Nrf2 sobre regulación en efecto protector del pantoprazol inhibidor de la bomba de protones contra el daño gástrico inducido por indometacina en rats

Una posible implicación de Nrf2 mediada hemo oxigenasa-1 sobre regulación en efecto protector de la inhibidor de la bomba de protones pantoprazol contra el daño gástrico inducido por indometacina en ratas
Resumen Antecedentes

bomba de protones es una proteína de membrana que es ubicuo casete de unión a ATP (ABC) involucrado en muchos procesos de transporte en todos los organismos vivos, entre el que una forma especializada de la bomba, llamada bomba de protones p
de tipo, existe en las células parietales del estómago. A pesar de inhibidores de la bomba de protones (IBP) se prescriben con frecuencia para evitar que los fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) inducida por el daño gástrico, las acciones de supresión de ácido no bastan para explicar.
Métodos
Con el fin de documentar los efectos de pantoprazol , uno de los IBP, por el daño gástrico inducido por AINE, in vitro e in vivo
se realizaron estudios
. La inmunocitoquímica, análisis de transferencia Western, ensayo de cambio de movilidad electroforética y RT-PCR se llevaron a cabo para evaluar la inducción de la hemo oxigenasa-1 (HO-1) a través de la activación de Nrf2 en las células normales de la mucosa gástrica RGM-1 o in vivo
tejidos del estómago de las ratas tratadas con indometacina y /o pantoprazol.
resultados
pantoprazol activan Nrf2 través de la inactivación de Keap1, después de lo cual la expresión de HO-1 se incrementó significativamente de una manera dependiente de la dosis en las células RGM-1. Se observó una mayor actividad máxima de unión se-ADN en 1 h con 300 mM de pantoprazol. La expresión de HO-1 inducida por pantoprazol se asoció significativamente con la formación de tubos in vitro aumento
(P
< 0,05) y los factores angiogénicos incluyendo VEGF, bFGF, y HIF-1α. La indometacina aumentó notablemente la expresión de TNF-α, IL-1ß, IL-8, NOX-1, ICAM-1 y VCAM, mientras que pantoprazol disminuido significativamente las expresiones de inducidas por indometacina estos mediadores de la inflamación de acuerdo con pantoprazol inducida por HO-1 (P Hotel < 0,05) como se documenta con HO-1 inhibidor. En el modelo vivo
de daño gástrico inducido por indometacina pudo validar in vitro
resultados en -drawn que pantoprazol notablemente protegidos contra el daño gástrico inducido por indometacina, en el que la protoporfirina de cinc (5 mg /kg, ip
) abolió significativamente la eficacia protectora de pantoprazol.
Conclusión
Estos resultados demuestran que mediada por Nrf2 HO-1 inducción de IBP proporcionó un efecto protector significativo contra el daño gástrico inducido por AINE más allá de las acciones supresoras de ácido.
Palabras clave
Heme oxigenasa-1 inhibidor de la bomba de protones AINE inducida gastropatía Antecedentes Nrf2
AINE tienen volúmenes de venta con receta enormes en su mayoría sobre la base de los dos beneficios siguientes, una es un aumento de pacientes de edad que requiere AINE prescripción para aliviar el dolor degenerativa cambio inducido y el otro es una ensayo adicional, ya sea para la prevención de pólipos en el colon o el escape de enfermedades cardiovasculares isquémicos [1, 2]. Sin embargo, la gran uso de AINE se ve limitada por los efectos adversos problemáticos tales como la erosión gástrica /úlcera, complicada hemorragia de las úlceras, y de las complicaciones más graves que surgen en el intestino delgado y colon. Dado que la acción farmacológica de los AINE es a través de la inhibición de la prostaglandina síntesis (PG) a través de la supresión de las ciclooxigenasas (COX) [3], disminución indiscernible de gastroprotector prostaglandina E 2 (PGE 2) es responsable de estos gastrointestinal (GI) efectos adversos. Aunque la invención del inhibidor selectivo de la COX-2, coxib, para garantizar la seguridad GI se ha sugerido como la estrategia de resolución, esta solución también tiene que mejorar. Aunque los AINES se utilizan como fármacos antiulcerosos potentes, los mecanismos de toxicidad descubierto adicional AINE [4, 5] nos llevará a desarrollar agentes más potentes y más seguros.
En la actualidad, las indicaciones geográficas relacionadas con el AINE la mejor opción para la prevención toxicidad es o bien la combinación de los AINE e inhibidores de la bomba de protones (IBP) o la elección de coxibs [6, 7]. Dado que la tasa de curación de las úlceras gastrointestinales durante el uso continuo de los AINE fue mayor en el grupo de IBP que el grupo de tipo histamina 2 antagonista de los receptores (H2-RA), los IBP se han preferido de H2-RA para hacer frente a los efectos adversos de los AINE [8, 9 ]. Además de las acciones supresoras de ácido fundamentales de los IBP, varias funciones han sido reveladas que son la reducción de la señalización pro-apoptóticos, restauración ácido-independiente de la proliferación y la reparación de las vías [10], una reducción en el daño oxidativo de la mucosa, la acción de promoción de la curación, y el retículo endoplásmico mecanismo de eliminación de tensiones [11-16]. Hahm et al.
[17-19] también han informado de que los IBP muestran las actividades potenciales contra el cáncer como agentes terapéuticos basados ​​en la inducción selectiva de la apoptosis, anti-angiogénesis frente a Helicobacter pylori
carcinogénesis -asociado, y acciones anti-mutagénicos directos durante la tumorigénesis. Sin embargo, los mecanismos responsables de los efectos protectores de los IBP en AINE inducidos daño gástrico no se habían determinado.
Hemo oxigenasa-1 (HO-1), una inducible para la primera y limitante de la velocidad de la enzima de la degradación de heme, ha sido conocida para proteger contra la citotoxicidad de estrés oxidativo y la muerte celular apoptótica así como la condición inflamatoria [20, 21]. efectos protectores Fundamentales de HO-1 frente a la inflamación son mediados a través de la degradación del hemo anti-oxidante, pero también se asocia con la producción de los mediadores antiinflamatorios, para la que redox dependientes de factor de activador transcripcional, relacionada con el NF-E2 2 (Nrf2), y su fosforilación /activación, y la oxidación de Kelch proteína similar a ECH-asociando 1 (Keap1) se sugiere de manera mecánica [22-24]. Dado que la expresión de HO-1 ha sido inducida por anti-oxidante, anti-inflamatorio, y las respuestas que alivian el isquémicos, en el estudio actual, la hipótesis de que los efectos protectores de los IBP contra el daño gástrico AINE inducida pueden estar relacionados con HO-1 y la consiguiente supresión de ácido más allá de la angiogénesis innata. En conjunto, nuestros resultados demuestran los nuevos mecanismos que los IBP inducen la expresión de HO-1 a través de la activación de Nrf2 /inactivar Keap1 acompañado con la remuneración de cambio isquémico y la atenuación de mediadores inflamatorios, facilitando de ese modo la protección contra el daño gástrico inducido por indometacina.
Métodos
Materiales y cultivos celulares
La indometacina se adquirió de Sigma Aldrich (Saint Louis, MO) y pantoprazol se proporcionan desde Amore Pacific Pharmaceutical Co. (Seúl, Corea). Los anticuerpos para β-actina, HO-1, α-tubulina, Keap1, Nrf2 y VEGF se obtuvieron todos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). células de rata normal de la mucosa gástrica RGM-1 fueron proporcionados por el Prof. Hirofumi Matsui, MD, PhD (Tsukuba Univ., Japón), se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene 10% (v
/v
) de suero bovino fetal, 100 U /ml de penicilina. células endoteliales vasculares umbilicales humanas (HUVEC) se cultivaron en medio M199 (Pantalla InnoPharma, Seúl, Corea). Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2. Las cantidades apropiadas de células RGM-1 o HUVEC se sembraron y se incubaron durante 24 h, a continuación se trataron con la dosis indicada de pantoprazol o indometacina y se incubaron durante los tiempos indicados. HUVECs se trasladó a 1% de O 2 y 5% de CO cámara 2 hipoxia y se incubó durante 0-12 horas para el ensayo in vitro
la formación del tubo en.
De resonancia de spin electrónico (ESR) y la espectroscopia ROS medición generación
diversas concentraciones de pantoprazol añadió a un volumen total de 200 l que contenía FeSO 0,05 mM 4, mM H 1 2O 2, 1 mM de 5,5-dimethylpyrroline-N-óxido de (DMPO, Sigma Aldrich, Saint Louis, MO), y 50 mM de fosfato de sodio a pH 7,4 a temperatura ambiente. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de H 2O 2. Después de incubación durante 1 min, partes alícuotas de las reacciones se transfirieron a una celda de cuarzo y el espectro de DMPO-OH se examinó utilizando un espectrofotómetro de ESR (JES-TE300, JEOL, Tokio, Japón) bajo las siguientes condiciones: campo magnético, 338,0 ± 5.0 mT; potencia de microondas, 4,95 mW; frecuencia, 9.421700 GHz; amplitud de modulación, 5 mT; tiempo de barrido, 0,5 min; y la constante de tiempo, 0.03 s. contenido celular ROS se midieron incubando el control o pantoprazol tratados RGM-1 células con 10 mM H 2DCF-DA (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) durante 30 min. Se midió la fluorescencia utilizando un microscopio láser confocal (LSM710, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).
Análisis de transferencia de Western
células tratadas se lavaron dos veces con PBS y después se lisaron en tampón de lisis celular enfriada en hielo (Cell Signaling Technology) que contiene 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, Sigma Aldrich). Las proteínas de los lisados ​​se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas, que se incubaron con anticuerpos primarios, se lavó, se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa, se lava posteriormente y, a continuación visualizado utilizando un aumento de quimioluminiscencia sistema (ECL) ( GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido).
electroforética cambio de ensayo de gel de movilidad (EMSA)
nuclear y las fracciones citoplasmáticas se extrajeron mediante NE-PER nucleares y citoplasmáticos reactivos (Pierce, Rockford, IL), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. elemento de respuesta antioxidante (ARE) sonda de oligonucleótidos, 5'-TTT TCT TCG AGG GAG TCA TCC G-3 ', y HIF-1α sonda de oligonucleótidos, 5'-TCT GTA CGT GAC CAC CAC ACT CTC-3', se marcó con [ ,,,0],γ- 32P] ATP utilizando polinucleótido quinasa de T4 (Promega, Madison, WI) y separado de no incorporada [γ- 32P] ATP por filtración en gel utilizando una columna de centrifugación nick (GE Healthcare). Antes de añadir el 32P-oligonucleótido (1x10 5 cpm), 10 g de extracto nuclear se mantuvo en hielo durante 15 minutos en tampón de unión de desplazamiento en gel. Para determinar la especificidad de secuencia de la interacción ADN de NF-kB, hemos añadido un exceso de oligonucleótidos no marcados. Después de 20 min de incubación a temperatura ambiente, se añadieron 2 l de 0,1% de azul de bromofenol, y las muestras se sometieron a electroforesis a través de PAGE no desnaturalizante 6% a 150 V en una habitación fría. Por último, los geles se secaron y se expusieron a película de rayos X (Kodak, Rochester, NY).
Inmunocitoquímica
Las células tratadas en la cámara de diapositivas fueron fijadas en un 3,7% de formaldehído durante 15 min. Después del lavado, las células fueron bloqueadas en solución de BSA al 5% que contenía 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 1 h a temperatura ambiente, y después se incubaron con el anticuerpo primario (1: 100) durante 12 horas a 4 ° C. Después, las células se lavaron 3 veces, se incubaron con anticuerpo secundario (1: 300) durante 1 h, y después con 4 '6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 100 ng /ml) durante 1 min a temperatura ambiente. Después de lavar 3 veces, las células se montaron con el reactivo antifade Prolong Gold (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). La fluorescencia se visualizó con un microscopio láser confocal (LSM710, Carl Zeiss).
De aislamiento de ARN y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR)
Después del tratamiento, se retiró el medio por aspiración y las células se lavaron con fosfato de Dulbecco -buffered solución salina (DPBS) dos veces. RiboEX (Gen Todo, Seúl, Corea) se añadió a las placas, que se incubaron a continuación durante 10 minutos a 4 ° C. RiboEX se recogió y se colocó en un tubo de 1,5 ml, y se añadió cloroformo y se mezcló suavemente. Después de la incubación durante 10 min en hielo, las muestras se centrifugaron a 10.000 xg durante 30 min. Los sobrenadantes se extrajeron y se mezcla con isopropanol, y mezclas se incubaron a 4 ° C durante 1 h. Después de centrifugar a 13.000 g durante 30 min
, pellet se lavó con 70% (v
/v
) etanol. Después de permitir que el etanol se evapore completamente, los pellets se disolvieron en pirocarbonato (DEPC) de agua tratada dietilenglicol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Se preparó ADNc utilizando transcriptasa inversa derivada de murina Maloney virus de la leucemia (Promega, Madison, WI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PCR se realizó más de 30 ciclos de: 94ºC durante 20 s, 58ºC durante 30 segundos y 72 ° C durante 45 segundos. Los cebadores de oligonucleótidos para PCR (Tabla 1) fueron adquiridos de Bioneer (Daejeon, Corea). Todos los QRT-PCR experimentos se repitieron por triplicado y la cuantificación se muestran en la media ± 1 SD.Table La secuencia de los cebadores de PCR
GAPDH
El delantero 5'-GGT GCT GAG TAT GTC GTG GA -3 '
Reverse 5'-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3 '
HO-1 | adelante 5'-GAG AGC ATG TCC CAG GAT TT-3'
inversa 5'-GGT GCT TCT TGT TTC GCT CT -3 '
la COX-2
adelante 5'-GAA ATG GCT GCA GAG TTG AA -3'
inversa 5'-TCA TCT AGT CTG GAG TGG GA -3 '
HIF-1α
adelante 5'-AAC AAA CAG CTG AAT TCC TC-3 '
inversa 5'-GGA GAC GGT AAT TCA GCC AG-3'
VEGF
adelante 5'-CAA TGA TGA AGC CCT GGA GT-3 '
inversa 5'-GAT TTC TTG CGC CGT TTT TT-3'
PDGF
adelante 5'-AAG AGG CCA TTC CCG CAG TT-3 '
inversa 5'-CTA ACC TCA CCT CCT GGA TC -3 '
bFGF
adelante 5'-GAA TAT GGA AGA TGG ACG GC-3'
inversa 5'-AAC AGT ATG GCC TTC TGT CC -3 '
IL-1β
adelante 5'-CAT TGT TGT GGC GGA GAA G-3 '
inversa 5'-ATC ATC CCA CGA GTC ACA GA -3' hotels, IL-8
Delantero 5 ' CAG ACA GTG GGG GCA ATT CA-3 '
inversa 5'-TTG GGG CCC ACA TTT AGC AT-3'
TNF-α
adelante 5'-TAC TGA TCA TCG GGG TGA TT -3 '
inversa 5'-CAG CCT TCT CCC TTG AAG AG-3 '
ICAM-1 | adelante 5'-TGT GCT TTG AGA ACT GTG GC-3'
inversa 5'-GGT TCT GTC CAA CTT CTC AG-3 '
VCAM-1 | adelante 5'-GAG ACA AAA CAG AAG TGG AAT-3'
inversa 5'-TAC AAG TGG TCC ACT TAT TTC -3 '
NOX1
adelante 5'-GAG AAA TTC TCG GAA CTG CC-3 '
inversa 5'-TGT TGG CTT CTA CTG TAG CG-3'
in vitro
angiogénesis ensayo Este ensayo
se realizó utilizando un kit comercial según las instrucciones del fabricante (Millipore, Billerica, MA). Para condiciones de hipoxia, ECMatrix y tampón diluyente se mezclaron para hacer un gel sólido, que luego se sembró en microplacas de 96 pocillos. células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC, 1,0 × 10 5 /ml) se sembraron con control, indometacina, indometacina más pantoprazol, indometacina más pantoprazol más ZnPPIX incubaron a 37 ° C durante 4 h. la formación de tubos se observó bajo un microscopio óptico.
modelo de daño gástrico inducido por indometacina
Un total de 48 ratas fueron adquiridos de Charles River (Osaka, Japón). Los animales fueron manejados en una instalación para animales acreditada de acuerdo con la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALAC International) directrices en virtud del mecanismo llamado CACU (El Centro de Cuidado y Uso de Animales) de Lee Gil cáncer Ya y Diabetes Institute, Gachon Universidad después de la aprobación Institucional de Ética Junta de Revisión. Los animales se dividieron en cuatro grupos que consisten cada uno de 12 ratas y se mueren de inanición durante 24 h antes de la experimentación de la siguiente manera; todas las ratas se les administró una inyección intraperitoneal de la indometacina (10 mg /kg) para provocar daños gástricos, segundo grupo con inyección intraperitoneal de 10 mg /kg de pantoprazol, el tercer grupo con inyección intraperitoneal de 30 mg /kg de pantoprazol, y el cuarto grupo con inyección intraperitoneal de 30 mg /kg de pantoprazol y 5 mg /kg de ZnPPIX para inhibir la actividad de HO-1. Los animales se sacrificaron 16 h después de cada administración. Los estómagos de las ratas se retiraron y se abrieron a lo largo de la curvatura mayor y después se lavaron con soluciones tamponadas de hielo frío de fosfato. Los números de cualquiera de las erosiones o úlceras se determinarán en las fotografías ampliadas. Los homogeneizados obtenidos a partir de mucosa gástrica rayado se mantuvieron en el tanque de nitrógeno líquido hasta el ensayo.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± SD. Los datos fueron analizados por ANOVA de una vía, y la significación estadística entre los grupos se determinó mediante la prueba de rangos múltiples de Duncan. La significación estadística fue aceptada en P Hotel < 0.05.
Resultados
Pantoprazol aumentaron HO-1 de expresión a través de la activación de Nrf2
base en estudios preliminares, se ha encontrado pantoprazol mostró la mayor inducción de HO-1 de expresión en RGM-1 en las células entre los IBP, lansoprazol, rabeprazol , omeprazol, pantoprazol y (datos no mostrados). Pantoprazol aumentó la expresión de HO-1 mRNA y proteína en un dependiente de la dosis de forma (Figura 1A) y el análisis inmunocitoquímico también reveló que el nivel de HO-1 se incrementó significativamente por tratamiento de pantoprazol en el citoplasma de células de RGM-1 en una dosis de manera dependiente (Figura 1B). Para comprender los mecanismos subyacentes a la regulación de la expresión de HO-1 por pantoprazol, se examinaron sus efectos sobre la activación de Nrf2, un importante factor de transcripción que media la expresión dirigida por EPRE ARE /de las enzimas antioxidantes. Cuando se midió el nivel de expresión de Keap1, un represor de Nrf2 en la fracción citoplasmática tratada con 300 pantoprazol mu M en un punto de tiempo diferente, disminuyó significativamente se observó expresión de Keap1 en 1 h (Figura 2a), lo que sugiere que HO-1 podría ser transcrito después del tratamiento pantoprazol través de la activación e inactivación Nrf2 Keap1. Como se ilustra en la Figura 2A, Nrf2 nuclear co-localización fue evidente en las células RGM-1 tratados con pantoprazol. El máximo SE-vinculante actividad de Nrf2 se incrementó en 1 h, así como su localización nuclear inducidos por pantoprazol (Figura 2B). Para determinar la acumulación nuclear de Nrf2, se realizó un análisis inmunocitoquímico utilizando el anticuerpo anti-Nrf2. Como se muestra en la Figura 2C, Nrf2 se transloca en el núcleo con 300 mM tratamiento pantoprazol. Estos resultados sugieren consistentemente que pantoprazol podría aumentar los niveles de HO-1 a través de la activación transcripcional de Nrf2 en las células epiteliales gástricas de rata. Figura 1 Pantoprazol indujo la expresión de HO-1. (A) RT-PCR y Western blot para la expresión de HO-1 de acuerdo con una dosificación diferente de pantoprazol, 30, 100 y 300 mM, respectivamente. Estas cifras son representantes de los resultados obtenidos en 3 experimentos independientes. (B) Confocal de imágenes de HO-1. Pantoprazol aumentó la expresión de HO-1 de una manera dependiente de la dosis en las células de rata normal de la mucosa gástrica RGM-1.
Figura 2 Pantoprazol aumentó translocación nuclear Nrf2 y la inactivación Keap1 citoplasmática, condujo a anti-oxidación significativa. (A) transferencias de Western, ya sea para Keap1 citosólico o nuclear Nrf2 en un momento diferente, en presencia de 300 mM pantoprazol. (B) Ensayo de movilidad electroforética cambio (EMSA) para la actividad de unión están en el ADN. Aumento significativo de unión al ADN de Nrf2 se observó 60 minutos después de la administración de pantoprazol. (C) Imagen confocal de Nrf2 después de una dosificación diferente de pantoprazol, 100 mM y 300 mM. resonancia de espín (D) electrónico (ESR) medición de Fenton reacción genera radicales hidroxilo. (E) Los cambios de fluorescencia DCF-DA después de una dosificación diferente de pantoprazol, 30, 100 y 300 mM. Pantoprazol disminuyó la fluorescencia oxidativa significativamente inducida por H2O2.
Dado que la importancia biológica de HO-1 pantoprazol posee una acción anti-oxidante relacionada con HO-1 inducción. medición de la VSG era mejor manera de rastrear la generación de radicales libres utilizando aducto de giro, para lo cual se generaron radicales hidroxilo utilizando DMPO como un aductor bajo reacción de Fenton. Como se ve en la Figura 2D, pantoprazol 3 mM ejercida la acción de eliminación de clara de DMPO-aducto de generación de radicales hidroxilo. Desde medición ESR fue ejecutado en condiciones de reacción química sistema no biológico y pantoprazol no es un antioxidante profesional, que sin duda contribuyó a eliminar los radicales hidroxilo a pesar de que es relativamente alta concentración de pantoprazol para secuestrar las especies reactivas del oxígeno. Estos resultados químicos de estudio ESR fueron validados con la prueba biológica usando medición de fluorescencia DCF-DA, mostrando que pantoprazol mostraron reducción significativa de DCF-DA en una forma dependiente de la dosis (P
< 0,05, Figura 2E).
acciones angiogénicas como consecuencia de HO-1 | IBP inducidos por pantoprazol se incrementaron las expresiones de VEGF mRNA y proteína en las células RGM-1 (Figura 3A). Con el fin de documentar si la inducción incremental del VEGF con IBP está relacionado con la inducción de HO-1, repetimos los experimentos con IBP solo o co-tratamiento de pantoprazol y protoporfirina de cinc (ZnPPIX) como inhibidor de HO-1. Como resultados, se podría confirmar la expresión de VEGF inducida por pantoprazol y co-tratamiento incremental del ZnPPIX disminuido claramente la expresión de VEGF inducida por PPI en una forma dependiente de la dosis (Figura 3B). A continuación, se investigaron los cambios de factores angiogénicos representativos, bFGF, PDGF, y HIF-1α y observamos estas expresiones relacionados con pantoprazol inducida por HO-1 en la figura 3C. Como se preveía, pantoprazol aumentó significativamente estas expresiones de varios factores angiogénicos. También estas inducciones de bFGF y PDGF se atenuaron significativamente con el co-tratamiento de pantoprazol y ZnPPIX. Con el fin de verificar si estas inducciones de factor angiogénico después de pantoprazol en realidad estaban relacionadas con la angiogénesis, la angiogénesis in vitro
ensayo se realizó (Figura 3D). la formación de tubos se atenuó de manera significativa con 500 indometacina mu M en HUVECs, mientras que 100 M pantoprazol podría superar estos trastornos de la angiogénesis tratado con indometacina. Sin embargo, un tratamiento adicional con ZnPPIX abolió estos beneficios de la superación de la angiogénesis por pantoprazol bajo la administración de indometacina. Estos resultados sugieren que pantoprazol compensado AINE-angiogénesis inducida defectuoso a través de su capacidad de inducción de HO-1. Figura 3 Pantoprazol inducida factores angiogénicos relacionados con la HO-1 inducción. (A) RT-PCR y Western Blot para el VEGF. inducciones significativos de VEGF se observaron con pantoprazol, pantoprazol significativamente después de 300 M (p < 0,05
). Estas cifras son representantes de los resultados obtenidos en 3 experimentos independientes. (B) Los cambios de VEGF y HO-1 con pantoprazol solo o combinación de pantoprazol y ZnPPIX. La inducción de VEGF después de pantoprazol se atenuó significativamente con HO-1 inhibidor, lo que significa la implicación de HO-1 en inducida por VEGF-PPI. Estas cifras son representantes de los resultados obtenidos en 3 experimentos independientes. (C) Otros factores angiogénicos relacionados con pantoprazol. bFGF y VEGF se expresó cada vez más con pantoprazol, pero estas inducciones se atenuaron con HO-1 inhibidor. Estas cifras son representantes de los resultados obtenidos en 3 experimentos independientes. (D) in vitro
ensayo de angiogénesis in. la formación de tubos de HUVEC se redujo significativamente con 50 M indometacina. Pantoprazol compensa la angiogénesis inducida por indometacina defectuosa como se evaluó con el porcentaje de la formación del tubo, mientras que HO-1 inhibidor cancelado estos superar de la angiogénesis inducida por pantoprazol. Estas cifras son representantes de los resultados obtenidos en 3 experimentos independientes.
Inducida por Pantoprazol asalto inflamatoria indometacina asociada HO-1 atenuado
Aunque la indometacina es un agente anti-inflamatorio, que se ha sabido que los AINE indujo daño gástrico a través el aumento de expresiones de mediadores inflamatorios, incluyendo TNF-α, IL-1β, IL-8, y NADPH oxidasa-1 (NOX-1). Como se ve en la figura 4A, 500 M indometacina aumentó significativamente la expresión de TNF-α, IL-1β, e IL-8 en células epiteliales gástricas, mientras que disminuyó la expresión de HO-1, lo que confirma que los mediadores inflamatorios pueden ser mecánica asociados con inducida por indometacina daños en las células del epitelio gástrico. En esta condición, la co-administración de indometacina 500 M y 300 M pantoprazol disminuyó significativamente la expresión de TNF-α, IL-1β, IL-8 y acompañados con aumentos estadísticamente significativos de HO-1 de expresión. Además, el desafío indometacina aumentó significativamente la expresión de NOX-1, en el que el pantoprazol atenuó significativamente el aumento de la expresión de NOX-1, lo que sugiere que HO-1 acciones anti-inflamatorias impuestas inducidos por pantoprazol en virtud de la indometacina. A continuación, con el fin de demostrar aún si estas atenuaciones de mediadores de la inflamación después de pantoprazol son el resultado de la inducción de HO-1, repetimos estos experimentos con la administración ZnPPIX. Como se ve en la figura 4B, el co-tratamiento de ZnPPIX en presencia de pantoprazol suprimió significativamente los beneficios de la acción anti-inflamatoria. Las inducciones incrementales de ICAM-1 y VCAM después del tratamiento con indometacina fueron los responsables de la isquemia de órganos y agravado los daños, en la que se participe, bien de la inflamación vascular o aumento de la agregación de leucocitos. El tratamiento con indometacina aumentó significativamente la expresión de ICAM-1 y VCAM en HUVEC, pero co-desafío de la indometacina y el pantoprazol disminuyó significativamente inducida por indometacina ICAM-1 de expresión correspondiente a un aumento de la inducción de HO-1 (Figura 4C). En esta condición, ZnPPIX no impuso la atenuación de ICAM o VCAM a pesar del tratamiento pantoprazol, asegurando aún más la acción beneficiario de pantoprazol asociado con la inducción de HO-1. Figura 4 Pantoprazol atenuada mediadores de la inflamación inducida por indometacina a través de HO-1. (A) RT-PCR para el TNF-α, IL-1β, IL-8, y HO-1. 500 M indometacina aumentó la expresión de mediadores inflamatorios, incluyendo TNF-α, IL-1β, IL-8, pero disminuyeron significativamente HO-1 de expresión. NOX-1 fue significativamente mayor con la indometacina. Estas cifras son representantes de los resultados obtenidos en 3 experimentos independientes. (B) Pantoprazol disminuyó significativamente inducida por indometacina IL-1β y TNF-α, pero estas acciones beneficiarios de pantoprazol se abolieron con ZnPPIX, lo que lleva a la conclusión de que las acciones antiinflamatorias de pantoprazol se debieron a HO-1 inducción. Estas cifras son representantes de los resultados obtenidos en 3 experimentos independientes. (C) Pantoprazol disminuyó significativamente inducida por indometacina ICAM-1 y VCAM en las células HUVEC, pero estas acciones beneficiarios de pantoprazol también se suprimieron con ZnPPIX como HO-1 inhibidor. Estas cifras son representantes de los resultados obtenidos en 3 experimentos independientes.
Inducida por Pantoprazol HO-1 inducida por indometacina debilitado lesión gástrica
Para investigar el efecto protector de pantoprazol en vivo
, indometacina (10 mg /kg ) se administró por vía intraperitoneal durante 16 h en ratas. El tratamiento con indometacina provocó significativamente las lesiones de la mucosa gástrica incluyendo erosiones hemorrágicas y ulceraciones. Sin embargo, estas patologías gástricas provocadas con indometacina fueron significativamente atenuada con la inyección intraperitoneal de 30 mg /kg de pantoprazol (Figura 5A). Dado que estos efectos protectores de los 30 mg /kg de pantoprazol contra daños gástricos inducidas por indometacina se suprimieron significativamente con el co-tratamiento de la intraperitoneal administrado 5 mg /kg ZnPPIX, se confirmó que la acción protectora de pantoprazol se basa en su capacidad de HO-1 inducción . Cuando las expresiones de HO-1 e ICAM-1 se midieron en los homogeneizados de mucosa de cada grupo, la administración de indometacina redujo significativamente la expresión de HO-1 y el aumento de la expresión de ICAM-1. Sin embargo, debido al aumento de HO-1 expresiones después de pantoprazol, así como niveles significativamente atenuados de ICAM-1, el daño gástrico inducido por indometacina se mejoró proporcionalmente a pesar de desafío indometacina (Figura 5B). Para demostrar cómo pantoprazol mejoró la angiogénesis defectuosa y la isquemia provocada por la indometacina, la EMSA usando HIF-1α se realizó (Figura 5C). El HIF-1α-DNA actividad de unión fue altamente aumentó en el grupo de solo la indometacina, que se redujo significativamente en los homogeneizados gástricos del grupo de tratamiento pantoprazol, significando pantoprazol condición hipóxica aliviado significativamente inducida por indometacina. Tomados en conjunto, los IBP ejercieron una fuerte protección contra el daño de la mucosa gástrica inducida por indometacina a través significativo de HO-1 inducción, que está más allá de la acción supresora de ácido auténtica, aunque no medimos los cambios en la acidez gástrica. Figura 5 pantoprazol previene el daño gástrico inducido por indometacina a través de en función de la inducción de HO-1. (A) media del índice de daños gástricos inducidas por indometacina. (B) RT-PCR para HO-1 e ICAM-1 según el grupo. (C) EMSA para HIF-1α según el grupo. La indometacina aumentó significativamente HIF-1α-DNA de unión, mientras que pantoprazol disminuyó significativamente HIF-1α-DNA de unión de una manera dependiente de la dosis.
Discusión
Antes de la presente investigación, varios investigadores han publicado que los IBP podrían prevenir lesión de la mucosa gástrica por otros mecanismos más allá de la acción de su inhibición específica de ácido [11, 14, 25-28], podríamos añadir más evidencias sobre la acción protectora de los IBP en contra de los AINE. Pantoprazol indujo significativamente la expresión de HO-1 a través de la activación de Nrf2 relevante para acciones anti-inflamatorios, anti-oxidantes, y el alivio de la isquemia. hallazgo novedoso de este estudio diferente de otras investigaciones es que pantoprazol muestra las acciones de protección a la lesión inducida por AINE-ya sea a través de la corrección de hándicap angiogénico o la atenuación de la propensión inflamación.
Becker JC et al.
[16] demostraron que tanto omeprazol y lansoprazol protegidos células epiteliales y endoteliales gástricos humanos contra el estrés oxidativo similar a nuestro estudio, pero utilizan diferentes tipos de IBP. Dado que este efecto fue abrogada en presencia del inhibidor de HO-1, ZnPPIX, HO-1 parece ser un objetivo adecuado de los IBP, tanto en células endoteliales y epiteliales gástricas. En este estudio, se observó intacta hallazgo novedoso que HO-1 inducida por los IBP disminución de la inflamación AINE-incurridos y trastorno angiogénico. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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