Un nuevo método, la exploración del genoma digital detecta la amplificación del gen KRAS en cáncer gástrico: la participación de sobreexpresa KRAS no mutado en la señalización aguas abajo y el crecimiento de células de cáncer

Un nuevo método, la exploración del genoma digital detecta KRAS
amplificación de genes en el cáncer gástrico: la participación de sobreexpresa KRAS no mutado en el crecimiento y la señalización celular de cáncer de aguas abajo
Resumen Antecedentes

El cáncer gástrico es la tercera más común tumores malignos que afectan a la población en general en todo el mundo. la activación aberrante del gen KRAS es un factor clave en el desarrollo de muchos tipos de tumores, sin embargo, las mutaciones oncogénicas de KRAS ¿Cuáles son poco frecuentes en el cáncer gástrico. Hemos desarrollado un método cuantitativo novela de análisis del número de copias de ADN, denominados de exploración genoma digital (DGS), que se basa en la enumeración de los fragmentos de restricción cortos, y que no implique PCR o hibridación. En el presente estudio, hemos utilizado DGS para estudiar las alteraciones del número de copias en células de cáncer gástrico.
Métodos
DGS de líneas celulares de cáncer gástrico se realizó utilizando las secuencias de 5000 a 15000 fragmentos de restricción. Se seleccionaron 20 líneas celulares de cáncer gástrico y 86 tumores gástricos primarios para KRAS
amplificación por PCR cuantitativa, y se investigaron KRAS
amplificación en el ADN, ARNm y los niveles de proteína por análisis mutacional, PCR en tiempo real, el análisis de inmunoblot, GTP desplegable ensayo-ras y el análisis inmunohistoquímico. El efecto de KRAS
fueron examinados por inmunoblot y ensayo colorimétrico, respectivamente derribo de la activación de p44 /42 MAP quinasa y AKT y sobre el crecimiento celular.
Resultados
análisis DGS de la célula de cáncer gástrico HSC45 línea reveló la amplificación de una región de 500 kb en el cromosoma 12p12.1, que contiene el locus del gen KRAS
. se detectó amplificación de la KRAS
locus en 15% (3/20) de las líneas celulares de cáncer gástrico (amplificación 8-18 veces) y 4,7% (4/86) de los tumores gástricos primarios (amplificación 8-50 veces ). KRAS
se identificaron mutaciones en dos de las tres líneas celulares en las que Kras
se amplificó, pero no se detectaron en ninguno de los tumores primarios. La sobreexpresión de la proteína KRAS correlaciona directamente con el aumento del número de copias del gen KRAS
. El nivel de KRAS unida a GTP se elevó después de la estimulación de suero en las células con amplificación del gen KRAS de tipo salvaje
, pero no en las células con KRAS mutado amplificado
. Knock-down de KRAS Hoteles en células de cáncer gástrico que lleva a amplificó KRAS de tipo salvaje
como resultado la inhibición del crecimiento celular y la supresión de p44 /42 MAP quinasa y la actividad de AKT.
Conclusión Nuestro estudio
pone de manifiesto la utilidad de la DGS para la identificación de las alteraciones del número de copias. Usando DGS, identificamos KRAS
como un gen que se amplifica en el cáncer gástrico humano. Hemos demostrado que la amplificación de genes probablemente constituye la base molecular de la sobreactivación de KRAS en cáncer gástrico. Se requieren estudios adicionales utilizando una cohorte más amplia de muestras de cáncer gástrico para determinar las implicaciones diagnósticas y terapéuticas de KRAS
amplificación y sobreexpresión.
Antecedentes
El cáncer gástrico es el tercer cáncer más común que afecta a la población en general en todo el mundo [1 ]. cambios genéticos específicos se han reportado en el cáncer gástrico, incluyendo las ampliaciones de KSAM
, MET Opiniones y ErbB2
, y las mutaciones en p53
, APC
, y CDH1
[2] . Mientras que las mutaciones con ganancia de función del gen KRAS ¿Cuáles son algunas de las alteraciones genéticas más comúnmente observados en una variedad de tumores, incluyendo páncreas (60%), el tracto biliar (33%) y colon (32%) [3], estas mutaciones son poco frecuentes en el cáncer gástrico (2-7%) [4-7]. En general, RAS
mutaciones asociadas con la tumorigénesis "LOCK" RAS en un estado activa unida a GTP. GTP-RAS se une a una serie de proteínas efectoras para estimular las vías de señalización corriente abajo, entre los que la cascada de la quinasa RAF-MAP y las vías fosfatidilinositol -AKT 3-quinasa (PI3K) de crecimiento celular y la oncogénesis son la mejor caracterizada [3]. la activación prolongada de RAS también puede ocurrir a través de mecanismos que no implican mutaciones en RAS. Por ejemplo, la expresión de let-7 microARN, que suprime RAS apuntando a la región 3 'no traducida del ARNm RAS
reducida, a menudo se asocia con un nivel de proteína RAS mayor en los tumores [8]. Hasta la fecha, los mecanismos moleculares de la activación oncogénica de RAS en el cáncer gástrico no han sido totalmente dilucidado.
La amplificación de secuencias genómicas que contienen genes que son críticos para el crecimiento celular es uno de los principales mecanismos de activación de oncogenes en el cáncer, y es a menudo asociada con la progresión tumoral, mal pronóstico y /o resistencia a los medicamentos [9]. De los numerosos métodos actualmente disponibles para la detección de alteraciones en el número de copias del genoma de ancho, el estándar de oro actual es la matriz CGH método (aCGH). En los últimos años, la resolución de aCGH ha mejorado rápidamente mediante el uso de sondas de oligonucleótidos, y ha superado a la de aCGH utilizando sondas BAC estándar [10]. Sin embargo, aCGH también es susceptible al ruido inherente de mediciones de la intensidad basado en la hibridación, como la calidad de la señal se ve afectada por secuencias repetitivas y depende de la calidad de la sonda [11]. De hecho, la optimización del diseño de la sonda ha sido un reto importante en el desarrollo de suelo de baldosas arrays [12, 13]
. Cariotipo digital (DK) fue desarrollado por Wang et al. [14], y no está limitada por los problemas inherentes a las técnicas de matriz. DK implica la enumeración digitales de fragmentos cortos de ADN genómico (etiquetas denominadas), proporcionando una medición cuantitativa del número de copias de ADN a través de análisis de la densidad de etiquetas a lo largo de cada cromosoma. DK ha sido aplicado con éxito a una variedad de tipos de tumores para detectar alteraciones del número de copias, incluyendo la amplificación de TYMS
, RSF1 Opiniones y OTX2
, y la supresión de MKK4 Opiniones y distrofina
[ ,,,0],15-19]. A pesar de la eficiencia de DK, es técnicamente difícil para aplicaciones generales, ya que implica la amplificación por PCR y la generación de etiquetas de pares 21-de bases (pb) de longitud para representar con precisión la localización cromosómica de interés.
Presentamos aquí la desarrollo de un nuevo método, denominado DGS, para el análisis cuantitativo de la variación del número de copias, que se basa en el concepto de la etiqueta de recuento de DK, pero utiliza un proceso simplificado de preparación de etiquetas. DGS de líneas celulares de cáncer gástrico detectó la amplificación de las KRAS
locus en el cromosoma 12p12.1. Nuestros resultados proporcionan una base molecular para la sobreactivación de KRAS, y sugieren que la activación de eventos de señalización corriente abajo del gen KRAS puede promover la proliferación de células de cáncer gástrico.
Métodos
líneas celulares y tejidos México La líneas celulares analizadas en el actual estudio se enumeran en el archivo adicional 1. Las líneas de células HSC y SH101P4 fueron establecidos por Kazuyoshi Yanagihara [20]; todos los demás se obtuvieron de American Type Culture Collection o la colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación (Tokio, Japón). Todas las líneas celulares se cultivaron en los medios recomendados. Para la estimulación con suero, las células se incubaron en medios que carecían de suero durante 24 horas (h), y luego o bien sin estimular o se estimularon durante 1 h con medio que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS). especímenes de cáncer gástrico primarios se obtuvieron del Departamento de Cirugía, Hospital Keiyukai Sapporo, con el consentimiento informado de cada paciente. ADN genómico fue extraído mediante el método de fenol-cloroformo, seguido de tratamiento con RNasa. El ARN total se extrajo utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN genómico de los leucocitos normales de sangre periférica (Biochain, Hayward, CA, EE.UU.) y el ARN total de mucosa gástrica normal de individuos sanos (Biochain y Invitrogen) fueron adquiridos. cánceres gástricos primarios se clasifican utilizando las características clínico-patológicas, como se muestra en el archivo adicional 2, de acuerdo con el esquema de clasificación pTNM (5ª edición, 1997) [21] y el sistema de clasificación de la Lauren [22]. KRAS
estado -amplification acuerdo con la edad se comparó mediante la prueba de la t de Student; según el grado, estado del PT, el estado de pN, y estadio de la enfermedad mediante la prueba de Mann-Whitney; y según el sexo, la histología y el estado pM usando la prueba exacta de Fisher. Todas las pruebas fueron de 2 colas, y una
valor de p < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Exploración genoma Digital Brevemente, 40 mg de ADN genómico se sometieron a digestión con enzimas de restricción usando Mbo
I (Takara, Tokio, Japón) y luego se separó por electroforesis en un 3% Nusieve GTG gel de agarosa. fragmentos cortos (30 a 60 pares de bases, denominadas etiquetas reales) se electroeluyeron, concatenados y se subclonó en Bam HI-
digerido pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando la solución de ligación de ADN Mix Mighty (Takara). Escherichia coli DH10B
se transformaron con los plásmidos recombinantes, los transformantes se agruparon y el ADN del plásmido se purificó para generar la primera biblioteca. Concatemers de etiquetas reales fueron extirpados por Spe
I /Pst
I digestión de la primera biblioteca, y fragmentos en el intervalo de 140 a 800 pb se electroeluye, se concatenan y se subclonaron en pBluescript II KS + para generar la segunda biblioteca. plásmidos que contienen concatemers segunda biblioteca de Spe
I /Pst I
fragmentos se secuenciaron utilizando un Analizador Genético ABI3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. etiquetas reales únicos fueron asignadas a secuencias de los cromosomas humanos, y la densidad de la etiqueta, que se define como la relación de etiquetas reales a las etiquetas virtuales a través de ventanas en movimiento, se calculó para detectar anormalidades en el contenido de ADN utilizando valores de umbral definidos por simulaciones DGS. Tag posiciones y relaciones de densidad etiqueta se visualizaron utilizando pistas personalizadas y gráficos Genoma de la Universidad de California, Santa Cruz (UCSC) genoma navegador (Marzo de 2006 congelación, hg18) [23-25]. Los protocolos detallados para la DGS, caracterización etiqueta virtual y simulaciones in silico
están disponibles en el archivo adicional 3.
cuantitativa en tiempo real PCR
número de copias de ADN relativa se determinó por cuantitativos PCR en tiempo real utilizando un SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) y el ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). contenido de ADN por genoma haploide se normalizó a la de un elemento repetitivo, Line-1, y se calcula por la CT comparativa (ΔΔCT) método de cuantificación relativa mediante la fórmula 2 (Nt
- nLinea
) - ( xt CD - Xline
), donde N
t
es el número de ciclo umbral observado para una imprimación experimental en el ADN de leucocitos normales, N
línea es
el número de ciclo umbral observado para el cebado de la línea-1 en el ADN de leucocitos normales, Xt
es el número medio ciclo umbral observado para el cebador experimental en el ADN de las células cancerosas, y X
línea es la
número medio ciclo umbral observado para el cebador Line-1 en el ADN de células de cáncer [14]. amplificación genómica se define como un incremento mayor que 4 veces en el contenido de ADN. Las secuencias de los cebadores para cada locus están disponibles en el archivo adicional 4. La proporción de alelos mutantes del gen KRAS
(G12V, GGT → GTT) se determinó mediante el empleo de un procedimiento de PCR en tiempo real modificada de acuerdo con Itabashi et al
[26 ]. El protocolo detallado está disponible en el archivo adicional 3. Se preparó ADNc utilizando superíndices III de la transcriptasa inversa (RT, Invitrogen), y el nivel de ARNm de cada gen se determinó por el tiempo real RT-PCR utilizando la expresión TaqMan Ensayo del gen (Applied Biosystems) . relativa niveles de mRNA se calcularon por el método comparativo CT usando GAPDH
como control endógeno. Los conjuntos de cebadores /sondas utilizadas se muestran en el archivo adicional 5.
fluorescencia de hibridación in situ
(FISH)
BAC que contenían el gen KRAS
locus (RP11-636P12) y el cromosoma 12q24.2 (RP11 -91M21) fueron etiquetados con Cy3 y Cy5, respectivamente, y después se incubó con portaobjetos preparados con interfase y en metafase cromosomas. Los núcleos fueron contra el teñidas con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI), y las diapositivas se analizaron usando un microscopio de fluorescencia (Leica CW-4000). El análisis mutacional del gen KRAS Red de
y PIK3CA

amplificados fragmentos genómicos o bien se secuenciaron directamente o subclonaron usando el kit TOPO TA-clonación (Invitrogen) y luego se secuenció. Al menos diez clones a partir de dos ensayos de PCR independientes por locus fueron secuenciados utilizando M13 adelante y atrás primers (Invitrogen). Las secuencias de los cebadores utilizados para la amplificación del gen KRAS
(exones 1 y 2) y PIK3CA
(exones 9 y 20) se muestran en el archivo adicional 6. El análisis por inmunotransferencia

Las células fueron lisadas en Lisis tampón que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) tampón, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton X, 10% de glicerol, mM NaF 10, vanadato de sodio 1 mM, 50 mM β-glicerofosfato, 1 mM de fluoruro de phenylmethansulfonyl , ditiotreitol 1 mM, y un cóctel inhibidor de la proteasa (Roche, Mannheim, Alemania). Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y electrotransferencia sobre una membrana Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Las membranas se analizaron por inmunotransferencia usando los siguientes anticuerpos, como se indica: monoclonal de ratón anti-KRAS, -NRAS, y -HRAS anticuerpos (sc-30, sc-31, y sc-29, respectivamente, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.); anticuerpo anti-actina (Millipore); policlonal de conejo anti-p44 /42 MAP quinasa, -phosho-p44 /42 MAP quinasa (Thr202 /Tyr204), -Akt y -phospho Akt-(Ser473) antisueros (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.).
desplegable ensayo GTP-RAS Francia El activación de RAS se detectó utilizando un kit de activación de Ras EZ-Detect (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Brevemente, lisado de células (500 g) se incubó con inmovilizada RAF1 Ras-dominio de unión fusionada a la glutatión S-transferasa (GST-Raf1-RBD). Los precipitados se lavaron 3 veces, y las proteínas unidas se eluyeron por ebullición durante 5 minutos (min). Las proteínas se resolvieron en un gel de poliacrilamida al 12%, se transfirieron a una membrana Immobilon-P, y se sometieron a análisis de inmunotransferencia utilizando anti-KRAS, -NRAS, o -HRAS anticuerpos.
Interferencia de ARN
Un diseño personalizado KRAS
siRNA (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 '), dirigido a una región del gen KRAS Windows que no está asociado con mutaciones oncogénicas conocidos, se sintetizó mediante Dharmacon (Lafayette, CO, EE.UU.). siRNAs dirigidos LRMP
, LYRM5 Opiniones y CASC1
fueron adquiridos de Ambion (No.144181, 284911 y 147715). A no director siRNA (control no específica VII, Dharmacon) universal, se utilizó como control negativo. En cada experimento, 5 × 10 6 células fueron transfectadas con 7,5 l de 20 mM siRNA por electroporación (Amaxa, Colonia, Alemania), utilizando Nucleofector kit V o T, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ensayo de proliferación de la célula

Después de la transfección con siRNAs, las líneas celulares de cáncer gástrico HSC45, MKN1, AGS y NUGC4 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 8000 células /100 l en medio estándar que contiene 10% de FCS. se determinó indirectamente el número de células en 48, 72 y 96 h después de la transfección mediante un ensayo colorimétrico utilizando Cell Counting Kit-8 solución (Dojindo, Kumamoto, Japón). El ensayo se basa en la reducción de una sal de tetrazolio ([2- (2-metoxi-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfofenil) -2-tetrazolio, sal monosódica], WST -8) y se utiliza como una medida de las células vivas. La absorbancia de cada pocillo a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas (modelo 680, Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
Citometría de flujo La citometría de flujo
se llevó a cabo como se describe anteriormente [27]. Brevemente, se recogieron las células adherentes y separadas, se fijaron en 90% de etanol frío, se trató con RNasa A (500 unidades /ml), y luego se tiñeron con yoduro de propidio (50 mg /ml). Para cada muestra, 30000 eventos fueron analizados utilizando la plataforma de análisis del ciclo celular de programa FlowJo (Árbol Star, Ashland, Oregón, EE.UU.).
Inmunohistoquímica
fijados con formalina, secciones en parafina de los tumores gástricos fueron desparafinados, hidratados , y luego se trató con solución de bloqueo de peroxidasa (3% H 2O 2 en metanol). Las secciones se trataron en autoclave a 105 ° C durante 10 minutos en una solución de recuperación de destino (Dako, Glostrup, Dinamarca). Las secciones se incubaron con un anticuerpo de ratón anti-KRAS. (Dilución 1: 100; Santa Cruz Biotechnology) durante 1 h a temperatura ambiente, y se detectó inmunorreactividad utilizando reactivos ENVISION-Plus (DAKO) guía Resultados
exploración genoma Digital y caracterización de etiquetas virtuales en silico
exploración del genoma digital (DG) es un método de cuantificación de número de copias de genes mediante la enumeración de fragmentos de ADN genómico cortos (denominados etiquetas reales) que son generados experimentalmente por Mbo I
endonucleasa digestión (Figura 1a). Para eliminar los complicados pasos involucrados en la preparación tag, computacionalmente caracterizaron los fragmentos cortos de ADN que se producen por digestión con enzimas de restricción único con Mbo
I, que reconoce la secuencia de 4 pb GATC. En silico
la digestión del genoma humano por Mbo
Me produce aproximadamente 1,6 millones de fragmentos de restricción (denominados etiquetas virtuales) en el rango de 20-130 pb (archivo adicional 7a). análisis de la secuencia de nucleótidos reveló que aproximadamente el 65% de las etiquetas virtuales contenía secuencias repetitivas, como se define en la base de datos pública de elementos de repetición (archivo adicional 7a). Es importante destacar que la secuencia de búsqueda de la base de datos del genoma humano reveló que aproximadamente el 85% de las etiquetas virtuales asignados de forma única a cromosómicas lugares precisos (archivo adicional 7b, c). Incluso si las etiquetas virtuales incluyen secuencias repetitivas en parte, aproximadamente el 80% de las etiquetas repetitivas resultó ser único. La distancia media entre dos etiquetas virtuales únicas de 30 a 60 pb de longitud fue de 7,6 kb, la distancia mediana fue de 4,5 kb y 97,8% de los intervalos eran más cortos que 30 kb (archivo 7d adicional). Se observaron características de intervalo de etiqueta similares para las etiquetas virtuales del rango de 70 a 100 pb (distancia media, 7,9 kb; distancia media, 4,8 kb; 97,4% eran más cortos que 30 kb), y 100 a 130 pb (distancia media, 7,9 kb; distancia media, 4,9 kb;.. 97,4% eran menores a 30 kb (archivo adicional 7e, f) por otra parte, la densidad de las etiquetas virtuales únicas era casi igual en cada cromosoma (archivo adicional 7 g) Estos in silico
resultados sugirieron que las la mayoría de corta Mbo
etiquetas I sea informativo para DGS. la figura 1 DGS y preparación de etiquetas reales. (a) esquema de los cuadros de colores. DGS representan genómico Mbo
etiquetas reales. Ver detalles en el texto. (b y c) Preparación (b) y caracterización (c) de etiquetas reales. Los resultados representativos utilizando ADN genómico de células de cáncer gástrico MKN1 se muestran. (b) fragmentos cortos de Mbo
ADN genómico digerido-I (30 a 60 pb) se electroeluyó desde un gel de agarosa (i), y se subclonó concatenado. plásmidos recombinantes resultantes se combinaron para generar la primera biblioteca (ii). concatemers largos (140 a la 800 pb) fueron extirpados de 1ª vectores biblioteca, electroeluyó (iii), concatenados y se subclonó. Los plásmidos recombinantes resultantes representan 2ª biblioteca clones (iv). El número de etiquetas contenidas en cada clon se muestra en la parte superior de cada carril. Inserta fueron examinados por Xho
I /Sac I digestión
en los paneles (ii) y (iv). *, fragmentos de vector; **, Spe
I /Pst I
la digestión del sitio de clonación múltiple sin inserto. (C) El número real de etiquetas reales de la segunda biblioteca se muestra en el histograma (izquierda), y se resumen sus características (a la derecha).
DGS simulación in silico
La capacidad de dichos sistemas a la detección del genoma cambios de ancho se basa en características del genoma, tales como el número de copias y el tamaño de la alteración, y el número de etiquetas reales obtenidos a partir de análisis de secuencias. Para predecir el tamaño de alteración que podrían detectarse de manera fiable, dado un número fijo de etiquetas computacionalmente la muestra, se utilizó la simulación de Monte Carlo para calcular un valor predictivo positivo (PPV), que es la probabilidad de que una alteración detectado representa una verdadera alteración. Por ejemplo, se encontró que un análisis de 5000 etiquetas podría detectar de forma fiable una amplificación de 10 veces de 500 kb, una deleción homocigótica de 7,5 Mb, o una sola pérdida copia de una región de 30 Mb, pero no pudo detectar una subchromosomal menor ganancia de 30 Mb (archivo adicional 8). Tanto la sensibilidad y especificidad de la detección de este tipo de alteración eran > 99% en los casos con altos PPVs (> 90%)., Que indicó que ni era un factor limitante en este análisis (datos no mostrados)
Preparación de etiquetas reales de genómica
ADN humano para las DG de la líneas celulares de cáncer gástrico y HSC45 MKN1, se prepararon bibliotecas de etiquetas reales a partir de ADN genómico, como se muestra en la Figura 1a. El Mbo
ADN genómico digerido con era de tamaño fraccionado (30-60 pb) y se sometió a concatemerization, seguido de la construcción de una segunda biblioteca, que contenía aproximadamente 10 etiquetas reales por clon (Figura 1b). análisis de la secuencia de nucleótidos de las etiquetas reales reveló que 85,8% asignada a posiciones únicas, que era consistente con nuestra caracterización de etiquetas virtuales (Figura 1c).
amplificaciones en el cromosoma 12p en células de cáncer gástrico HSC45
La etiqueta de todo el genoma perfil de densidad de las células HSC45 se determinó usando un total de 5.462 etiquetas reales únicas. Para lograr una alta resolución y sensibilidad con los datos experimentales, se utilizó tamaños de ventana de 1000 y 2100 etiquetas virtuales (aproximadamente 2,300 kb y 4,700 kb) para el análisis de las amplificaciones y deleciones, respectivamente. La relación de la densidad de la etiqueta se calculó como la suma de las etiquetas reales dividido por el número medio de etiquetas reales en del mismo tamaño ventanas por todo el genoma, en el que se define la relación de densidad normal etiqueta como 1,0. Se identificaron las regiones subchromosomal distintas de aumento de la densidad de etiquetas situado en 8q24.21, 12p12.1 y 12p13.33, y la disminución de la densidad de etiquetas situado en 9p21.3 y el brazo largo del cromosoma 18 (Figura 2, archivo adicional 9a-d). Las regiones de aumento de la densidad de etiquetas (12p12.1, 12p13.33 y 8q24.21) contenían KRAS
, CACNA1C gratis (canal de calcio, dependiente de la tensión, l tipo, alfa-1c subunidad) y MYC
loci, respectivamente. El análisis Southern blot confirmó que KRAS Opiniones y MYC
se amplificaron en células HSC45 (archivo adicional 9e). Cada cambio de número de copias se cuantificó tal como se determina a partir cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) de ADN genómico fue notablemente similar a la estimada por DGS cuando el tamaño de la ventana para el análisis de la densidad de la etiqueta se corresponde con el tamaño de cada alteración (archivo adicional 9a-d ). Estos resultados sugieren que el análisis de la densidad de la etiqueta por DGS podría utilizarse para realizar análisis de número de copias por todo el genoma humano. Figura 2 Detección de mayor número de copias en los cromosomas 8q y 12p por DGS en las células de cáncer gástrico HSC45. (A) Una vista de todo el genoma de la relación de densidad etiqueta (utilizando una ventana de 1000 etiquetas virtuales) en células HSC45 como se determina por DGS. Los valores en el eje Y indican los factores de cambio en la densidad de la etiqueta en relación con la densidad media de la etiqueta de todo el genoma, y ​​representan el contenido de ADN por genoma haploide, en ventanas. El eje x representa el número de cromosomas. (B y C) consideran que la ampliación de las relaciones de densidad etiqueta en los cromosomas 8 (b) y 12 (c). En cada panel, la gráfica superior muestra una vista de todo el cromosoma de la relación de densidad etiqueta (basado en una ventana de 1000 etiquetas virtuales). El gráfico inferior muestra una vista ampliada de 8q24.21 y 12p12.1, en el que aumentó la densidad de la etiqueta se detectó utilizando ventanas de 1000 y 500 etiquetas virtuales. etiquetas únicas reales se indican como barras verticales negras, y las etiquetas únicas virtuales están indicados en azul (60 pb o más corto) o azul claro (más de 60 pb) bares en modo denso. Las posiciones de los genes RefSeq, con algunas isoformas de empalme omitidas, se muestran en la parte inferior de los paneles inferiores.
La amplificación de KRAS
en líneas celulares de cáncer gástrico
Análisis de 26 loci dentro de e inmediatamente flanquean el cromosoma 12p12. 1 en las células HSC45 por qPCR demostrado que una región de aproximadamente 500 kb, que incluía los KRAS
locus del gen, se amplificó (amplificación de 8 veces, la Figura 3a). Genomic qPCR de detección detecta KRAS
amplificación en dos líneas celulares de cáncer gástrico adicionales, SH101P4 (18 veces) y MKN1 (13 veces) (Figura 3a), mientras que no detectamos amplificación de más de 4 veces en 17 otro líneas celulares de cáncer gástrico, o en el cáncer de colon 10 y 11 líneas celulares de cáncer de páncreas (que se enumeran en el archivo adicional 1, los datos no presentados). DGS también detectó amplificación del gen KRAS
locus en MKN1 células (archivo adicional 10). Los genes vecinos de KRAS
en el amplicón fueron mínimas LRMP gratis (proteína de membrana linfoide restringida), CASC1 gratis (cáncer de susceptibilidad candidato 1) y LYRM5 gratis (LYR motivo que contenía 5). BCAT1
(aminotransferasa 1 de cadena ramificada, citosólica) también se amplificó en células SH101P4 y MKN1, pero no en células HSC45. Se confirmó que CACNA1C
se amplificó en células HSC45, pero no en los otros gástricos, de colon, o líneas celulares de cáncer pancreático usando el análisis de qPCR genómico (9b archivo adicional; datos no mostrados). Ni NRAS
, HRAS
ni BRAF
amplificaciones fueron detectados en las líneas celulares de cáncer anteriores por análisis de qPCR genómico (datos no mostrados). La amplificación de KRAS
también se verificó por análisis de color FISH dual, en la que el KRAS
amplicón fue evidente como una región teñida homogéneamente en HSC45, las células SH101P4 y MKN1 (Figura 3b). Figura 3 La amplificación génica de KRAS en células de cáncer gástrico. (A) Análisis cuantitativo de PCR genómica de los KRAS
locus 12p12.1 en HSC45 en las células. amplificaciones discretos en 12p12.1 en otras dos líneas celulares de cáncer gástrico también se detectaron (SH101P4 y MKN1). el número de copias de ADN en relación con el ADN normal de leucocitos diploide se representó frente a la posición de nucleótido cromosómica (en megabases). Las posiciones de los genes RefSeq en las regiones correspondientes se muestran en el mapa inferior. La región mínima de amplificación común a todas las 3 líneas celulares de cáncer gástrico se representa por la barra de color naranja. (B) Metafase (izquierda) - e interfase (derecha) -FISH análisis de los amplificados KRAS
locus en líneas celulares de cáncer gástrico. El KRAS
sonda específico de es de color amarillo, y la sonda de control, específico para el brazo largo del cromosoma 12, es de color rojo. Se observaron tetraploidia en HSC45 y la triploidía en las células SH101P4 y MKN1. (C) análisis en tiempo real RT-PCR cuantitativa de KRAS
la expresión de ARNm en células de cáncer gástrico con amplificación 12p12.1. Análisis de la expresión de los genes (KRAS, LRMP, CASC1 Opiniones y LYRM5
) situado dentro del amplicón mínimo, y BCAT1
, que flanquea la amplificación mínima, se llevó a cabo utilizando en tiempo real de RT-PCR. Los niveles de expresión se normalizaron a GAPDH
mRNA, y se representan como un gradiente de color, en relación con estómago normal. La amplificación de genes y mutación (codón 12 o 13) el estado de KRAS
para cada muestra se resume en la derecha dos columnas. Los círculos negros indican la presencia de amplificación o mutación de KRAS
, y los círculos abiertos indican que no hay amplificación o ninguna mutación de KRAS
.
análisis de la secuencia de KRAS
(archivo 11a adicional) mostró que tanto HSC45 y células SH101P4 albergaban una mutación en el codón 12 que dio lugar a una única sustitución de aminoácido en el gen KRAS (GGT → gtt, G12V), mientras que las células MKN1 carecían del gen KRAS
mutaciones. La presencia de mutaciones KRAS
en AGS (G12D), snu1 (G12D), DLD1 (G13D) y las células HCT116 (G13D) se ha informado anteriormente [28, 29]. De los diez clones de PCR de KRAS
de células HSC45 y SH101P4 que fueron sometidos a análisis mutacional, ocho y tres, respectivamente, las mutaciones en el codón 12. Además albergado, en tiempo real el análisis de PCR genómico utilizando sondas que eran específicas para salvaje de tipo y con KRAS mutado
alelos (archivo adicional 11b) también revelaron que las células HSC45 y SH101P4 contienen diferentes proporciones del alelo mutante (80% y 50%, respectivamente). En general, estos resultados indican que la amplificación de un KRAS mutantes
alelo también se produce en células HSC45 y SH101P4.
A continuación se investigó los niveles de mRNA en KRAS
KRAS
células de cáncer gástrico -amplified de real cuantitativa -Tiempo RT-PCR (qRT-PCR) (Figura 3c). Los niveles de ARNm del gen KRAS
correlacionaron significativamente con KRAS
número de copias. Los genes vecinos LYRM5
y CASC1
, que localiza en el amplicón mínimo, también se expresaron en niveles más altos en las células con la amplificación en comparación con células sin amplificación (Figura 3c). Curiosamente, LRMP
se había reducido regulado en células de cáncer en comparación con las células normales del estómago. El análisis por inmunotransferencia de las proteínas RAS (Figura 4a) reveló que la expresión de KRAS se incrementó en KRAS
células de cáncer gástrico (-amplified HSC45, SH101P4 y MKN1), mientras que ni NRAS ni HRAS fueron altamente expresado (Figura 4A; no se muestran datos ). Aunque la expresión de let-7c y let-7 g microARN ha sido reportado para regular la expresión de RAS [8], encontramos poca correlación entre la expresión de estos microRNAs con los niveles de proteína KRAS (archivo adicional 12), lo que sugiere que la sobreexpresión del gen KRAS en el cáncer gástrico líneas celulares se debe principalmente a la amplificación genómica del gen KRAS
. Figura 4 La sobreexpresión del gen KRAS, y la activación diferencial de KRAS, p44 /42 MAP quinasa y AKT en KRAS -amplified células de cáncer gástrico. (A) El análisis por inmunotransferencia de los niveles de expresión de KRAS y ARN en las células cancerosas. la expresión de actina se analizó como control de carga. (B) El nivel basal de GTP-KRAS fue notablemente alta en células de cáncer gástrico con KRAS mutantes amplificados
(HSC45 y SH101P4). lisado total (500 g) se sometió a un ensayo de pull-down GTP-RAS, y GTP-KRAS y GTP-NRAS se detectaron por inmunotransferencia usando anticuerpos anti-anti-NRAS KRAS y, respectivamente. lisado celular total (50 g) se analizó en paralelo para determinar el nivel de expresión de KRAS y ARN en las células. (C) GTP-KRAS fue elevado después de la estimulación con suero en las células MKN1. Las células se cultivaron en medio ordinario que contiene 10% de FCS (N), suero de hambre durante 24 h (-) o privadas de suero después se estimularon con 10% de FCS durante 1 h (+). lisado celular total se sometió a un ensayo de pull-down GTP-KRAS. (D) La activación de p44 /42 MAP quinasa y Akt en células de cáncer gástrico privadas de suero o estimuladas. Se analizó el lisado celular total como se describe para la figura c.

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