Egy új módszer, digitális genom felismeri a KRAS gén amplifikáció gyomorrák: bevonását túlzott mértékben a vad típusú KRAS a jelátviteli és a ráksejtek growth

Egy új módszer, digitális genom felismeri a KRAS katalógusa génamplifikáció gyomorrák: bevonása túlzott mértékben vad típusú KRAS a jelátviteli és a rákos sejtek növekedését katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa gyomorrák a harmadik leggyakoribb rosszindulatú daganat érinti a lakosság világszerte. Aberráns aktiválása KRAS kulcsfontosságú tényező a fejlesztés sokféle daganat azonban onkogén mutációk a KRAS katalógusa ritkák a gyomorrák. Az általunk kifejlesztett új mennyiségi analitikai módszer a DNS kópiaszám, úgynevezett digitális genom szkennelés (DGS), amelynek alapja a felsorolás rövid restrikciós fragmentumok, és nem jár PCR vagy hibridizációs. A jelenlegi tanulmányban használt DGS felmérni copy-szám változásokat gyomorrák sejtek. Katalógusa módszerei katalógusa DGS gyomorrák sejtvonalakon végeztük szekvenciái 5000-15000 restrikciós fragmentumok. Mi árnyékolt 20 gyomor rákos sejtvonal és a 86 primer gyomor tumorok KRAS
amplifikáció által kvantitatív PCR, és vizsgálták a KRAS
amplifikáció a DNS, mRNS és fehérje szinten mutációs elemzéssel, a valós idejű PCR-rel, immunoblot analízis, GTP -RAS legördülő vizsgálat és immunhisztokémiai vizsgálatok. A hatás a KRAS
knock-down a aktiválását p44 /42 MAP-kináz és AKT és a sejtnövekedésre vizsgáltuk immunoblot és kolorimetriás vizsgálattal, ill.
Eredménye
DGS elemzést a HSC45 gyomorrák sejt vonal feltárta a amplifikációját egy 500 kb-os régióban kromoszómán 12p12.1, mely tartalmazza a KRAS
génlókusszal. Amplifikálása a KRAS katalógusa lókusz volt kimutatható 15% (3/20) a gyomor rákos sejtvonalat (8-18-szeres amplifikáció) és 4,7% (4/86) a primer gyomor tumorok (8-50-szörös amplifikálódást ). KRAS
mutációt azonosítottak két a három sejtvonal, amelyben KRAS
amplifikáltuk, de nem voltak kimutathatók bármelyik elsődleges tumorokban. Túlexpressziója KRAS fehérje közvetlen korrelációban vannak fokozott KRAS katalógusa kópiaszám. A szint GTP-kötött KRAS megemelkedett következő szérum stimulálás sejtek amplifikált vad típusú KRAS katalógusa, de nem a sejtek amplifikált mutáns KRAS katalógusa. Knock-down KRAS katalógusa gyomor rákos sejtek, ellenőrzést amplifikált vad típusú KRAS
eredményezte a sejtnövekedés és elnyomása p44 /42 MAP-kináz és AKT aktivitást.
Következtetés
Vizsgálatunk kiemeli a közüzemi DGS azonosítására másolat-szám változásokat. A DGS, azonosítottunk KRAS
mint egy gént, amely felerősödik humán gyomorrák. Kimutattuk, hogy a gén amplifikációs valószínűleg képezi molekuláris alapjainak fokozott aktivitása KRAS gyomorrákban. További vizsgálatok segítségével nagyobb csoportjának gyomorrák példányok meghatározásához szükséges diagnosztikai és terápiás vonatkozásai KRAS katalógusa amplifikációját és túlzott. Katalógusa Háttér katalógusa gyomorrák a harmadik leggyakoribb rosszindulatú daganat érinti a lakosság világszerte [1 ]. Specifikus genetikai változásokat jelentettek gyomorrák, beleértve amplifikáció a KSAM katalógusa, MET katalógusa és az ErbB2 katalógusa, és mutációk p53 katalógusa, APC katalógusa, és Cdh1 katalógusa [2] . Míg a nyereség-of-function mutációk a KRAS katalógusa néhány a leggyakrabban megfigyelt genetikai eltérések a különböző tumorok, beleértve a hasnyálmirigy (60%), epeúti (33%) és a vastagbél (32%) [3], ezek a mutációk nem gyakoriak, a gyomorrák (2-7%) [4-7]. Általában RAS katalógusa mutáció tumorogenezisben "lock" RAS aktív GTP-kötött állapotban. GTP-RAS kötődik számos effektor fehérjék ösztönzése jelátviteli utak, amelyek közül a Raf-MAP-kináz kaszkád és a foszfatidil-inozitol 3-kináz (PI3K) -Akt utak a sejtnövekedés és onkogenezisben a legjobb jellemezve [3]. Hosszan tartó aktiválása RAS is előfordulhat mechanizmusok révén, amelyek nem járnak mutációk RAS. Például a csökkentett expresszióját let-7 mikroRNS, amely elnyomja a RAS megcélzásával a 3'untranslated régió RAS katalógusa mRNS-ek, gyakran jár együtt a magasabb Ras protein szintje a tumorokban [8]. A mai napig a molekuláris mechanizmusok onkogén aktiválása RAS a gyomorrák még nem teljesen tisztázott.
Amplifikációja genomi szekvenciák tartalmazó géneket, amelyek kritikusak a sejt növekedés egyik elsődleges mechanizmusai aktiválás onkogének a rák, és gyakran társul a tumor progresszióját, rossz prognózissal és /vagy a gyógyszer-rezisztencia [9]. A számos módszer jelenleg rendelkezésre álló kimutatására kópiaszámától genomot, a jelenlegi arany szabvány a tömb CGH módszer (aCGH). Az elmúlt néhány évben, a felbontás aCGH javult gyorsan használata révén oligonukleotidpróbák, és meghaladta a aCGH standard BAC szondák [10]. Azonban aCGH is érzékenyek a velejáró zaj hibridizációs alapú intenzitás méréseket, mint a jel minőségét befolyásolja a ismétlődő szekvenciák és függ szonda minőségű [11]. Tény, optimalizálása szonda kialakítása volt a fő kihívás a fejlesztés csempék tömbök [12, 13]. Katalógusa Digitális karyotipizálást (DK) által kifejlesztett Wang et al. [14], és nem korlátozza a benne rejlő problémái tömb technikákat. DK magában foglalja a digitális felsorolásával rövid genomiális DNS fragmenseket (elnevezése címkéket), amely egy kvantitatív mérését a DNS kópiaszám keresztül kulcsszó sűrűség elemzés mentén minden egyes kromoszómát. DK sikeresen alkalmaztuk a különböző daganattípusok kimutatására copy-szám változásokat, beleértve az erősítés a TYMS katalógusa, RSF1 katalógusa és OTX2 katalógusa, és törlés MKK4 katalógusa és disztrofin katalógusa [ ,,,0],15-19]. Annak ellenére, hogy a hatékonyságot a DK, technikailag nehéz a széles körben alkalmazható, mert magában foglalja a PCR amplifikáció és a generációs tag 21-bázispár (bp) hosszúságú pontosan képviseli a kromoszóma helyen az érdeklődés.
Beszámolunk itt a fejlesztés egy új eljárást, nevezett DGS, mennyiségi elemzésének kópiaszám variáció, amely alapján a tag-számlálási fogalma DK, de használ egy egyszerűsített folyamat címke előállítására. DGS gyomorrák sejtvonalak észlelte az erősítés a KRAS katalógusa locus kromoszómán 12p12.1. Eredményeink a molekuláris bázisát a fokozott aktivitása KRAS, és azt sugallják, hogy az aktiválási KRAS jelátviteli eseményeket, elősegítheti gyomor rákos sejtek szaporodását.
Methods
Sejtvonalak és szövetek
A sejtvonalakat elemeztük a jelenlegi tanulmány felsorolt ​​kiegészítő file 1. A HSC és SH101P4 sejtvonal által létrehozott Kazuyoshi Yanagihara [20]; Minden egyéb kaptuk az American Type Culture Collection, vagy a japán Collection of Research Bioresources (Tokió, Japán). Az összes sejtvonalat tenyésztettünk az ajánlott médiában. A szérum stimuláció, sejteket inkubáltunk média, hogy hiányzott a szérum 24 órán át (H), és akkor vagy nem stimulált, vagy stimulált 1 órán média, amely 10% borjúembrió-szérumot (FCS). Elsődleges gyomorrák mintákat kaptunk a Sebészeti Osztály, Keiyukai Sapporo Kórház, a beleegyező nyilatkozatot minden beteg. A genomiális DNS-t extraháltunk a fenol-kloroformos eljárással, majd RN-áz kezeléssel. Teljes RNS-t extraháltunk Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), a gyártó utasításai szerint. Genomiális DNS-normál perifériás vér leukociták (BioChain, Hayward, CA, USA) és a teljes RNS-t a normál gyomornyálkahártya egészséges egyének (BioChain és Invitrogen) vásároltuk. Elsődleges gyomorrák sorolták a klinikopatológiai jellemzők, amint azt a további fájl 2. szerint a pTNM osztályozási rendszer (5. kiadás, 1997) [21] és a Lauren osztályozási rendszer [22]. KRAS katalógusa a kültéri egység állapotát életkor szerint hasonlítottuk össze a Student t-teszt; szerint minőségű, pT státusz, pN állapotát, és a betegség stádiuma alapján Mann-Whitney U teszt; és nemek szerint, szövettani és a PM állapotát a Fisher egzakt teszt. Minden tesztet 2-farkú, és egy P
értéke < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.
Digitális genom szkennelés
Röviden, 40 ug genomiális DNS-t vetettünk alá a restrikciós enzimes emésztés segítségével Mbo
I (Takara, Tokió, Japán), majd elektroforézissel választottuk el egy 3% Nusieve GTG agaróz gélen. Rövid fragmentumok (30-60 bp-nek nevezett, valós címkéket) arra elektroeluáljuk, a láncolt és szubklónoztuk Bam
HI-gyel emésztett pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) alkalmazásával Mighty Mix DNS-ligáló oldattal (Takara). Escherichia coli
DH10B transzformáltunk a rekombináns plazmidok, a transzformánsokat egyesítjük, és a plazmid-DNS-t tisztítottuk, hogy létrehoz az 1. könyvtár. Concatemers valódi címkék kivágtuk SPE
I /Pst
I emésztés az 1. könyvtár és fragmentumok a tartományban 140-800 bp elektroeluáljuk, a láncolt és szubklónozzuk pBluescript II KS + generálni a 2. könyvtár. Második könyvtár plazmidokat tartalmazó concatemers Spe
I /Pst
I fragmenseket szekvenáltuk alkalmazásával ABI3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) szerint a gyártó utasításai szerint. Egyedi valódi címkék térképezett humán kromoszómán szekvenciákat, és a tag sűrűség, arányaként definiáljuk a valós címkék virtuális címkék felett mozgó ablakok, a számítások szerint a rendellenességek kimutatására DNS tartalmat küszöbértékek által meghatározott DGS szimulációk. Tag pozíciók és a tag sűrűség arányú tettük láthatóvá Custom Tracks és a Genome grafikonok a University of California, Santa Cruz (UCSC) genom böngésző (március 2006 fagyasztva, hg18) [23-25]. A részletes jegyzőkönyvek DGS, virtuális tag jellemzése és in silico katalógusa szimulációk állnak rendelkezésre további fájlt 3. katalógusa kvantitatív real-time PCR katalógusa Relatív kópiaszám határoztuk meg kvantitatív valós idejű PCR SYBR Green PCR master Mix (Applied Biosystems), és az ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). DNS-tartalom a haploid genomban normalizáltuk, hogy az ismétlődő elem, LINE-1, és kiszámított összehasonlító CT (ΔΔCT) relatív mennyiségi meghatározási módszer a következő képlet segítségével 2 (Nt
- nLINE
) - ( Xt katalógusa - Xline katalógusa), ahol N katalógusa t katalógusa van a küszöb ciklus számot megfigyelt kísérleti primer normál leukocita DNS, N katalógusa vonal katalógusa van a küszöb ciklus számot figyeltünk meg a vonal-1 primer normál leukocita DNS Xt katalógusa átlagos küszöb ciklus szám megfigyelt kísérleti primer ráksejtek DNS, és az X katalógusa vonal katalógusa a átlagos határértéket ciklusszám figyeltünk meg a vonal-1 primer rákos sejt DNS [14]. Genomiális amplifikációt meghatározni, mint egy nagyobb, mint 4-szeres növekedését DNS tartalom. A primer szekvenciák az egyes locus állnak rendelkezésre további fájl 4. Az allélikus aránya mutáns KRAS katalógusa (G12V, GGT → GTT) határoztuk alkalmazásával egy módosított valós idejű PCR-eljárással szerinti Itabasi munkatársai katalógusa [26 ]. A részletes protokoll áll rendelkezésre további fájlt 3. cDNS-t készítünk SuperScript III reverz transzkriptáz (RT; Invitrogen), és az mRNS szintjén minden gén határoztuk meg real-time RT-PCR segítségével TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) . Relatív mRNS szintek által kiszámított összehasonlító CT módszer GAPDH
endogén kontroll. A primer /próba készletek használt jelennek További fájlt 5. katalógusa fluoreszcens in situ katalógusa hibridizáció (FISH) hotelben BAC-, amely tartalmazta a KRAS katalógusa locus (RP11-636P12) és kromoszómán 12q24.2 (RP11 -91M21) jelöltünk Cy3 és Cy5, illetve, és azután inkubáljuk tárgylemezeket készített interfázis és metafázisos kromoszómákon. A sejtmagokat ellen-festettük 4 ', 6-diamino-2-fenil-(DAPI), és a diák elemeztük fluoreszcens mikroszkóppal (Leica CW-4000).
Mutációs analízis KRAS
és a PIK3CA

amplifikált genomiális fragmenseket vagy közvetlenül szekvenáltuk, vagy szubklónoztuk a TOPO TA-klónozó készlet (Invitrogen), majd szekvenáltuk. Legalább tíz klónt két független PCR-vizsgálatokhoz per lókusz szekvenáltuk M13 előre és hátra primerek (Invitrogen). A szekvenciákat a primerek amplifikálására alkalmazunk KRAS katalógusa (exonok 1 és 2), valamint PIK3CA katalógusa (exonok, 9 és 20) mutatjuk be további fájl 6.
immunfoltelemzés
sejteket lizáltuk lízis puffer, amely 20 mM Tris-HCl (pH = 7,5) puffer, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA-t, 1% Triton X, 10% glicerin, 10 mM NaF, 1 mM nátrium-vanadát, 50 mM β-glicerofoszfát, 1 mM phenylmethansulfonyl fluorid , 1 mM ditiotreitol, és egy proteázinhibitor-koktél (Roche, Mannheim, Németország). Fehérjéket elválasztottuk SDS-PAGE és elektroblot alkalmazásával Immobilon-P membránra (Millipore, Billerica, MA, USA). A membránokat immunblot segítségével a következő antitestek, amint azt: egér monoklonális anti-KRAS, -NRAS, és -HRAS antitestek (SC-30, SC-31, és az SC-29, illetve, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-aktin antitest (Millipore); nyúl poliklonális anti-p44 /42 MAP-kináz, -phosho-p44 /42 MAP-kináz (Thr202 /Tyr204), -Akt és -foszfo-Akt (Ser473) antiszérumot (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA).
GTP-RAS legördülő assay
Az aktiválás a RAS detektáltuk egy EZ-Detect Ras aktiválódás Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Röviden, a sejt-lizátum (500 jig) inkubálunk immobilizált Raf1 Ras-kötő domént fuzionált glutation-S-transzferáz (GST-Raf1-RBD). A csapadékot 3-szor mostuk, és a megkötött fehérjéket eluáljuk által 5 perces forralással (perc). A fehérjéket megoldódott egy 12% -os poliakrilamid gélen, átvittük Immobilon-P membránra, és vetjük alá az immunoblot analízist anti-KRAS, -NRAS, vagy -HRAS antitestek.
RNS interferencia
Egy egyedi tervezésű KRAS
siRNS (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 '), célzott régió KRAS katalógusa, amely nem jár az ismert onkogén mutáció, Dharmaconnai szintetizáltuk (Lafayette, CO, USA). siRNS célba LRMP katalógusa, LYRM5 katalógusa és CASC1 katalógusa vásároltunk Ambion (No.144181, 284911 és 147715). Egy univerzális nem-célzott siRNS (nem-specifikus kontroll VII Dharmacon) alkalmaztunk negatív kontrollként. Mindegyik kísérletben 5 × 10 6 sejteket transzfektáltunk 7,5 ul 20 pM siRNS elektroporációval (Amaxa, Köln, Németország) alkalmazásával Nucleofector készlet V vagy T, a gyártó utasításai szerint.
Cell proliferációs vizsgálatban
a transzfekciót követően a siRNS, a gyomor rákos sejtvonalak HSC45, MKN1, AGS és NUGC4 oltottuk 96 lyukú lapokra, a sejtsűrűség 8000 sejt /100 ul standard tápközegben, amely 10% FCS-t. A sejtszámot 48, 72 és 96 órával a transzfekció határoztuk közvetve kolorimetriás assay sejtszámláló Kit-8-oldattal (Dojindo, Kumamoto, Japán). A vizsgálat alapja a csökkentés egy tetrazólium-só ([2- (2-metoxi-nitro-fenil) -3- (4-nitro-fenil) -5- (2,4-diszulfo) -2-tetrazólium-mononátrium-sót], WST -8) és használják, hogy olyan intézkedés az élő sejteket. A minden lyuk abszorbanciáját 450 nm-en mértük mikrolemez leolvasó (Modell 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Áramlási citometria
Áramlási citometria végeztük a korábban leírtak szerint [27]. Röviden, tapadó leválasztott sejteket összegyűjtöttük, rögzített 90% -os hideg etanollal kezeljük RNáz A (500 egység /ml), majd propidium-jodiddal festettük (50 ng /ml). Minden egyes minta esetében, 30000 események alkalmazásával analizáltuk a sejtciklus elemzési platform FlowJo Program (Fa Star, Ashland, OR, USA).
Immunhisztokémia
formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szakaszain gyomor tumorok paraffint, hidratált , majd kezeljük peroxidáz blokkoló oldattal (3% H 2 O 2, metanol). A metszeteket autoklávoztuk 105 ° C-on 10 percig a megcélzott visszakeresés oldatot (Dako, Glostrup, Dánia). Metszeteket egy egér anti-KRAS antitesttel (1: 100 hígítás; Santa Cruz Biotechnology) 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük, és immunreaktivitást detektáltuk ENVISION-Plus reagensek (Dako).
Eredmények
Digitális genom szkennelés és jellemzése virtuális címkék silico Matton Digitális genom szkennelés (DGS) egy olyan módszer mennyiségi gén kópiaszám felsorolásával rövid genomi DNS-fragmentumok (úgynevezett valós címkéket) generált kísérletileg Mbo katalógusa I endonukleáz emésztés (1a ábra). Hogy megszüntesse a bonyolult lépésből címke előállítására, mi számítástechnikailag jellemezve rövid DNS-fragmenseket, amelyek által termelt egyetlen restrikciós enzimes emésztéssel Mbo
I, amely felismeri a 4-BP szekvencia GATC. In silico
emésztés az emberi genom által Mbo
I termelt körülbelül 1,6 millió restrikciós fragmentumokat (úgynevezett virtuális tagek) a tartományban 20-130 bp (Kiegészítő fájl 7a). A nukleotid szekvencia analízis kimutatta, hogy mintegy 65% ​​-a a virtuális címkék tartalmazott ismétlődő szekvenciákat, amint az a nyilvános adatbázisban ismétlődő elemek (Kiegészítő fájl 7a). Fontos, szekvencia illő, hogy az emberi genom adatbázisban kiderült, hogy körülbelül 85% -a a virtuális címkék leképezett egyedileg pontos kromoszómális helyeken (Plusz fájl 7b, C). Még ha a virtuális címkéket tartalmaznak ismétlődő szekvenciák részben, mintegy 80% -a az ismétlődő címkék kiderült, hogy egyedi. Az átlagos távolság két egyedi virtuális tag 30 és 60 bp hosszúságú volt 7,6 kb, a medián távolság 4,5 kb és 97,8% -a intervallumok rövidebb volt, mint 30 kb (Kiegészítő fájl 7d). Hasonló címke intervallum jellemzőket figyeltünk meg a virtuális címkék a tartomány 70 és 100 bp (átlagos távolság, 7,9 kb; medián távolság, 4,8 kb; 97,4% rövidebb volt, mint 30 kb), és 100-130 bp (átlagos távolság, 7,9 kb; medián távolság, 4,9 kb; 97,4% volt, kevesebb mint 30 kb (További fájlok 7e f). Továbbá, a sűrűsége egyedülálló virtuális címkék közel azonos volt mindegyik kromoszóma (Plusz fájl 7g.) Ezek az in silico katalógusa elképzelések szerint a legtöbb rövid Mbo katalógusa I tag lenne informatív DGS. 1. ábra DGS és előkészítése valós címkéket. (a) sematikus vázlata DGS. Színes doboz képviseli a genomi Mbo katalógusa én igazi címkék. Lásd a szövegben a részletekért. (b és C) a előállítása (b) és jellemzés (c) a valós címkéket. reprezentatív eredmények felhasználásával genomiális DNS MKN1 gyomorrák sejtek jelennek meg. (b) a rövid fragmenseit Mbo katalógusa-gyel emésztett genomiális DNS-t (30-60 bp) elektroeluáljuk agarózgélből (I), a láncolt és szubklónoztuk. Kapott rekombináns plazmidokat összegyűjtöttük, hogy létrehoz az 1. könyvtár (II). Hosszú concatemers (140-800 bp) kivágtuk 1. könyvtár vektorok, elektroeluáljuk a (III), összefűzött és szubklónoztuk. A kapott rekombináns plazmidokat képviseli 2. könyvtár klónt (IV). A felhasználható elemek számát, amely minden egyes klón jelenik meg a tetején minden sávban. Betétek vizsgáltuk Xhol katalógusa I /Sac
I emésztés panel (ii) és (iv). *, Vektor töredékek; **, Spe katalógusa I /pst katalógusa I emésztése többszörös klónozó hely betét nélkül. (C) tényleges száma a valós címkéket a 2. könyvtár látható a hisztogram (balra), és azok jellemzői -ról (jobbra). Katalógusa DGS szimulációs in silico Matton Az a képesség, DGS felismerni genom -Széles változások alapul genom jellemzőit, mint például a másolat számát és a mérete a megváltoztatása, és a szám a valódi címkék nyert szekvencia analízis. Megjósolni a méretének megváltozása, amely megbízhatóan kimutatható, adott rögzített számú számítástechnikailag mintában címkék, használtuk Monte-Carlo-szimulációs kiszámításához a pozitív prediktív értéket (PPV), amely annak a valószínűsége, hogy egy észlelt változás jelenti egy valódi változás. Például azt találtuk, hogy egy elemzést 5000 címkék lehetett megbízhatóan érzékeli a 10-szeres amplifikációját 500 kb, homozigóta delécióját 7,5 MB, vagy egy példányban veszteség egy 30 Mb régiót, de nem érzékeli a subchromosomal szert kisebb, mint 30 Mb (Plusz fájl 8). Mind az érzékenysége és specificitása kimutatására ilyen típusú módosítás volt > 99% abban az esetben, a magas PPVs (> 90%), ami azt jelezte, hogy sem volt korlátozó tényező ebben az elemzésben (az adatokat nem mutatjuk be).
Előállítása valódi címkéket humán genomiális DNS-
a DGS, a gyomor rákos sejtvonalak HSC45 és MKN1 elkészítettük könyvtárak valós címkéket genomiális DNS, amint az 1A ábrán látható. A RES
-gyel emésztett genomiális DNS-t méret szerint frakcionáljuk (30-60 bp), és alávetni concatemerization, majd építése egy 2. könyvtár, amely körülbelül 10 valódi címkék per klón (1b ábra). Nukleotid szekvencia elemzése a valódi címkék kiderült, hogy 85,8% leképezett egyedi pozíciókat, ami összhangban van a jellemzés virtuális címkék (1c ábra).
Amplifications kromoszómán 12p az HSC45 gyomorrák sejtek
genomot tag sűrűség profilját HSC45 sejtek alkalmazásával határoztuk meg, összesen 5462 egyedi valós címkéket. Ahhoz, hogy a nagy felbontás és érzékenység a kísérleti adatokkal, szoktuk ablakméretekhez 1000 és 2100 virtuális címkék (körülbelül 2300 kb és 4700 kb) elemzéséhez amplifikációs és törlések, ill. A címke sűrűség arányú számítottuk összegeként valódi címkék osztva az átlagos száma valódi címkék ugyanolyan méretű ablakok az egész genomban, amelyben a normális címke sűrűség arányú definiáltuk 1.0. Azonosítottunk különálló subchromosomal régiói fokozott címke Sűrűség 8q24.21, 12p12.1 és 12p13.33 és csökkent címke sűrűsége 9p21.3 és a kromoszóma hosszú karján 18 (2. ábra, Plusz fájl 9a-d). Azok a régiók, a megnövekedett címke sűrűség (12p12.1, 12p13.33 és 8q24.21) tartalmazott KRAS
, CACNA1C
(kalcium-csatorna, a feszültség-függő, L típusú, az alfa-1c alegység) és az MYC katalógusa loci, ill. Southern blot analízis megerősítette, hogy a KRAS katalógusa és MYC katalógusa amplifikáltunk HSC45 sejtek (Plusz fájl 9e). Minden mennyiségileg copy-szám változása által meghatározott kvantitatív valós idejű PCR (qPCR) genomi DNS feltűnően hasonló által becsült DGS, amikor az ablak méretét tag sűrűség elemzés illeszkedik a mérete minden változtatás (Plusz fájl 9a-d ). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy címke sűrűség elemzés által DGS lehetne használni, hogy végre kópiaszámú elemzés az egész humán genomban. 2. ábra kimutatása megnövekedett kópiaszám kromoszómákon 8 q és 12p által betétbiztosítási HSC45 gyomorrák sejtek. (A) Egy teljes genom Tekintettel a címke sűrűség arány (egy ablak 1000 virtuális címkék) HSC45 sejtek által meghatározott DGS. Az értékek az Y tengelyen jelzik kinyitható változások címke sűrűség képest az átlagos címke sűrűsége a teljes genom, és képviselik DNS tartalom a haploid genomban, a Windows. Az x tengely jelenti kromoszóma számot. (B és C) Expanded Tekintettel címke sűrűség arányok kromoszómákon 8 (b) és a 12. (C). Minden panel, a felső ábra a teljes kromoszóma néző tag sűrűség arányú (az ablak 1000 virtuális címkék). Az alsó grafikon mutatja kinagyítva 8q24.21 és 12p12.1, amelyben fokozott tag sűrűségű detektáltuk windows 1000 és 500 virtuális címkéket. Egyedi igazi tag jelölése a függőleges fekete sávok, és egyedülálló virtuális címkék szerepelnek kék (60 bp vagy rövidebb), vagy világoskék (hosszabb, mint 60 bp) sáv sűrű módban. A pozíciók a refseq gének, néhány splicing izoformák elhagyható, jelennek alján az alsó panelek.
Amplifikálása KRAS
gyomor rákos sejtvonalakban
Elemzés 26 lókuszok belül, és azonnal szegélyező kromoszóma 12p12. 1 HSC45 sejtekben qPCR igazolták, hogy a régió körülbelül 500 kb méretű, amely tartalmazta a KRAS
génlókusz, amplifikáltuk (8-szoros erősítés, 3a ábra). Genomiális qPCR szűrés észlelt KRAS
amplifikáció két további, a gyomorsav rákos sejtvonalban, a SH101P4 (18-szeres) és MKN1 (13-szeres) (3a ábra), mivel nem találtunk amplifikációját nagyobb, mint 4-szeres további 17 gyomor rákos sejtvonalak, illetve 10 vastagbélrák és a 11 hasnyálmirigyrák-sejtvonalak (felsorolt ​​további fájl 1, az adatokat nem mutatjuk). DGS is kimutatható erősítést a KRAS katalógusa locus MKN1 sejtek (Plusz fájl 10). A szomszédos gének KRAS katalógusa a minimális fragmentum voltak LRMP katalógusa (lymphoid-korlátozott membrán fehérje), CASC1 katalógusa (rák fogékonyság jelölt 1) és LYRM5 katalógusa (LYR motívum, amely 5). BCAT1
(elágazó láncú aminotranszferáz 1, citoszolikus) is amplifikáltuk SH101P4 és MKN1 sejtek, de nem HSC45 sejtekben. Igazoltuk, hogy CACNA1C
amplifikáltunk HSC45 sejtekben, de nem a többi gyomor, vastagbél, vagy hasnyálmirigyrák-sejtvonalak használatával genomiális qPCR analízis (Plusz fájl 9b; az adatokat nem mutatjuk). Sem a nemzeti szabályozó hatóságok
, HRAS
sem BRAF
amplifikáció detektáltunk a fenti rákos sejtvonalak által genomiális qPCR analízis (az adatokat nem mutatjuk be). Az amplifikációs KRAS katalógusa is igazolta kétszínű FISH analízis, amelyben a KRAS katalógusa fragmentum nyilvánvaló volt, mint egy homogén festett régió HSC45, SH101P4 és MKN1 sejtek (3b ábra). 3. ábra génamplifikáció KRAS gyomorrákban sejtekben. (A) mennyiségi genomiális PCR-elemzése a KRAS katalógusa pályáját 12p12.1 a HSC45 sejtekben. Diszkrét amplifikálásokban a 12p12.1 két másik gyomor rákos sejtvonalak is kimutattak (SH101P4 és MKN1). DNS kópiaszám viszonyítva normális diploid leukocita-DNS-t függvényében ábrázoljuk kromoszomális nukleotid pozíció (megabázisában). A pozíciók a refseq gének a megfelelő régiók láthatók az alsó térképen. A minimális amplifikációs régió közös az összes 3 gyomorrák sejtvonalak képviseli a narancssárga színű sáv. (B) Metafázis (balra) - és interfázis (jobbra) -Hal elemzése az amplifikált KRAS
lókuszt gyomor rákos sejtvonalak. A KRAS katalógusa specifikus szonda sárga, és a kontroll próba, specifikus kromoszóma hosszú karján 12, ez a piros. Tetraploidy a HSC45 és triploidia a SH101P4 és MKN1 sejteket figyeltünk meg. (C) kvantitatív valós idejű RT-PCR analízise KRAS katalógusa mRNS expressziójának gyomorrák sejtek 12p12.1 erősítés. Expressziós analízis gének (KRAS, LRMP, CASC1
és LYRM5
) belül található minimális amplikon, és BCAT1 katalógusa, amely szegélyezi a minimális amplikon végeztünk real-time RT-PCR-rel. Expression szint is GAPDH katalógusa mRNS, és ábrázolja a színátmenet, az ép gyomor. A gén amplifikáció és a mutáció (kodon 12 vagy 13) állapotát KRAS katalógusa az egyes minták össze a megfelelő két oszlop. Kitöltött körök jelzik a jelenlétét erősítés vagy mutációja a KRAS katalógusa, és nyitott körök jelzik nincs erősítés vagy mutációt nem a KRAS katalógusa.
Szekvencia analízise KRAS katalógusa (Plusz fájl 11a) azt mutatta, hogy mind a HSC45 és SH101P4 sejt hordozott mutáció kodon 12 azt eredményezte, hogy egyetlen aminosav szubsztitúciót KRAS (GGT → GTT, G12V), míg MKN1 sejtek nem KRAS
mutációk. A jelenléte KRAS katalógusa mutációk AGS (G12D), SNU1 (G12D), DLD1 (G13D) és HCT116 (G13D) sejtek korábban leírták [28, 29]. A tíz PCR-klónok KRAS katalógusa származó HSC45 és SH101P4 sejteket vetettük alá mutációs analízis, nyolc és három, illetve táplált mutációk kodon 12. Továbbá genomiális valós idejű PCR-analízis próbák alkalmazásával, amelyek specifikusak a vad típusú és a mutáns KRAS
allélek (Plusz fájl 11b) is kiderült, hogy HSC45 és SH101P4 sejtek tartalmaznak különböző arányban a mutáns allél (80% és 50% -kal). Összességében ezek az eredmények azt jelezték, hogy az amplifikáció a mutáns KRAS
allél is előfordul HSC45 és SH101P4 sejtekben.
Mi következő vizsgáltuk a szintek KRAS katalógusa mRNS KRAS
-amplified gyomorrák sejtek kvantitatív, valós -time RT-PCR (qRT-PCR) (3c). A szintek KRAS katalógusa mRNS szignifikánsan korrelált a KRAS katalógusa kópiaszám. A szomszédos gének LYRM5
és CASC1
, amely lokalizált a minimális amplikon is magasabb szinten expresszálódott a sejtekben amplifikációs olyan sejtekkel összehasonlítva, erősítés nélkül (3c ábrát). Érdekes, LRMP
volt alulszabályozott rákos sejtekben, mint a normális gyomor sejteket. Immunfoltelemzés RAS fehérjék (4a ábra) kimutatta, hogy a kifejezés a KRAS nőtt a KRAS katalógusa -amplified gyomorrák sejtek (HSC45, SH101P4 és MKN1), miközben sem a nemzeti szabályozó hatóságok, sem HRAS is erősen kifejezett (4a ábra; az adatokat nem mutatjuk ). Bár a kifejezés a let-7c, és hagyja,-7g mikroRNS leírták, hogy szabályozzák a ras-expressziót [8], azt találtuk, kis korrelációt expressziójának ezeket mikroRNS KRAS fehérje szint (Plusz fájl 12), amely azt sugallta, hogy a KRAS túltermelése gyomorrák sejtvonalak oka elsősorban a genomi erősítés KRAS katalógusa. 4. ábra túltermelése KRAS és differenciális aktivált KRAS, p44 /42 MAP-kináz és AKT KRAS -amplified gyomor rákos sejteket. (A) immunoblot elemzését expressziós szintjének KRAS- és a nemzeti szabályozó hatóságok a rákos sejtekben. Aktin expresszióját vizsgáltuk a kontrollként. (B) A bazális szintje GTP-KRAS volt jelentősen magas gyomorrák sejtek amplifikált mutáns KRAS katalógusa (HSC45 és SH101P4). Összesen lizátum (500 ng) vetettük alá egy GTP-RAS legördülő vizsgáltuk, és a GTP-KRAS és GTP-NRA-k detektáltuk immunoblot anti-KRAS és anti-NRA-k ellenanyagok, ill. Teljes sejtlizátumot (50 ug) analizáltuk párhuzamosan, hogy meghatározza a kifejeződésének szintje a KRAS és a nemzeti szabályozó hatóságok a sejtekben. (C) GTP-KRAS megemelkedett után a szérum stimuláció MKN1 sejtekben. A sejteket rendszeresen közegben, amely 10% FCS-t (N), a szérum-éheztetett 24 H (-) vagy szérum-éheztetett majd stimuláltuk 10% FCS-t, 1 H (+). Teljes sejtlizátumot maradékot egy GTP-KRAS legördülő vizsgálattal. (D) aktiválása p44 /42 MAP-kináz és AKT szérum-éheztetett vagy stimulált gyomorsav rákos sejteket.

• Genomra kiterjedő génkópiaszámra expressziós analízisét primer gyomor tumorok és gyomorrák sejtvonalakon
• Mechanizmusok gasztroprotekció metanol kivonat Melastoma malabathricum levelek