Strooman fibroblastien mikroympäristössä mahakarsinoomat edistää kasvainten etäpesäkkeiden kautta upregulating TAGLN ilme

Strooman fibroblastien mikroympäristössä mahakarsinoomat edistää kasvainten etäpesäkkeiden kautta upregulating TAGLN ilmaisu
tiivistelmä
tausta
Sidekudosmuodostussolujen ratkaiseva rooli kasvainten synnyssä, kasvainprogression ja etäpesäkkeitä. Kuitenkin, niiden yksityiskohtainen molekyyli- ominaisuudet ja kliininen merkitys on vielä epäselvää. TAGLN on aktiinia sitova proteiini, jolla on tärkeä rooli tuumorigeneesissä.
Tulokset
Tutkimme vuorovaikutusta syöpäsoluja ja kasvaimen mikroympäris- määrittää, miten fibroblastit ihmisen mahakarsinooman helpottaa kasvaimen kehittymisen kautta TAGLN. QRT-PCR ja Western blot osoitti, että TAGLN ilmentyminen yläreguloituja mahakarsinoo- liittyvien fibroblasteja (valuuttalisiin), jotka edistävät mahasyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Käyttämällä Sirna (siRNA), huomasimme, että valuuttalisiin tehostettu tuumorietäpesäke kautta yliaktiivista TAGLN in vitro ja in vivo. Ilmaisu matriksimetalloproteinaasi-2 (MMP-2) oli merkittävästi pienempi, kun TAGLN knock-alas siRNA. TAGLN tasot olivat koholla ihmisen mahasyövän strooman kuin normaali mahan strooman ja liittyy erilaistumiseen ja imusolmuke etäpesäke mahasyövän.
Päätelmä
valuuttalisiin voi edistää mahasyövässä solumigraatioon ja invaasion kautta upregulating TAGLN ja TAGLN aiheuttama MMP-2 tuotantoon.
avainsanat
TAGLN Fibroblastin mikroympäristölle Kasvaimen etäpesäkkeiden mahakarsinoo- Background
mahakarsinoo- on toiseksi yleisin syy syöpään liittyvistä kuolemantapauksista maailmassa, erityisesti Aasiassa [1, 2]. Suurin osa mahasyöpä potilasta kuoli kasvaimen uusiutumisen aiheuttamien etäpesäkkeiden. Etäpesäke on monivaiheinen prosessi, jolla syöpäsolut levittää ensisijaiselta kasvain ja tunkeutua ympäröivään kudokseen ja etäisyys elimiä, joihin syöpä solun liikkuvuus, intravasation, kauttakulku veressä tai imusolmukkeiden ja ekstravasaation [3]. Tämä prosessi riippuu tiukasti ympäröivään mikroympäristön ja kasvaimen kehitys on riippuvainen jatkuvasti välistä ylikuulumista syöpäsolujen ja solunulkoisen mikroympäristöihin [4].
Transgelin (TAGLN, joka tunnetaan myös SM22) on aktiini ristisilloitukseen proteiini, joka on osallisena kalsiumia vuorovaikutusta ja säätelee supistuvien ominaisuuksia [5]. Se voi olla rooli solujen erilaistumiseen, solumigraatio soluinvaasiota ja matriisi remodeling stabiloimalla solun tukirangan läpi aktiini sitova [6, 7]. Yli-ilmentyminen TAGLN-proteiinin on havaittu karsinoomat mahassa, maksassa, ja ruokatorven, kun taas vähentynyt taso TAGLN mRNA on havaittu rinta- ja paksusuolen syövän solulinjat ja primaariset kasvaimet [8].
On yleisesti hyväksytty, että kasvaimen -stroma vuorovaikutusten on tärkeä rooli kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen. Strooman muodostuu pääasiassa soluväliaineen (ECM) ja solun osia, kuten fibroblasteissa [9, 10]. Solukomponenttien strooman ovat hyvin tunnustettu tukeva rooli syövän synnyssä [11, 12]. Nämä peruskudoselementeistä toimivat synergistisesti rajat puhua syöpäsolujen ensisijaiselta sivustoja ylläpitää syövän kasvua ja etäpesäkkeiden [13, 14]. Kasvain strooman jota kutsutaan "reaktiivinen strooman" liittyy lisääntynyt määrä fibroblastit, parannettu kapillaari tiheys ja laskeuman uuden ECM runsaasti tyypin 1-kollageenia ja fibriinin [15]. Kertyvät Todisteiden mukaan stroomasolut, kuten fibroblastit on syvempi vaikutus kehitykseen ja etenemiseen karsinooma kuin aikaisemmin arvostettu [15-17].
Fibroblastit ovat tunnettuja pelata rooleja kasvainten synnyssä ja etenemisessä. Fibroblastit ilmaista vimentiinista, fibronektiini, α-sileän lihaksen aktiini (α-SMA), fibroblastien pinnan proteiini sekä fibroblastisen markkereita. Karsinooma liittyvä fibroblasteja (valuuttalisiin) ovat käytössä fibroblastit, biologisesti eroaa fibroblasteista läsnä hyvänlaatuinen mikroympäristöjen useita tärkeitä näkökohtia [17, 18]. Valuuttalisiin eivät passiivisia sivustakatsojia kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeitä, mutta edistävät aktiivisesti näihin prosesseihin [19]. Tietomme roolista lepo- ja aktivoituneiden fibroblastien syöpä kehittyy edelleen. Tässä keskitymme väliseen vuorovaikutukseen syöpäsolujen ja niiden mikroympäristöihin tutkia, miten fibroblasteja eristettiin ihmisen mahakarsinoomat helpottaa kasvaimen kehittymisen.
Tulokset
ilmentymistä TAGLN on yliaktiivista mahakarsinoo- liittyvien fibroblastit
karsinooma -associated fibroblasteissa (valuuttalisiin), vastine fibroblasteissa (CPFs) ja normaalien fibroblastien (NFS) saatiin ensisijainen kudosviljelmän käyttämällä kudoksia syöpään liittyvän alueilla, ei-syöpään liittyvä strooman ja normaali limakalvo, vastaavasti. Me tarkistaa sitten puhtauden eri fibroblasti populaatiot immunovärjäyksellä. Nämä fibroblasti populaatiot ilmensivät runsaita levls of fibroblastisia markkereita, kuten vimentiinista, α-SMA ja fibronektiiniä. Toisaalta, nämä solut eivät esittäneet epiteelin markkereita, kuten sytokeratiini (kuvio 1A). Nämä tiedot vahvistivat puhtauden fiborblasts. Nämä havainnot osoittavat, että kulttuuri solut olivat pääasiassa fibroblasteja valmistettiin pienellä saastumisen muihin soluihin. Kuva 1: n ilmentyminen TAGLN ylössäädellään mahalaukun syöpään liittyvän fibroblasteissa. V: luonnehdinta mahalaukun fibroblastien (ICC). a1: vimentiinista, positiivinen. a2: α-SMA, positiivinen. a3: fibronektiini, positiivinen. a4: sytokeratiini-, negatiivinen. Alkuperäinen suurennokset: × 200. Mittaviivat 100 pm. B: QRT-PCR-analyysi TAGLN valuuttalisien, CPF ja NF. *, P
< 0,05, **, P
< 0,01 verrattuna NF. C: Western blot-analyysi TAGLN valuuttalisien, CPF ja NF, TAGLN ekspressiotaso aleni peräkkäin. D: fibroblastit kasvukäyrä määritettiin CCK-8-määritys, valuuttalisiin kasvoi quickier kuin toiset. E: CAF oli suurempi kyky parantaa MKN-45: n muuttoliikettä kykyä kuin CPF ja NF, ***, P
< 0,001 verrattuna MKN-45. F: CAF oli suurempi kyky parantaa MKN-45: n hyökkäys kyky kuin CPF ja NF, *, P
< 0,05, **, P
< 0,01, verrattuna MKN-45.
MRNA: ta ja proteiinia tasot TAGLN olivat alhaisempia CPFs ja UE: verrataan valuuttalisiin (kuvio 1 B ja C). Ensin osoitti valuuttalisiin kasvoi merkittävästi enemmän kuin CPFs ja NFS in vitro solujen lisääntymisen (kuvio 1 D). Seuraavaksi toteutimme soluinvaasiota ja migraatiokokeessa testata onko hyökkäyksen ja muuttoliike kyky mahalaukun syöpäsoluja kuitenkin tehostaisi fibroblasteissa. Kokeen tarkoituksena oli tutkia vaikutuksia strooman TAGLN, joka erittää fibroblastit, ihmisen mahasyövän soluja. Sisäinen tasot TAGLN mahalaukun syöpäsoluissa voisi häiritä kokeellinen prosessi. Näin ollen meidän valitsi MKN-45 solulinjaa, koska sen TAGLN ilmentymisen taso oli alhaisin seitsemään mahasyövässä solulinjoissa (SNU-1, AGS, NCI-N87, KATOIII, MKN-45, MKN-28 ja SGC-7901; data ei näytetty). Mielenkiintoista, invaasion ja muuttoliike kyky MKN-45 kasvoi kaikissa kolmessa ryhmässä (valuuttalisiin, CPFs ja NFS), ja kasvoi eniten ryhmässä CAF (kuvio 1 E ja F). Hankinta maahanmuutto- ja invasiivisen käyttäytyminen on yksi vaiheiden metastaattisen prosessin.
Valuuttalisiin edistää kasvainten etäpesäkkeiden kautta upregulating TAGLN
vaikutuksen tutkimiseksi on TAGLN vuonna fibrobalsts, käytimme RNAi kaataa TAGLN ilme. Valuuttalisiin, CPFs ja NFS transfektoitiin TAGLN erityisiä tai ei-hiljaisuutta siRNA. RNA: ta ja proteiinia, saatiin 24, 48 tai 72 tuntia transfektion jälkeen, TAGLN mRNA: ta ja proteiinia tasot tutkittiin QRT-PCR: llä ja Western blot. TAGLN mRNA: ta ja proteiinia estivät merkittävästi käsitellyissä soluissa TAGLN-spesifisten siRNA (kuvio 2A ja B). Kuvio 2 valuuttalisiin parantaa kasvainsolulinjasta MKN-45 migraton ja hyökkäyksen kautta voimistunut TAGLN. V: TAGLN ilmentymisen QRT-PCR-analyysillä jälkeen siRNA knockdown fibroblasteissa. B: TAGLN ilmaus Western blot-analyysi jälkeen siRNA knockdown fibroblasteissa. C: solu migraatiokokeessa in vitro (fibroblastien kanssa tai ilman TAGLN siRNA häiriöitä). D: solu invaasiomääritys in vitro (fibroblastien kanssa tai ilman TAGLN siRNA häiriöitä). Arvot edustavat keskiarvoa ± SD vähintään kolmesta eri kokeesta, joista kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. *, P
< 0,05, **, P
< 0,01, ***, P
< 0,001, yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA).
Me tutkimme seuraavaksi hyökkäyksen ja muuttoliike kyky mahalaukun syöpäsoluja tehostetaan ilmentymistä TAGLN fibroblasteissa, toteutimme soluinvaasiota ja migraatiokokeessa in vitro . Fibroblastien ja MKN-45 oli ei-contactedly viljeltiin yh-. Mielenkiintoista, invaasion ja muuttoliike kyky MKN-45 väheni välittömästi ryhmässä valuuttalisiin ja laski hieman ryhmässä CPFs ja NFS. Tulokset osoittivat, että hyökkäys ja muuttoliike kyky MKN-45 voi vähentää kautta alas-ekspressiota sääteleviä TAGLN (kuvio 2C ja D).
Sen arvioimiseksi osuus valuuttalisiin-TAGLN kasvaimen etäpesäkkeiden in vivo, me emplyed ksenograftimallia. Me sekoittaa TAGLN siRNA valuuttalisiin, ei-vaiennetaan valuuttalisiin, CPFs ja NFS kanssa MKN-45 ihmisen mahalaukun syöpäsoluissa 2: 1-suhteessa tai MKN-45 yksin ja ympättiin näihin soluihin pyrstö suonensisäisen injektion immuunipuutteisilla nude-hiirissä. Jälkeen 6 viikkoa, MKN-45 sekoitetaan valuuttalisiin tuotti enemmän keuhkojen etäpesäkenystyröiden kuin MKN-45 sekoitetaan TAGLN siRNA valuuttalisiin, CPFs ja UE: samanlainen MKN-45 sekoitetaan ei-hiljaisuutta siRNA valuuttalisiin (taulukko 1). Nämä tiedot osoittivat, että valuuttalisiin osoittavat lisääntynyttä kykyä stimuloida kasvaimen etäpesäkkeiden (kuvio 3A ja B). Kaikki havainnot osoittivat, että läsnä ollessa valuuttalisiin, kasvaimia tuli aggressiivinen, mikä viittaa siihen, että valuuttalisiin voisi olla rooli edistämisessä etäpesäkkeiden mahasyövän. Kuvio 3 TAGLN parantaa kasvaimen metastaasin kautta ihmisen ksenograftimallissa in vivo. V: nude-hiirissä etäpesäkenystyröiden keuhkoissa. a1: keuhko etäpesäkenystyröiden peräisin tomur-laakeri hiiri. Arrow: metastaattinen kyhmy. a2: ei metastaattisen kyhmy keuhkoissa. a3: H &E-värjäystä varten keuhko metastaattisen kyhmyn alle kirkkaan kentän mikroskoopilla. Mittaviivat 200 um. a4: H &E-värjäystä varten keuhkojen ilman metastaattisen kyhmy kirkkaassa-kentän mikroskoopilla. Mittaviivat 200 um. B: kvantifiointi nude-hiirten keuhkojen etäpesäkenystyröiden eri ryhmissä kautta hännän suonensisäisen injektion. *, P
< 0,05, yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA).
Taulukko 1 Nude-hiirten keuhko etäpesäkenystyröiden eri ryhmissä kautta hännän suonensisäinen injektio (Kukin ryhmä sisälsi 6 hiirtä) B ryhmät
TAGLN siRNA CAF -MKN45
kuin hiljaisuus siRNA CAF-MKN45
CAF-MKN45
CPF-MKN45
NF-MKN45
MKN45 yksin
määrä kasvainta kantavien hiirten
2
5
5
3
2
2
määrä etäpesäkenystyröiden
2
10
9
5
3
2
TAGLN edistää kasvaimen etäpesäke säätelemällä MMP-2
Useat tutkimukset ovat keskittyneet roolista matriisin metalloproteinaasien (MMP) on hyökkäys ympäröivän sidekudoksen ja etäpesäkkeiden tuumorisolujen ensisijainen vaurio kaukaisiin kohtiin kasvaimen etenemiseen [20, 21]. Aiemmissa työssä, tutkimme MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7: n ja MMP-9 tasoa jälkeen TAGLN knock-down by siRNA kautta ELISA, vain MMP-2 taso oli merkitsevästi alassäädetty, muut MMP tasot eivät osoittaneet muutosta. Näin ollen meidän focued on MMP-2 tässä tutkimuksessa. Kuten kuva 4A osoitti, verrattuna MKN-45 yhteistyö coultured CAF /neg ja CAF /mock, MMP-2 tasot supernatantissa MKN-45 viljeltiin yhdessä CAF /siTAGLN merkittävästi tukahdutettu. Tutkimme seuraavaksi MMP-2 käyttäen gelatiinitsymografialla määritystä. Löysimme MMP-2-aktiivisuus dramaattisesti inhiboitui supernatanttia MKN-45 viljeltiin yhdessä CAF /siTAGLN kuin CAF /neg ja CAF /mock (kuva 4B). Siten TAGLN voi parantaa kasvaimen etäpesäke kautta MMP-2 entsyymit hajottavat tyvikalvoissa (esim. Kollageeni IV). Kuva 4 TAGLN parantaa kasvaimen etäpesäke mukaan voimistuvan MMP-2. V: MMP-2 ilmaisun CAF, pienenee selvästi jälkeen TAGLN RNAi ELISA. *, P
< 0,05 yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA). Virhejanat esittävät keskivirhettä keskiarvon ympärillä. B: pudotus TAGLN heikentynyt kyky CAF salaisia ​​MMP-2 gelatiinitsymografialla.
TAGLN ilmentymistä ihmisen mahasyövän ja sen yhdessä erilaistumista mahasyöpäpotilaista
arvioimiseksi TAGLN ilmentymistä mahasyövän, TAGLN immunovärjäykseen 98 ensisijainen mahasyövässä kudokset tutkittiin. TAGLN ilmentyminen säädeltiin ihmisen mahasyövän strooman verrattuna normaaliin mahalaukun kudoksesta (Kuva 5A: normaali mahalaukun kudoksesta; Kuva 5B: mahasyövässä kudosta). Korrelaatio TAGLN ilmaisun kanssa kliinis oli esitetty taulukossa 2. TAGLN tasot olivat korkeammat eriytymättömissä kasvaimissa (huonosti eriytetty adenokarsinoomat, sinettisormus solukarsinoomat ja mucinous karsinoomat) kuin että erilaistuneet (hyvin ja kohtalainen adnocarcinomas) (P
= 0,003). Lisäksi TAGLN tasot korreloi imusolmuke etäpesäke (P
= 0,029). Ei ollut merkittäviä eroja kasvaimen TAGLN ilmaisun mukaan toiselle kliinis ominaisuuksia, kuten sukupuoli, ikä, kasvaimen koon, Lauren luokittelu, T vaiheessa etäisyys etäpesäke ja TNM-luokitus (P
≥ 0,05). Kuva 5 ilmentäminen TAGLN ihmisen mahasyövän kudoksiin. V: TAGLN ilmentymisen taso normaalissa mahalaukun kudokseen IHC. Mittaviivat 100 pm. B: TAGLN yliekspressoituu stroomaan ihmisen mahalaukun syövän IHC. Mittaviivat 100 pm. C: TAGLN mRNA yliaktiivista ihmisen mahasyövän analysoitiin QRT-PCR. D: TAGLN proteiini yliaktiivista ihmisen mahasyövän analysoitiin Western blot. Arvot edustavat keskiarvoa ± SD vähintään kolmesta eri kokeesta, joista kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. *, P
< 0.001 paried-näytteet T
testi.
Taulukko 2 kliinis yhdistysten TAGLN ilmaisun mahasyövän
Tapausten lukumäärä
TAGLN immunovärjäyty-
P

Heikko (+)
Strong (++)
Sukupuoli
0,778
Mies
60
27
33
Nainen
38
16
22
Ikä
0,739
≤60y
46
21
25
> 60y
52
22
30
Tuumorikoko
0,852
≤5 cm
58
25
33
> 5 cm
40
18
22
eriyttäminen
0,003
No + Kohtalainen
46
13
33
Huono
52
30
22
Lauren luokitus
0.059
Suoliston
40
13
27
Diffuusi
58
30
28
T vaiheessa
0,142
T1 + T2
56
21
35
T3 + T4
42
22
20
Imusolmuke etäpesäke
0,029
N0
27
11
16
N1
32
15
17
N2
26
7
19
N3
13
10
3
etäpesäkkeiden
0,709
Ilman
95
42
53
With
3
1
2
TNM
0,722
I
20
7
13
II
25
11
14
III
30
10
20
IV
23
15
8
myös käytimme QRT-PCR ja Western blot arvioida ilmentymistä TAGLN mahasyövän kudoksissa (kuvio 5C ja D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että TAGLN ilmentymistä mahasyövässä kudoksissa oli paljon suurempi mahasyövän kuin että pariksi normaaleissa kudoksissa.
Keskustelu
Kertyvät todisteet osoittavat, että syöpä taudin alkamisen ja etenemisen mukana vuorovaikutukset sekä kasvaimen ja stroomasoluissa. Tuumorisolut voidaan aktiivisesti rekrytoimaan stroomasolut, kuten verisuonten solujen, sileitä lihassoluja ja fibroblastien, kasvaimeen, mikä tuottaa mikroympäristön edistää kasvaimen kasvua [16, 22, 23]. Fibroblastit usein muodostavat suurimman osan strooman solujen mahalaukun karsinooma, mutta funktionaalinen osuus näiden solujen kasvaimien syntyyn ja kasvaimen etäpesäkkeiden edelleen heikosti ymmärretty.
TAGLN on yksi varhaisimmista merkkiaineiden sileän lihaksen erilaistumisen alkionkehityksen aikana [24], ja aiemmat tutkimukset liittyvät TAGLN lähinnä sileän lihaksen soluissa [25]. Patologisia tiloja, johon liittyy kudoksen uudelleen ja fibrogenesis, kuten haavan paraneminen ja neoplastisia vaurioita, on ominaista ulkonäön strooman solujen Mikroskooppitutkimus ominaisuuksia välimuoto näiden tyypillisten fibroblastien ja ne, sileän lihaksen soluissa. Nämä fibroblastit näytteille fenotyyppiset ja toiminnalliset ominaisuudet sileän lihaksen soluissa ja siten on nimetty myofibroblasteja [26], kuten valuuttalisien. Tutkimuksessamme TAGLN yliekspressio havaittiin myös valuuttalisien. On todettu, että TAGLN proteiinin yli-ilmentyy mahasyövän, kun proteiinin ilmentymisen spektri mahasyövän analysoitiin käyttämällä kaksiulotteista geelielektroforeesia (2-DE) [27]. Lisäksi TAGLN proteiini on toinen kasvaimeen liittyviä antigeenejä, joita havaittiin seerumissa munuaiskarsinooman potilaiden Klade käyttäen 2-DE-[28]. Nämä raportit ovat sopusoinnussa havaintojen jotka olemme havainneet käyttäen reaaliaikaista PCR ja Western Blot. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että TAGLN pääasiassa havaittu fibroblasteissa, jotka ovat peräisin kasvaimeen strooman sijaan kasvainsoluissa. Myös muut tutkijat havaitsivat, että TAGLN ei ilmenny pahanlaatuisia soluja vaan mesenkymaaliset tuumoriverisuonien strooman [27].
Stroomakasvaimet fibroblastien säädellä endoteeli- tai epiteelisolujen käyttäytymistä suoraan ja välillisesti solu-cel1 vuorovaikutuksia. Aktivointi isäntä stroma1 mikroympäristön ajatellaan olevan kriittinen vaihe kasvaimen kasvua ja etenemistä [13, 29]. Erittämät proteiinit stroomasolulinja kasvaimissa voi positiivisesti tai negatiivisesti vaikuttaa syövän etenemiseen. Näkyvin toimet TAGLN saattaa suosia kasvainten soluliikkuvuus ja invaasiota [7, 30, 31]. Huomasimme, että TAGLN oli merkittävästi lisääntynyt imusolmuke etäpesäke ryhmä kuin imusolmuke negatiivinen ryhmä. Jotta c1arify roolin TAGLN vuonna strooman fibroblasteissa aikana mahasyövässä tumorigenesis ja etäpesäkkeiden, me tukkinut TAGLN ilmentymistä ihmisen valuuttalisien. Se osoitti, että vain MKN-45 viljeltiin yhdessä valuuttalisiin ilmentävien korkeatasoinen TAGLN näytteillä paljon korkeampi hyökkäyksen ja muuttoliike kyky. Fibroblastit joka TAGLN oli kaatanut ei näytä tätä toimintoa. Yhdessä ehdotamme, että TAGLN voisi olla syynä parantamiseksi mahalaukun syöpäsolumetastaasi kautta stromasoluja kuten valuuttalisiin.
TAGLN ilmentyminen lisääntyy merkittävästi mahalaukun valuuttalisien. Valuuttalisiin lisääntynyt TAGLN ekspressiotasot voivat parantaa kasvainsolun invaasiota ja muuttoliike kyky, joka edistää tehostettua MMP-2. Stimulaatio MMP ilmentymisen fibroblasteissa joko sen jälkeen, kun suoraan kosketukseen kasvainsolujen tai sen jälkeen kosketukseen kasvainsolujen peräisin olevan liukoisen tekijät kasvaimista peräisin epiteelisolujen on osoitettu useissa tutkimuksissa [32-35]. Selkeyttäminen mekanismit voivat siis vaimentaa kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäke mahalaukun syöpäpotilailla.
Johtopäätökset
Yhteenvetona Tutkimuksemme osoittaa, että valuuttalisiin voivat edistää mahasyövässä solumigraatioon ja invaasion kautta lisäsi MMP-2: n tuotantoa aiheuttama TAGLN säätelyä . Tool menetelmät
kudosnäytteitä
yhteensä 40 paria syöpäkudokset ja vastaavassa normaalissa limakalvolle QRT-PCR ja Western blot ja 98 ensisijaisen mahasyövistä immunovärjäämistä kerättiin kirurgisesti poistettu mahasyövän diagnosoitu laitoksella Kirurgian Ruijin sairaala, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Normaali limakalvon näytteitä otettiin marginaali resektio jossa kasvaimia sijaitsevat vähintään yli 6 cm: n päässä siitä. Tämä tutkimus protokollan hyväksyy riippumaton eettinen komitea on Ruijin sairaala, Shanghai Jiaotong yliopisto, School of Medicine. Tietoon perustuva suostumus oli kirjoitettu. Kaikki näytteet jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä yli yön ja pidettiin -80 ° C: ssa ennen käyttöä. 4% Formaldehydi-kiinteä kudosleikkeiden sekä kasvaimen ja limakalvon värjättiin H &E ja tutkittiin ja tarkistettiin histopatologisesti kaksi patologia. Kukin näyte johtuvan diagnoosin ja pisteytettiin Lauren luokitusta, erilaistuminen, pTNM vaiheessa. Kasvaimen koko, sijainti ja muut kliiniset patologiset ominaisuudet saatiin kliiniset tiedot potilaan luvalla.
Solulinjat
Mahasyöpää solulinjoissa SNU-1 (ATCC: CRL-5971), AGS (ATCC: CRL-1739), NCI-N87 (ATCC: CRL-5822) ja KATOIII (ATCC: HTB-103) saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Toinen 3 mahasyöpä solulinjoissa, MKN-45, MKN-28 ja SGC-7901, säilytettiin meidän instituutti. Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä RPMI-1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS).
Vasta-
ensisijainen vasta-aineita, joita käytetään värjäyksessä sisältyvät ihmisen spesifisen anti-vimentiinista (Abcam, Cambridge, UK), anti-fibronektiini ( Abcam, Cambridge, UK), anti-α-sileän lihaksen aktiini (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA), anti-pan-sytokeratiini (Abcam, Cambridge, UK), anti-SM22 (Abcam, Cambridge, UK) , ja hiiren anti-GAPDH (Kangchen, Kiina).
eristäminen ihmisen mahalaukun fibroblastien
fibroblasteja eristettiin syöpää ja ei-syöpään liittyvien alueiden mahalaukun kudosten leikeltiin potilaalla on mahasyöpä aikana radikaali mahalaukun resektio alkaen Department of Surgery, Ruijin sairaala, Shanghai Jiao Tong-yliopiston medcine. Syöpä liittyvät alueet valittiin olemaan minimaalisesti nekroottisen alueiden kasvaimen massan. Ei-syöpään liittyvän strooman, joka eristettiin kudoksista vähintään 2 cm distaalisesti ulkoreuna syövän massa. Normaali limakalvon näytteitä otettiin marginaali resektio jossa kasvaimia sijaitsevat vähintään yli 6 cm: n päässä siitä. Kudokset jauhettiin organoids noin 1 mm, 3 ja ympättiin päällystämättömän muovista RPMI 1640-alustassa, joka sisälsi ihmisen emäksinen fibroblastikasvutekijä, 20% vasikan sikiön seerumia (FCS) ja penisilliiniä ja streptomysiiniä, kuten antibiootteja. Nämä olosuhteet tuottivat homogeeninen fibroblastinen solupopulaation jälkeen 7 päivää viljelyn. Kukin fibroblasti sitten laajeni 1: 3 suhde trypsiini-EDTA tulee 10 cm petrimaljoihin. Käytimme fibroblastit siirrostaa jopa 8 populaation kaksinkertaistumista (PD) myöhempää kokeissa minimoimiseksi kloonijalostus ja kulttuuri stressiä, joka voi esiintyä laajennettu kudosviljelmässä.
Immunohistokemiallinen värjäys (IHC) B Soluja tai kudoksia fiksoitiin 30 minuuttia 4% formaliinilla ja huuhdottiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Sen jälkeen, kun endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus oli sammutettiin 0,3% H 2O 2, solut estettiin normaaleissa nonimmune seerumissa 30 minuuttia ennen kuin ne inkuboitiin primaarisen vasta-aineen 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan. Soluja tai kudoksia, leimat- tiin sitten streptavidiini-biotiini-piparjuuriperoksidaasi-värjäykseen tarkoitettua reagenssipakkausta (Dako, Carpinteria, CA, USA). Läsnäolo merkitty peroksidaasilla osilla tehtiin näkyväksi inkuboimalla 3,3 '- diaminobentsidiini, DAB + alustan kromogeenista tai leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Negatiivinen kontrolli dioja suoritettiin jättäminen ensisijaisen vasta-aineen.
TAGLN ilmentyminen arvioitiin intensiteetti värjättyjen solujen, ja määritetään kahteen luokkaan (heikko positiivinen ja vahva positiivinen). Värjäytymisintensiteettiä oli luokiteltu neljään luokkaan (intensiteetti pisteet): ei värjäytymistä (luokka 0), vaaleanruskea värjäytymistä (luokka 1), ruskea värjäytyminen (luokka 2), ja tummanruskea värjäystä (aste 3). Grade 0 ja luokka 1 määriteltiin heikko positiivinen, luokka 2 ja 3. asteen määriteltiin vahva positiivinen.
Quantitative reaaliaikainen PCR (QRT-PCR) B Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA saatiin 1 ug: lla RNA: sta käyttämällä käänteisen Transcription System Kit (Promega, Madison, WI, USA) ja QRT-PCR suoritettiin SYBR Green PCR core Reagent Kit (Applied Biosystems, Warrington, UK). Spesifisiä alukkeita ja TAGLN olivat seuraavat: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 "(ylempi), 5 ' - GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 " (alempi). Glyserolin-telmillä-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin endogeenisen viitteenä. Sen sekvenssit olivat 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (ylempi), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 "(alempi). QRT-PCR kvantitoimiseksi mRNA tasoilla TAGLN tehtiin ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Tiedot analysoitiin käyttäen vertailevaa Ct menetelmällä. Spesifisyys Saatu PCR-tuotteiden varmistettiin sulamiskäyrillä.
Western blot
Solut kerättiin ja lyysattiin nisäkkään proteiini uuttamalla reagenssia (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteiinikonsentraatiot määritettiin bikinkoniini- hapon (BCA) proteiinimäärityksellä (Pierce, Rockford, IL, USA). Näytteet, jotka sisälsivät 50 ug kokonais-proteiinia ladattiin kuhunkin kaistaan ​​12% akryyliamidia geeliä minigeelissä laite (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Erotetut proteiinit siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvolle (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Sen jälkeen, kun niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (1: 1000) ja HRP-konjugoidulla sekundäärisellä vasta-aineella (1: 5000), vastaavasti, immuuni- komplekseja havaittiin tehostettu kemiluminesenssi (ECL) järjestelmä (Millipore, Bedford, MA, USA).
Enzyme linkatun (ELISA)
proteiini MMP-2 supernatanteissa mitattiin ELISA-kitillä (R &D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Solukasvu määritys
eri soluja (1 x 10 3) ympättiin 96-kuoppalevyille kolmena kappaleena. Määrä elinkelpoisia soluja, määritettiin päivittäin käyttäen Cell Counting Kit (CCK-8) käyttäen erittäin vesiliukoista tetratsoliumsuolaa WST-8 [2- (2-metoksi-4- nitrofenyyli) -3- (4-nitrofenyyli) -5- (2,4-disulfofenyyli) -2H-tetratsolium, mononatriumsuola] (Dojindo, Japan). Lyhyesti, 20 ui CCK-8 liuokseen lisättiin levyille, absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin 4 tunnin inkubaation jälkeen.
Arviointi kasvaimen invaasion ja muuttoliike
kasvaimen invaasion ja migraatiomääritys suoritettiin QCMTM24-hyvin hyökkäystä kit (Millipore, Bedford, MA, USA) ja QCMTM24-hyvin muuttoliike kit (Millipore, Bedford, MA, USA) protokollan mukaisesti valmistajan toimittamien, vastaavasti. Lisää valmis MKN-45-solususpensiota (2 x 10 5 solua /kuoppa), jolloin ylempään kammioon ja lisätä pre-keskeytetty fibroblasteissa (5 x 10 4 solua /kuoppa RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 20% FBS: a) ja alempaan kammioon. TAGLN Joidenkin fibroblastien alakammioissa estyi käyttämällä siRNA 24 tuntia myöhemmin. MKN-45 ja fibroblastit olivat viljeltiin yh- kuin contactedly 48 tunnin ajan, sitten lysised solut ja määritetään RFU arvot fluoresenssilevylukijaa käyttäen 480/520 nm suodatin sarja.
TAGLN siRNA
Qiagen ohjelmistoa käytettiin suunnitella RNAi-sekvenssien kohdistaminen ihmisen TAGLN (liittymistä ei. NM_003186), ja siRNA-sekvenssi, jolla on korkein oletetun tehokkuuden (sense: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ', antisense: 5 '- UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ) syntetisoitiin Shanghai GeneChem Co, Ltd. siRNA Satunnaistetuilla sekvenssi (sense: 5 '- UUCUCCGAACGUGUCACG Utt-3 ', antisense: 5 '- ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 ) vastaan ​​ei geeni (salattu siRNA ryhmä) transfektoitiin sisäisenä kontrollina. Kokeissa solut transfektoitiin DOTAP liposomaalisen transfektion reagenssia (Roche, Saksa). Solut ympättiin 2 x 10 5 solua /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä. 24 tunnin kuluttua, kun solut olivat vaiheessa log kasvun, 250 pl Opti-MEM I sekoitettiin 5 ui 20 uM siRNA duplex, kun taas toinen 250 pl Opti-MEM olin erikseen inkuboitiin 11,88 ui DOTAP liposomin. Kahta seosta, sekoitettiin varovasti ja inkuboitiin noin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Transfektioon, koko seos lisättiin kuhunkin kuoppaan 1,5 ml tuoretta väliainetta ilman antibiootteja. Lopullinen transfektoidut pitoisuus siRNA oli 20 nM. Solut kerättiin edelleen kokeessa 24, 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen.
Gelatiinitsymografialla
Viljelmän supernatantit kerättiin 24 tuntia ja sekoitetaan geelin näytepuskuria (0,5 M Tris-HCl: a, glyserolia, 10% natriumdodekyylisulfaatti [SDS], β-merkaptoetanolia ja 0,5% bromifenolisinistä). Kymmenen mikrogrammaa proteiinia otettiin SDS-PAGE erottaminen; SDS-PAGE-geelit sisälsivät 0,1% gelatiinia (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Elektroforeesin jälkeen geelit pestiin 50 mM Tris-puskurissa, joka sisälsi 2,5% Triton X-100. Geelejä inkuboitiin vielä 24 tuntia in inkuboinnin nesteen (50 mM Tris-puskuria [pH 7,6], 10 mM CaCl 2, ja 200 mM NaCl). Geelit värjättiin 0,5% Coomassie-sinisellä, valkoinen nauhojen (72 kDa), sinisellä pohjalla osoitti vyöhykkeet ruuansulatusta läsnäoloa vastaavat MMP-2.
Hiirimalli
Naaraspuoliset BALB /c nu /nu
nude-hiirissä, samanikäisiin 4-5 viikon ajan (Institute of Zoology Kiinan tiedeakatemia), pidettiin häkeissä tietyllä patogeenittomassa ympäristön Animal Laboratory Unit, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kiina. Fibroblastit ja MKN-45 sekoitettiin suhteessa 1: 4 sisällä 0,1 ml PBS: ää ja injektoitiin sivusuunnassa häntälaskimoon. Kuusi hiirtä otettiin mukaan kunkin ryhmän kaikissa kokeissa, ja kukin koe suoritettiin kahdesti. Eläimet lopetettiin ja keuhkojen etäpesäkenystyröiden rekisteröitiin 6 viikkoa sen jälkeen, kun kasvainsolujen istutuksen. Tuumorinäytteet kerättiin, sekoitettiin formaliiniin, valettiin parafiiniin, ja sille suoritettiin H &E-värjäystä. P
< Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Co-esiintyminen useiden aivoinfarktien johdosta liikahyytymiskykyyn liittyvän pahanlaatuisen ja aivokalvon carcinomatosis kuin alkuperäinen osoitus mahalaukun cancer
• Onko mahalaukun tonometria-ohjattu hoito vähentää kokonaiskuolleisuutta kriittisesti sairaiden potilaiden?