Stromale fibroblasten in de micro-omgeving van de maag carcinomen bevorderen tumor metastase via upregulating TAGLN expression

stromale fibroblasten in de micro-omgeving van de maag carcinomen bevorderen tumor metastase via upregulating TAGLN uitdrukking
Abstracte achtergrond
fibroblasten een belangrijke rol in het ontstaan ​​van tumoren, tumor te spelen progressie en metastase. Echter, hun gedetailleerde moleculaire kenmerken en klinische betekenis zijn nog steeds ongrijpbaar. TAGLN is een actine-bindend eiwit dat een belangrijke rol speelt bij tumorvorming.
Resultaten
We onderzochten de interactie tussen kankercellen en tumor micro te bepalen hoe de fibroblasten van humane maagcarcinoom vergemakkelijken tumorigenese tot TAGLN. QRT-PCR en Western blot gaf aan dat TAGLN expressie werd opgereguleerd in de maag-carcinoom geassocieerd fibroblasten (cafe's), die maagkanker cel migratie en invasie te promoten. Met behulp van kleine interfererende RNA (siRNA), vonden we dat CAF verbeterde tumormetastase tot opgereguleerd TAGLN in vitro en in vivo. De expressie van matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) was significant lager na TAGLN neerhalen van siRNA. TAGLN niveaus werden verhoogd in menselijke maagkanker stroma dan normaal maag stroma en in verband met differentiatie en lymfeklieren metastase van maagkanker.
Conclusie
cafe's kan maagkanker cel migratie en invasie te bevorderen via upregulating TAGLN en TAGLN veroorzaakte MMP-2 productie.
Sleutelwoorden
TAGLN fibroblast Microenvironment Tumormetastase Maagcarcinoom Achtergrond
Maagcarcinoom is de tweede meest voorkomende oorzaken van kanker-gerelateerde sterfgevallen in de wereld, vooral in Azië [1, 2]. De meeste van maagkanker patiënten overleden terugkeer van de tumor veroorzaakt door metastasen op afstand. Metastase is een multi-stage proces waarbij kankercellen te verspreiden uit de primaire neoplasma en binnenvallen omliggende weefsel en afstand organen, waarbij kankercel beweeglijkheid intravasation, transit in het bloed of lymfe en extravasatie [3]. Dit proces is afhankelijk stevig op de omringende micro en tumorontwikkeling berust op een continue overspraak tussen kankercellen en extracellulaire micro-omgevingen [4].
Transgelin (TAGLN, ook bekend als SM22) is een actine verknoping eiwit dat betrokken is calcium interacties en reguleert contractiele eigenschappen [5]. Het kan een rol spelen bij celdifferentiatie, celmigratie en celinvasie matrix remodeling spelen bij het stabiliseren van het cytoskelet tot actinebindende [6, 7]. Overexpressie van TAGLN eiwit waargenomen bij carcinomen van de maag, lever, en de slokdarm, terwijl verlaagde TAGLN mRNA in borst- en colonkanker cellijnen waargenomen en primaire tumoren [8].
Algemeen wordt aanvaard dat tumor -stroma interacties spelen een belangrijke rol bij de tumorontwikkeling en progressie. Het stroma bestaat voornamelijk uit extracellulaire matrix (ECM) en cellulaire elementen, zoals fibroblasten [9, 10]. De cellulaire bestanddelen van de stroma zijn goed erkend als een ondersteunende rol bij carcinogenese [11, 12]. Deze stromale elementen werken op een synergistische overspraak met kankercellen uit de primaire locaties groei en metastase van kanker [13, 14] te ondersteunen. De tumor stroma die wordt aangeduid als een "reactieve stroma" wordt geassocieerd met een verhoogd aantal fibroblasten, verbeterde capillaire dichtheid en plaatsing van een nieuwe ECM rijk type 1 collageen en fibrine [15]. Werd bewezen onthult dat stromale cellen, zoals fibroblasten hebben een grote invloed op de ontwikkeling en progressie van carcinoma dan eerder werd gewaardeerd [15-17].
Fibroblasten zijn bekende rollen spelen bij tumorigenese en progressie. Fibroblasten express vimentine, fibronectine, α-gladde spier actine (α-SMA), fibroblast oppervlakte-eiwit en fibroblast merkers. -Carcinoom geassocieerd fibroblasten (cafe's) zijn geactiveerd fibroblasten, biologisch verschillend van fibroblasten aanwezig in goedaardige micro-omgevingen in een aantal belangrijke aspecten [17, 18]. Cafe's zijn geen passieve toeschouwers in het ontstaan ​​van tumoren en metastase, maar een actieve bijdrage aan deze processen [19]. Onze kennis over de rol van rustende en geactiveerde fibroblasten in kanker is nog in ontwikkeling. Hier richten we ons op de interactie tussen kankercellen en hun microenvironments te onderzoeken hoe de fibroblasten geïsoleerd uit menselijke maag carcinomen ontstaan ​​van tumoren te vergemakkelijken.
Resultaten
De expressie van TAGLN wordt opgereguleerd in de maag-carcinoom geassocieerd fibroblasten Ondernemingen De carcinoom geassocieerde fibroblasten (cafe's), tegenhanger fibroblasten (CPF) en normale fibroblasten (NFS) werden verkregen uit primaire weefselkweek gebruik van weefsels van kanker-geassocieerde regio's, niet-kanker-geassocieerde stroma en de normale slijmvlies, respectievelijk. Vervolgens hebben we de zuiverheid van de verschillende fibroblast populaties geverifieerd door immunokleuring. Deze fibroblast populaties uitgedrukt hoge levls van fibroblast merkers zoals vimentine, α-SMA en fibronectine. Anderzijds hebben deze cellen niet epitheliale merkers zoals cytokeratine (Figuur 1A) drukken. Deze gegevens bevestigden de zuiverheid van de fiborblasts. Deze waarnemingen geven aan dat de kweekcellen waren overwegend fibroblasten werden bereid met minimale verontreiniging door andere cellen. Figuur 1 De expressie van TAGLN opgereguleerd in gastrische kanker geassocieerde fibroblasten. A: karakterisering van de maag fibroblasten (ICC). a1: vimentine, positief. A2: α-SMA positieve. a3: fibronectine, positief. a4: cytokeratine, negatief. Originele vergrotingen: × 200. Schaalbalken, 100 urn. B: QRT-PCR-analyse van TAGLN in CAF, CPF en NF. *, P Restaurant < 0,05, **, P Restaurant < 0,01, vergeleken met NF. C: Western blot analyse van TAGLN in CAF, CPF en NF, werd TAGLN expressieniveau achtereenvolgens verlaagd. D: fibroblasten groeicurve werden bepaald door CCK-8 assay CAF groeide quickier dan anderen. E: CAF hadden een hogere capaciteit om MKN-45's migratie vermogen dan CPF en NF verbeteren, ***, P Restaurant < 0,001 vergeleken MKN-45. F: CAF hadden een hogere capaciteit om MKN-45's invasie vermogen dan CPF en NF verbeteren, *, P Restaurant < 0,05, **, P Restaurant < 0,01, vergeleken met MKN-45. Ondernemingen De mRNA en eiwitniveaus van TAGLN lager bij CPF en NF tegenover CAF (Figuur 1B en C). We hebben laten zien dat de eerste cafe's groeide aanzienlijk meer dan CPF en NFS in vitro cel proliferatie (figuur 1D). Vervolgens voerden we invasie en migratie assay te testen of de invasie en migratie vermogen van maagkanker cellen worden verbeterd door fibroblasten. Het experiment werd ontworpen om de effecten van stroma TAGLN, die werd uitgescheiden door fibroblasten, menselijke maagkanker cellen te onderzoeken. De interne niveaus van TAGLN bij maagkanker cellen zou het experimentele proces bemoeien. Daarom kozen we MKN-45 cellijn, omdat zijn TAGLN expressie niveau was de laagste in zeven maagkanker cellijnen (SNU-1, AGS, NCI-N87, KATOIII, MKN-45, MKN-28 en SGC-7901; data niet laten zien). Interessant is dat de invasie en migratie vermogen van MKN-45 verhoogd in alle drie de groepen (cafe's, CPF en NFS), en verhoogde de meeste in de groep met CAF (figuur 1E en F). De overname van migratie en invasief gedrag is één van de stappen in het metastatische proces.
Cafe's te bevorderen door middel van tumor uitzaaiingen upregulating TAGLN Belgique Om het effect van TAGLN in fibrobalsts onderzoeken, gebruikten we RNAi te knock down TAGLN expressie. Cafe's, CPF en NFS werden met TAGLN-specifieke of niet-stilte siRNA. RNA en eiwit werden verkregen bij 24, 48 of 72 uren na transfectie TAGLN mRNA en eiwitniveaus werden onderzocht door QRT-PCR en Western blot. TAGLN mRNA en eiwit werd significant geremd in cellen behandeld met TAGLN-specifiek siRNA (figuur 2A en B). Figuur 2 cafe's te verbeteren tumorcellijn MKN-45 migraton en de invasie door middel van opgereguleerd TAGLN. A: expressie TAGLN door QRT-PCR-analyse na siRNA knock-down in fibroblasten. B: TAGLN expressie door Western blot analyse na siRNA knock-down in fibroblasten. C: celmigratie assay in vitro (fibroblasten met of zonder TAGLN siRNA interferentie). D: invasie assay in vitro (fibroblasten met of zonder TAGLN siRNA storing). De waarden geven het gemiddelde ± SD van ten minste drie afzonderlijke experimenten, elk in drievoud uitgevoerd. *, P Restaurant < 0,05, **, P Restaurant < 0,01, ***, P Restaurant < 0.001, door one-way variantie-analyse (ANOVA).
Vervolgens onderzochten we of de invasie en migratie vermogen van maagkanker cellen zal worden versterkt door de expressie van TAGLN in fibroblasten, voerden we cel invasie en migratie test in vitro . Fibroblasten en MKN-45 waren niet-contactedly samen gekweekt. Interessant is dat de invasie en migratie vermogen van MKN-45 daalde onmiddellijk in de groep met CAF en daalde in de groep met CPF en NF. De resultaten toonden aan dat de invasie en migratie vermogen van MKN-45 kan afnemen door middel van down-reguleren van de expressie van TAGLN (figuur 2C en D).
Om de bijdrage van CAF-TAGLN tumormetastase in vivo te evalueren, we emplyed een xenograft model. We gemengd TAGLN siRNA CAF, niet zwijgen cafe's, CPF en NFS met MKN-45 menselijke maagkanker cellen in een 2: 1 verhouding of MKN-45 staan ​​geïnoculeerd deze cellen via staart intraveneuze injectie in immunodeficiënte naakt muizen. Na 6 weken MKN-45 gemengd met CAF genereerde meer long metastasen dan MKN-45 gemengd met TAGLN siRNA CAF, CPF en NFS Soortgelijke MKN-45 gemengd met niet-stilte siRNA cafe's (Tabel 1). Deze gegevens suggereerden dat CAF tonen een verhoogd vermogen om tumormetastase (Figuur 3A en B) stimuleren. Alle waarnemingen gaven aan dat in de aanwezigheid van CAF, werden tumoren agressiever, wat suggereert dat CAF rol zou kunnen spelen bij het bevorderen van metastase bij maagkanker. Figuur 3 TAGLN verbetert tumormetastase door menselijke tumor xenograft model in vivo. A: naakt muizen metastatische knobbeltjes in de longen. a1: longen uitgezaaide knobbeltjes van Tomur-dragende muis. Arrow: uitgezaaide knobbeltje. A2: Nee uitgezaaide knobbeltje in de long. a3: H &E kleuring voor longen uitgezaaide nodule onder helderveld microscoop. Schaalbalken, 200 urn. a4: H &E kleuring long- zonder metastatische knobbel onder helderveld microscoop. Schaalbalken, 200 urn. B: kwantificering van naakt muizen longen uitgezaaide knobbeltjes in diverse groepen door middel van de staart intraveneuze injectie. *, P Restaurant < 0,05, door one-way variantie-analyse (ANOVA).
Tabel 1 Naakt muizen longen uitgezaaide knobbeltjes in diverse groepen door middel van de staart intraveneuze injectie (Elke groep bevatte 6 muizen)
groepen
TAGLN siRNA CAF -MKN45
non-stilte siRNA CAF-MKN45
CAF-MKN45
CPF-MKN45
NF-MKN45
MKN45 alone
Aantal tumor-dragende muizen 2
5
5
3 Pagina 2 2
Aantal metastatische knobbeltjes 2
10
9
5
3 2
TAGLN bevordert tumormetastase opwaarts reguleren door MMP-2
veel studies gericht op de rol van matrix metalloproteinases (MMPs) om de invasie van omliggende bindweefsel en metastase van tumorcellen van primaire laesie afstand gelegen plaatsen in tumorprogressie [20, 21]. In ons eerdere werk onderzochten we MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 en MMP-9 niveaus na TAGLN neerhalen van siRNA door middel van ELISA, alleen MMP-2 niveau significant neerwaarts gereguleerd, andere MMPs niveaus toonde geen verandering. Dus we focued op MMP-2 in dit onderzoek. Zoals figuur 4A toonde, in vergelijking met MKN-45 co-coultured met CAF /neg en CAF /mock, MMP-2 niveaus in supernatant van MKN-45 co-gekweekt met CAF /siTAGLN waren significant onderdrukt. We vervolgens onderzocht de activiteit van MMP-2 middels gelatine zymografie assay. We vonden MMP-2 activiteit werd sterk geremd in supernatant van MKN-45 co-gekweekt met CAF /siTAGLN dan bij CAF /neg en CAF /mock (Figuur 4B). Aldus kan TAGLN tumormetastase versterken door MMP-2 enzymen breken de basale membranen (bijv. Collageen IV). Figuur 4 TAGLN verbetert tumormetastase opgereguleerd door MMP-2. A: MMP-2 expressie in CAF Verminderde uiteraard na TAGLN RNAi door ELISA. *, P Restaurant < 0.05 door one-way variantie-analyse (ANOVA). Foutbalken geven de standaardfout rond het gemiddelde. B:. Knockdown TAGLN verminderde het vermogen van de CAF om geheime MMP-2 door gelatine zymografie
TAGLN expressie in menselijke maagkanker en de associatie met differentiatie bij maagkanker patiënten
Om de TAGLN expressie bij maagkanker te evalueren, TAGLN immunokleuring in 98 primaire maagkanker weefsels werden onderzocht. TAGLN expressie is opgereguleerd in menselijke maagkanker stroma vergeleken met normaal maagweefsel (Figuur 5A: normaal maagweefsel Figuur 5B: maagkanker weefsel). De correlatie van TAGLN expressie met de klinische en pathologische kenmerken werd getoond in Tabel 2. TAGLN hoger waren in niet-gedifferentieerde tumoren (slecht gedifferentieerd adenocarcinoom, zegelring cel carcinomen en carcinomen mucineuze) dan die die gedifferentieerde (goed en matig adnocarcinomas) (P
= 0,003). Bovendien werd TAGLN niveaus gecorreleerd met lymfeklier metastasen (P
= 0,029). Er waren geen significante verschillen in de tumor TAGLN expressie volgens de andere clinicopathologische functies, zoals geslacht, leeftijd, grootte van de tumor, Lauren indeling, T-stadium, afstand metastase en TNM stadium (P
≥ 0,05). Figuur 5 Expressie van TAGLN in menselijke maagkanker weefsels. A: TAGLN expressie in normale maag weefsel door IHC. Schaalbalken, 100 urn. B: TAGLN is overexpressie in de stroma van menselijke maagkanker IHC. Schaalbalken, 100 urn. C: TAGLN mRNA wordt opgereguleerd in menselijke maagkanker door QRT-PCR geanalyseerd. D: TAGLN eiwit wordt opgereguleerd in menselijke maagkanker door Western blot geanalyseerd. De waarden geven het gemiddelde ± SD van ten minste drie afzonderlijke experimenten, elk in drievoud uitgevoerd. *, P Restaurant < 0.001 door paried-samples T Electronics Test.
Tabel 2 klinisch-pathologische verenigingen van TAGLN expressie bij maagkanker
Aantal gevallen
TAGLN immunokleuring
P

Zwak (+)
Strong (++)
Gender
0,778
Man
60
27
33
Female
38
16
22
Age
0,739
≤60y
46
21
25 | > 60y
52
22
30
tumorgrootte
0,852
≤5 cm
58
25 | 33 Restaurant > 5 cm
40
18
22
Differentiatie
0.003
Nou + Matige
46
13
33
Poor
52
30
22
Lauren indeling
0,059
Intestinal
40
13
27
Zend
58
30
28
T-stadium
0,142
T1 + T2
56
21
35
T3 + T4
42
22
20
lymfekliermetastasen
0.029
N0
27
11
16
N1
32
15
17
N2
26
7
19
N3
13
10
3
Distant metastase
0,709
Zonder
95
42
53 met
3
1 2
TNM stadium
0,722
I
20
7
13
II
25 | 11
14
III
30
10 | 20
IV
23
15
8
ook gebruikten we QRT-PCR en Western blot om de expressie van TAGLN bij maagkanker weefsels (figuur 5C en D) te evalueren. Deze resultaten suggereren dat de TAGLN expressie bij maagkanker weefsels veel hoger was bij maagkanker dan die in gepaarde normale weefsels.
Discussie
Accumulerende bewijs toont aan dat kanker initiatie en progressie te betrekken interacties tussen beide tumor en stromale cellen. Tumorcellen kunnen werven actief stromale cellen, zoals vasculaire cellen, gladde spiercellen en fibroblasten, in de tumor, waardoor het genereren van micro tumorgroei [16, 22, 23] te bevorderen. Fibroblasten vormen vaak het grootste deel van de stromale cellen in een maagcarcinoom, maar de functionele bijdrage van deze cellen tot tumorvorming en tumormetastase blijven slecht begrepen.
TAGLN is een van de eerste markers van gladde spier differentiatie tijdens embryogenese [24], en eerdere studies in verband met TAGLN vooral gericht op gladde spiercellen [25]. Pathologische aandoeningen gepaard met tissue remodeling en fibrogenese, zoals wondgenezing en neoplastische lesies, worden gekenmerkt door het optreden van stromale cellen met ultrastructurele eigenschappen tussen die van normale fibroblasten en die van gladde spiercellen. Deze fibroblasten vertonen fenotypische en functionele kenmerken van gladde spiercellen en daarmee myofibroblasten genoemd [26], zoals cafe's. In onze studie werd TAGLN overexpressie ook waargenomen in cafe's. Het is gemeld dat de TAGLN eiwit tot overexpressie wordt gebracht bij maagkanker bij eiwitexpressie spectrum van maagkanker werd geanalyseerd met behulp van twee-dimensionale gelelektroforese (2-DE) [27]. Bovendien is de TAGLN eiwit is een van de twee met tumor geassocieerde antigenen die in serum nier- carcinoom patiënten geïdentificeerd met behulp Klade 2-DE [28]. Deze verslagen zijn consistent met de resultaten die we hebben waargenomen middels real-time PCR en Western Blot. Interessant, vonden we dat TAGLN hoofdzakelijk gedetecteerd in fibroblasten afgeleid van tumor-stroma, en niet in tumorcellen. Evenzo kunnen andere onderzoekers ontdekt dat de TAGLN niet wordt uitgedrukt in de kwaadaardige cellen maar in mesenchymale cellen van de tumor stroma [27].
Stromale fibroblasten reguleren endotheliale of epitheliale cellen gedrag direct en via cel-interacties CEL1. Activering van gastheer micro stroma1 wordt gedacht een cruciale stap in tumorgroei en progressie [13, 29] zijn. Proteïnen uitgescheiden door stromale cellen in de tumoren kunnen positief of negatief effect op tumorprogressie. De meest prominente acties van TAGLN kan tumorcel de beweeglijkheid en invasie [7, 30, 31] te bevorderen. We vonden dat de TAGLN aanzienlijk lymfeklier groep was verhoogd dan lymfeklieren negatieve groep. Om de rol van TAGLN in stromale fibroblasten tijdens maagkanker ontstaan ​​van tumoren en metastase c1arify, tot zwijgen we de TAGLN expressie in menselijke cafe's. Er werd aangegeven dat alleen de MKN-45 co-gekweekt met cafe's die hoge niveau TAGLN vertoonde veel hoger invasie en migratie vermogen. Fibroblasten die TAGLN was omvergeworpen heeft deze functie niet weergegeven. Bij elkaar genomen, stellen we voor dat TAGLN verantwoordelijk zijn voor de verhoging van maagkanker cel uitzaaiing via stromale cellen zou kunnen zijn, zoals cafe's.
TAGLN expressie wordt aanzienlijk in de maag cafe's toegenomen. CAF TAGLN met verhoogde expressieniveaus kunnen tumorcel invasie en migratie mogelijkheid dat een verhoogde expressie van MMP-2 te bevorderen te versterken. Het stimuleren van MMP expressie in fibroblasten hetzij na direct contact met tumorcellen of na contact met tumorcel afgeleide oplosbare factoren van tumoren afkomstig van epitheelcellen is aangetoond in verscheidene studies [32-35]. Verduidelijking van de onderliggende mechanismen kunnen dus verzwakken de tumor herhaling en metastase bij maagkanker patiënten.
Conclusies
Kortom, onze studie toont aan dat cafe's maagkanker cel migratie en invasie kunnen bevorderen via verhoogde MMP-2-productie veroorzaakt door TAGLN opregulatie .
methoden
weefselmonsters
Een totaal van 40 paren van kanker weefsels en overeenkomstige normale slijmvlies voor QRT-PCR en Western blot en 98 primaire maagkanker voor immunokleuring werden verzameld uit operatief verwijderd maagkanker geconstateerd bij de afdeling Heelkunde, Ruijin ziekenhuis, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Normale mucosa monsters werden genomen uit de marge van de resectie wanneer de tumoren zich althans over 6 cm gescheiden daarvan. Deze studie protocol werd goedgekeurd door de onafhankelijke ethische commissie van Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. De geïnformeerde toestemming werd geschreven. Alle monsters werden overnacht snap ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C voor gebruik. 4% formaldehyde gefixeerd weefselsecties zowel tumor en mucosa werden gekleurd met H &E en onderzocht en histopathologisch gecontroleerd door twee pathologen. Elk monster werd toegeschreven een diagnose en scoorde voor Lauren indeling, differentiatie, pTNM podium. Tumorgrootte, de locatie en andere klinische pathologische kenmerken werden verkregen uit klinische gegevens met toestemming van de patiënt
Cellijnen
Maagkanker cellijnen SNU-1 (ATCC: CRL-5971)., AGS (ATCC: CRL-1739), NCI-N87 (ATCC: CRL-5822) en KATOIII (ATCC: HTB-103) werden verkregen van de American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Andere 3 maagkanker cellijnen MKN-45, MKN-28 en SGC-7901, werden bewaard in ons instituut. Alle cellijnen werden in RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) gehouden.
Antilichamen
gebruikte primaire antilichamen voor kleuring inbegrepen humaan specifieke anti-vimentine (Abcam, Cambridge, UK), anti-fibronectine ( Abcam, Cambridge, UK), anti-α-gladde spier actine (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA), anti-pan-cytokeratine (Abcam, Cambridge, UK), anti-SM22 (Abcam, Cambridge, UK) en muis anti-GAPDH (Kang Chen, China).
Isolatie van menselijke maag fibroblasten
fibroblasten van kanker- en niet-kanker-geassocieerde gebieden van de maag weefsel ontleed van patiënten met maagkanker werden geïsoleerd tijdens radicale maagresectie uit de afdeling Heelkunde, Ruijin ziekenhuis, Shanghai Jiao Tong University School of Medcine. De kanker-geassocieerde gebieden werden geselecteerd op minimaal necrotische gebieden van de tumor massa. Non-kanker geassocieerde stroma, die uit weefsel minimaal 2 cm distaal deed zich de buitenrand van de kankermassa. Normale mucosa monsters werden genomen uit de marge van de resectie wanneer de tumoren zich althans over 6 cm gescheiden daarvan. Weefsels werden gehakt in organoids van ongeveer 1 mm 3 en gezaaid op ongecoate kunststofmateriaal in RPMI 1640 medium dat menselijke basische fibroblastgroeifactor, 20% foetaal kalfserum (FCS) en penicilline en streptomycine antibiotica. Deze omstandigheden produceerde een homogene fibroblast cel populatie na 7 dagen van de cultuur. Elke fibroblast werd daarna geëxpandeerd bij een 1: 3 verhouding van trypsine-EDTA in 10 cm petrischalen. We gebruikten fibroblasten gepasseerd tot 8 populatieverdubbelingen (PD) voor verdere experimenten om klonale selectie en cultuur stress die kunnen optreden tijdens langdurige weefselkweek minimaliseren.
Immunohistochemische kleuring (IHC)
cellen of weefsels vastgesteld gedurende 30 min met 4% formaline en gespoeld met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Na de endogene peroxidase-activiteit werd gedoofd met 0,3% H 2O 2 werden cellen geblokkeerd met normale niet-immuun serum gedurende 30 minuten alvorens te worden geïncubeerd met primair antilichaam bij 37 ° C gedurende 2 uur. Cellen of weefsels werden vervolgens gemerkt met streptavidine-biotine-mierikswortelperoxidase kleuringskit (Dako, Carpinteria, CA, USA). De aanwezigheid van peroxidase gelabeld op de gedeelten werd gevisualiseerd door incubatie met 3,3 '- diaminobenzidine, DAB + substraat chromogeen en de secties werden tegengekleurd met hematoxyline. Negatieve controle glasplaatjes werden uitgevoerd door het weglaten van het primaire antilichaam.
TAGLN expressie werd beoordeeld door de intensiteit van de gekleurde cellen, en bepaald twee categorieën (zwak positief en sterk positief). De kleuringsintensiteit werd ingedeeld in vier klassen (intensiteit scores): geen kleuring (graad 0), lichtbruine kleuring (graad 1), bruine kleuring (graad 2), en donkerbruine kleuring (graad 3). Rang en rang 0 1 werd gedefinieerd als zwak positief, graad 2 en graad 3 werden gedefinieerd als sterk positief.
Kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR)
Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. cDNA werd verkregen met 1 ug RNA via reverse transcriptie System Kit (Promega, Madison, WI, USA) en QRT-PCR werd uitgevoerd door de SYBR Green PCR kern Reagent kit (Applied Biosystems, Warrington, UK). Primers specifiek voor TAGLN waren als volgt: 5 - GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 '(bovenste), 5 ' - GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 '(lager). Glyceral-hyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) als de endogene referentie. De sequenties waren 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (boven), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ' (lager). QRT-PCR voor het kwantificeren van de niveaus van mRNA TAGLN werd uitgevoerd op een ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De gegevens werden geanalyseerd met behulp van de vergelijkende werkwijze Ct. Specificiteit van resulterende PCR producten werd bevestigd met behulp van smeltcurven.
Western blot
Cellen werden geoogst en gelyseerd met zoogdier eiwit extractie reagens (Pierce, Rockford, IL, USA). Eiwit concentraties werden bepaald met bicinchoninezuur (BCA) eiwit assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Monsters met 50 ug totaal eiwit werden geladen op elke baan van 12% acrylamide gel in een minigel inrichting (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). De gescheiden eiwitten werden overgebracht naar een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Na geïncubeerd met primair antilichaam (1: 1000) en HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (1: 5000). Respectievelijk, werden immuuncomplexen gedetecteerd door de verbeterde chemiluminescentie (ECL) systeem (Millipore, Bedford, MA, USA)
Enzyme -gebonden immunosorbent assay (ELISA) Ondernemingen de proteïne niveaus van MMP-2 in supernatanten werden gemeten met een ELISA kit (R &D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) volgens de instructies van de fabrikant
Celgroei. assay
verschillende groepen cellen (1 x 10 3) werden uitgezaaid in 96-putjes in drievoud. Het aantal levensvatbare cellen werd dagelijks bepaald met de Cell Counting Kit (CCK-8) door middel van een uiterst wateroplosbaar tetrazoliumzout WST-8 [2- (2-methoxy-4- nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2,4-disulfofenyl) -2H-tetrazolium, mononatriumzout] (DOJINDO, Japan). In het kort, 20 ul van CCK-8-oplossing werd toegevoegd aan platen, absorptie bij 450 nm werd gemeten na 4 uur incubatie.
Beoordeling van de tumor invasie en migratie
Tumor invasie en migratie test werden uitgevoerd met QCMTM24-well invasie kit (Millipore, Bedford, MA, USA) en QCMTM24 putjes migratie kit (Millipore, Bedford, MA, USA) volgens het protocol van de fabrikant, respectievelijk. Add bereid MKN-45 celsuspensie (2 x 10 5 cellen /putje) aan de bovenste kamer en voeg vooraf gesuspendeerd fibroblasten (5 x 10 4 cellen /putje in RPMI 1640 medium dat 20% FBS) met de Tweede kamer. De TAGLN van enkele fibroblasten in de onderste kamers werd geremd met behulp van siRNA 24 uur later. MKN-45 en fibroblasten waren co-gekweekt non-contactedly voor 48 uur, dan lysised de cellen en bepaalden RFU waarden met een fluorescentie plaatlezer met behulp van 480/520 nm filter set.
TAGLN siRNA
Qiagen software werd gebruikt om RNAi sequenties targeting menselijk TAGLN ontwerpen (toetreding geen NM_003186.), en de siRNA-sequentie met de hoogste vermeende werkzaamheid (betekenis: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ', antisense: 5 '- UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ') werd gesynthetiseerd door Shanghai GeneChem Co, Ltd. siRNA met gerandomiseerde sequentie (betekenis: 5 ' - UUCUCCGAACGUGUCACG Utt-3 ', antisense: 5 ' - ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 ') ten opzichte van niet-gen (scrambled siRNA-groep) werd getransfecteerd als interne controle. Voor experimenten werden cellen getransfecteerd met DOTAP liposomaal transfectiereagens (Roche, Duitsland). Cellen werden geënt bij 2 x 10 5 cellen /putje in 6-well platen. Na 24 uur bij cellen in de log fase van groei, 250 ul Opti-MEM I werd gemengd met 5 ul van 20 uM siRNA-duplex, terwijl een ander 250 pi Opti-MEM I afzonderlijk geïncubeerd met 11,88 gl DOTAP liposoom. De twee mengsels werden voorzichtig gemengd en gedurende ongeveer 30 minuten bij kamertemperatuur. Voor transfectie werd het gehele mengsel toegevoegd aan elk putje in 1,5 ml vers medium zonder antibiotica. De uiteindelijke concentratie van siRNA getransfecteerde was 20 nM. Cellen werden verzameld voor verdere analyse bij 24, 48 en 72 uur na transfectie.
Gelatine zymografie
kweeksupernatanten van 24 uur geoogst en gemengd met een gel monsterbuffer (0,5 M Tris-HCl, glycerol, 10% natriumdodecylsulfaat [SDS], β-mercaptoethanol en 0,5% broomfenolblauw). Tien microgram eiwit werd door SDS-PAGE scheiding; de SDS-PAGE-gelen bevatten 0,1% gelatine (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Na elektroforese werden de gelen gewassen in 50 mM Tris buffer die 2,5% Triton X-100. De gels werden gedurende nog eens 24 uur incubatie in medium (50 mM Tris-buffer [pH 7,6], 10 mM CaCl 2, en 200 mM NaCl). De gels werden gekleurd met 0,5% Coomassie blauw, wit banden (72 kDa) op een blauwe achtergrond aangegeven zones digestie overeenkomt met de aanwezigheid van MMP-2.
Muismodel
Vrouwelijke BALB /c-nu /nu
naakt muizen, dezelfde leeftijd tussen 4-5 weken (Institute of Zoology Chinese Academie van Wetenschappen), werden ondergebracht op een specifieke pathogeen-vrije omgeving in de Animal Laboratory Unit, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, China. Fibroblasten en MKN-45 werden gemengd in een verhouding van 1: 4 in 0,1 ml PBS en geïnjecteerd in de laterale staartader. Zes muizen werden in elke groep in alle experimenten en elk experiment werd tweemaal uitgevoerd. Dieren werden opgeofferd en long metastasen werden geregistreerd 6 weken na tumorcel implantatie. Tumormonsters werden verzameld, gemengd in formaline, ingebed in paraffine, en onderworpen aan H &E kleuring. P Restaurant < Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Co-optreden van meerdere herseninfarcten ten gevolge van hypercoagulability geassocieerd met kanker en meningeale carcinomatosa als de eerste manifestatie van maagkanker
• Heeft maag-tonometrie begeleide therapie verminderen de totale sterfte bij ernstig zieke patiënten?