Maintenant, chercheurs du Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering de l'Université Harvard, le Massachusetts Institute of Technology (MIT), et plusieurs hôpitaux de la région de Boston ont créé un Test de diagnostic basé sur CRISPR qui permet aux utilisateurs de se tester eux-mêmes pour le SRAS-CoV-2 et plusieurs variantes du virus en utilisant un échantillon de leur salive à la maison, sans instrumentation supplémentaire nécessaire.
L'appareil de diagnostic, appelé SHERLOCK à instrumentation minimale (miSHERLOCK), est facile à utiliser et fournit des résultats qui peuvent être lus et vérifiés par une application pour smartphone en moins d'une heure. Il a réussi à distinguer trois variantes différentes du SARS-CoV-2 dans les expériences, et peut être rapidement reconfiguré pour détecter des variantes supplémentaires comme Delta. L'appareil peut être assemblé à l'aide d'une imprimante 3D et de composants couramment disponibles pour environ 15 $, et la réutilisation du matériel ramène le coût des tests individuels à 6 $ chacun.
miSHERLOCK élimine le besoin de transporter les échantillons de patients vers un site de test centralisé et simplifie grandement les étapes de préparation des échantillons, donner aux patients et aux médecins un plus rapide, image plus précise de la santé individuelle et communautaire, ce qui est essentiel pendant une pandémie en évolution. »
Hélène de Puig, Doctorat., Co-premier auteur, Stagiaire postdoctoral, Institut Wyss et MIT
Le dispositif de diagnostic est décrit dans un article publié aujourd'hui dans Avancées scientifiques .
En tant qu'instructeur en pédiatrie au Boston Children's Hospital avec une spécialisation en maladies infectieuses, co-premier auteur Rose Lee, M.D. travaille en première ligne de la pandémie de COVID-19 depuis plus d'un an. Ses expériences en clinique ont inspiré le projet qui allait devenir miSHERLOCK.
"Des choses simples qui étaient omniprésentes à l'hôpital, comme les écouvillonnages nasopharyngés, étaient soudainement difficiles à obtenir, de sorte que les procédures de traitement de routine des échantillons ont été perturbées, ce qui est un gros problème dans un contexte de pandémie, " dit Lee, qui est également chercheur invité au Wyss Institute. "La motivation de notre équipe pour ce projet était d'éliminer ces goulots d'étranglement et de fournir des diagnostics précis pour COVID-19 avec moins de dépendance aux chaînes d'approvisionnement mondiales, et pouvait également détecter avec précision les variantes qui commençaient à émerger. »
Pour la partie détection du SRAS-CoV-2 de leur diagnostic, le groupe s'est tourné vers une technologie basée sur CRISPR créée dans le laboratoire du membre de la faculté Wyss Core et auteur principal de l'article, Jim Collins, doctorat appelé "déverrouillage enzymatique spécifique à haute sensibilité" (SHERLOCK). SHERLOCK utilise les "ciseaux moléculaires" de CRISPR pour couper l'ADN ou l'ARN à des emplacements spécifiques, avec un bonus supplémentaire :ce type spécifique de ciseaux coupe également d'autres morceaux d'ADN dans la zone environnante, lui permettant d'être conçu avec des molécules sondes d'acide nucléique pour produire un signal indiquant que la cible a été coupée avec succès.
Les chercheurs ont créé une réaction SHERLOCK conçue pour couper l'ARN du SRAS-CoV-2 dans une région spécifique d'un gène appelé nucléoprotéine qui est conservé dans plusieurs variantes du virus. Lorsque les ciseaux moléculaires - une enzyme appelée Cas12a - se lient avec succès au gène de la nucléoprotéine et le coupent, des sondes d'ADN simple brin sont également coupées, produisant un signal fluorescent. Ils ont également créé des tests SHERLOCK supplémentaires conçus pour cibler un panel de mutations virales dans les séquences de protéines Spike qui représentent trois variantes génétiques du SRAS-CoV-2 :Alpha, Bêta, et Gamma.
Armé de tests capables de détecter de manière fiable l'ARN viral dans la plage de concentration acceptée pour les tests de diagnostic autorisés par la FDA, l'équipe a ensuite concentré ses efforts sur la résolution de ce qui est sans doute le défi le plus difficile en diagnostic :la préparation des échantillons.
"Lorsque vous testez un échantillon pour les acides nucléiques [comme l'ADN ou l'ARN], il y a beaucoup d'étapes que vous devez faire pour préparer l'échantillon afin que vous puissiez réellement extraire et amplifier ces acides nucléiques. Vous devez protéger l'échantillon pendant qu'il est en transit vers l'installation d'essai, et assurez-vous également qu'il n'est pas infectieux si vous avez affaire à une maladie transmissible. Afin d'en faire un test de diagnostic vraiment facile à utiliser, il était important pour nous de simplifier cela au maximum, " a déclaré le co-premier auteur Xiao Tan, MARYLAND., Doctorat., un chercheur clinique au Wyss Institute et un instructeur de médecine en gastroentérologie au Massachusetts General Hospital.
L'équipe a choisi d'utiliser des échantillons de salive plutôt que des écouvillons nasopharyngés comme méthode de prélèvement, car il est plus facile pour les utilisateurs de prélever de la salive et des études ont montré que le SRAS-CoV-2 est détectable dans la salive pendant un plus grand nombre de jours après l'infection. Mais la salive non transformée présente ses propres défis :elle contient des enzymes qui dégradent diverses molécules, produisant un taux élevé de faux positifs.
Les chercheurs ont développé une nouvelle technique pour résoudre ce problème. D'abord, ils ont ajouté deux produits chimiques appelés DTT et EGTA à la salive et ont chauffé l'échantillon à 95°C pendant 3 minutes, qui a éliminé le faux signal positif de la salive non traitée et a tranché toutes les particules virales. Ils ont ensuite incorporé une membrane poreuse conçue pour piéger l'ARN à sa surface, qui pourrait finalement être ajouté directement à la réaction SHERLOCK pour générer un résultat.
Pour intégrer la préparation de l'échantillon de salive et la réaction de SHERLOCK dans un seul diagnostic, l'équipe a conçu un appareil simple alimenté par batterie avec deux chambres :une chambre de préparation d'échantillons chauffée, et une chambre de réaction non chauffée. Un utilisateur crache dans la chambre de préparation des échantillons, allume le chauffage, et attend trois à six minutes que la salive soit absorbée par le filtre. L'utilisateur retire le filtre et le transfère dans la colonne de la chambre de réaction, pousse ensuite un piston qui dépose le filtre dans la chambre et perce un réservoir d'eau pour activer la réaction SHERLOCK. 55 minutes plus tard, l'utilisateur regarde à travers la fenêtre teintée du transilluminateur dans la chambre de réaction et confirme la présence d'un signal fluorescent. Ils peuvent également utiliser une application pour smartphone qui analyse les pixels enregistrés par l'appareil photo du smartphone pour fournir un diagnostic positif ou négatif clair.
Les chercheurs ont testé leur appareil de diagnostic en utilisant des échantillons de salive cliniques de 27 patients COVID-19 et 21 patients en bonne santé, et a constaté que miSHERLOCK identifiait correctement les patients positifs au COVID-19 96% du temps et les patients sans la maladie 95% du temps. Ils ont également testé ses performances par rapport à l'Alpha, Bêta, et les variantes Gamma SARS-CoV-2 en ajoutant de la salive humaine saine avec de l'ARN viral synthétique complet contenant des mutations représentant chaque variante, et a constaté que le dispositif était efficace dans une gamme de concentrations d'ARN viral.
"L'un des grands avantages de miSHERLOCK est qu'il est entièrement modulaire. L'appareil lui-même est séparé des dosages, afin que vous puissiez brancher différents tests pour la séquence spécifique d'ARN ou d'ADN que vous essayez de détecter, " a déclaré la co-première auteure Devora Najjar, un assistant de recherche au MIT Media Lab et au Collins Lab. "L'appareil coûte environ 15 $, mais la production de masse ramènerait le logement à environ 3 $. Les dosages pour de nouvelles cibles peuvent être créés en environ deux semaines, permettant le développement rapide de tests pour de nouvelles variantes de COVID-19 et d'autres maladies."
L'équipe miSHERLOCK a créé son appareil avec des paramètres à faibles ressources à l'esprit, car la pandémie a mis en lumière les vastes inégalités d'accès aux soins de santé qui existent entre les différentes parties du monde. Le matériel de l'appareil peut être construit par toute personne ayant accès à une imprimante 3D, et les fichiers et les conceptions de circuits sont tous accessibles au public en ligne. L'ajout d'une application pour smartphone visait également les paramètres à ressources limitées, comme le service de téléphonie mobile est disponible pratiquement partout dans le monde, même dans les zones difficiles d'accès à pied. L'équipe est impatiente de travailler avec des fabricants intéressés par la production de miSHERLOCK à grande échelle pour une distribution mondiale.
"Quand le projet miSHERLOCK a démarré, il n'y avait presque aucune surveillance des variantes du SRAS-CoV-2. Nous savions que le suivi des variantes allait être extrêmement important lors de l'évaluation des effets à long terme de COVID-19 sur les communautés locales et mondiales, nous nous sommes donc poussés à créer un système vraiment décentralisé, souple, plate-forme de diagnostic conviviale, " dit Collins, qui est également le professeur Termeer d'ingénierie médicale et de sciences au MIT. "En résolvant le problème de préparation de l'échantillon, nous nous sommes assurés que cet appareil est pratiquement prêt à être utilisé par les consommateurs tel quel, et nous sommes ravis de travailler avec des partenaires industriels pour le rendre disponible dans le commerce."
« En associant biotechnologie de pointe et matériaux à faible coût, cette équipe a créé un appareil de diagnostic puissant qui peut être fabriqué et utilisé au niveau local par des personnes sans diplômes médicaux avancés. C'est un parfait exemple de la mission du Wyss Institute en action :mettre des innovations qui changent la vie entre les mains des personnes qui en ont besoin, " a déclaré le directeur fondateur de Wyss, Don Ingber, MARYLAND., Doctorat., qui est aussi le Judah Folkman Professeur de biologie vasculaire à la Harvard Medical School et au Boston Children's Hospital, et professeur de bio-ingénierie à la Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.
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