Une augmentation de la kinase liée aux intégrines confère non canoniquement avantages de la croissance de NF-kB à médiation par les cellules cancéreuses gastriques par activation de ERK1 /2

Une augmentation de la kinase liée aux intégrines non canoniquement confère des avantages de croissance NF-kB à médiation aux cellules de cancer gastrique en activant ERK1 /2
Résumé de l'arrière-plan
activité ou l'expression de la kinase liée aux intégrines (ILK) Augmentation , qui régule l'adhésion cellulaire, la migration et la prolifération, conduit à l'oncogenèse. Nous avons identifié les bases moléculaires de la régulation de l'ILK et son rôle alternatif en conférant ERK1 /2 /NF-kB médiée avantages de la croissance des cellules de cancer gastrique.
ILK Inhibiteurs de résultats avec de l'ARN en épingle à cheveux ou T315, un putative inhibiteur de l'ILK, abolit le NF-kB à médiation par la croissance des cellules humaines du cancer gastrique AGS, SNU-1, MKN45 et GES-1. ILK a stimulé l'activité de Ras pour activer la c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /ribosomique S6 kinase /inhibiteur de la signalisation κBα /NF-kB, en facilitant la formation de l'IQ contenant un motif-GTPase-activating protein 1 (IQGAP1) - complexe Ras. l'expression de l'ILK enzymatique forcée favorisé la croissance cellulaire en facilitant ERK1 signalisation /2 /NF-kB. l'activation de PI3K ou diminution de l'expression de PTEN prolongée ERK1 2 activation /en protégeant ILK de la dégradation par le protéasome. C-terminale de choc thermique 70 apparenté protéine interagissant, un E3 ubiquitine ligase HSP90-associé, médiée ubiquitination ILK pour contrôler PI3K- et la stabilisation des ILK HSP90 réglementés et la signalisation. En plus de la croissance cellulaire, la voie identifiée favorisé la migration cellulaire et réduit la sensibilité des cellules de cancer gastrique à des agents anticancéreux 5-fluorouracile et cisplatine. En outre, l'administration exogène de l'EGF ainsi que la surexpression de l'EGFR et de déclencher ILK- IQGAP1 régulée ERK1 /2 /NF-kB activation, la croissance cellulaire et la migration.

Conclusion L'augmentation de l'ILK non canoniquement favorise ERK1 /2 /activation de NF-kB et conduit à la croissance des cellules de cancer gastrique.
Mots-clés
croissance cellulaire ILK IQGAP1 ERK1 /2 NK-kB Contexte
kinase liée aux intégrines (ILK), un 59-kDa sérine /thréonine kinase, interagit directement avec le domaine cytoplasmique de l'intégrine β1 [1]. ILK comprend trois domaines: N-terminal ankyrine (ANK) répétitions, une homologie de pleckstrine central (PH) -comme domaine, et un domaine kinase C-terminal [2], [3]. facteurs matrice cellulaire extracellulaire intégrine-médiation (ECM) adhérence ou de croissance activent phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) à phosphoryler liée à la membrane PI 4,5-bisphosphate (PIP2) et générer PI 3,4,5-triphosphate (PIP3), qui se lie au domaine de PH analogue de l'ILK et active ILK [4], [5]. Après l'activation de l'ILK, le domaine de kinase C-terminale de l'ILK peut se lier à diverses protéines, y compris l'AKT, affixin, β-parvin, glycogène synthase kinase (GSK) -3β, calponin protéine ILK de liaison contenant de l'homologie, la 20 kDa réglementaire chaînes légères de myosine (de LC20), la sous-unité de la myosine-ciblage de la chaîne légère de la myosine phosphatase (MYPT1), paxillin, α-NAC, et les inhibiteurs de la protéine phosphatase PHI-1, képi et CPI-17 [2], [3] [6], [7]. Les répétitions de ANK N-terminaux médiatisent l'interaction de ILK avec ILKAP, un membre de la famille 2C protéine phosphatase et PINCH, un domaine seule protéine adaptatrice LIM. ILK peut être considérée comme une protéine interagissant PIP3 en aval de PI3K; ses effets sont bloqués par la phosphatase et de la tensine homologue supprimé sur le chromosome 10 (PTEN) [8], [9]. PTEN supprime les tumeurs par déphosphorylation PIP3 [10], [11] de l'ILK joue un rôle essentiel dans la régulation de divers processus cellulaires, y compris la prolifération, la survie, la migration, la progression du cycle cellulaire et l'angiogenèse. augmentation de l'activité ou l'expression de l'ILK conduit à une oncogenèse [2], [3]. Outre la modulation de ses protéines partenaires pour les processus cellulaires, ILK est supposé être impliqué dans un réseau de transduction du signal intracellulaire. Mécaniquement, ILK phosphoryle directement AKT sur Ser473 et GSK-3β sur Ser9 [4], [9] pour la médiation β-caténine translocation et réguler AP-1 expression de cellules tumorales prolifération [12]. l'activation du NF-kB est essentiel pour les processus oncogéniques ILK médiation, comme l'activité anti-apoptotique [13], la promotion de la survie [14], l'épithélium-mésenchyme transition [15], l'extension cellulaire et de la résistance à l'apoptose [16], de l'angiogenèse [17 ], et la migration, l'invasion et les métastases [18] - [20]. En outre, l'activation de NF-kB est nécessaire pour la régulation canonique de l'IKKa et IKKß par la voie de l'ILK /AKT. Pour déclencher la migration cellulaire, ILK peut activer le petit RAC de GTPases et CDC42 [21]. En outre, l'ILK régule l'activation de ERK1 2 /dans la différenciation myogénique [22]. Augmentation de l'expression de microARN-143 et microARN-145, qui cible ILK, inhibe AKT et ERK1 /2 voies [23]. Cependant, le mécanisme moléculaire sous-jacent ERK1 /2 d'activation de l'ILK à médiation reste inconnue.
La stimulation des cellules par des facteurs de croissance et de cytokines ainsi que des interactions cellulaires avec une activité ECM augmentation de l'ILK [24]. En plus de la régulation moléculaire de la PI3K /PTEN par ILK, Aoyagi et al. ILK identifiée comme étant une nouvelle protéine de choc thermique (HSP) 90 protéine cliente et a trouvé que l'inhibition pharmacologique de HSP90 a donné lieu à la dégradation de l'ILK d'une manière dépendante du protéasome [25]. En outre, la HSP90 associée E3 ubiquitine ligase C-terminale de choc thermique 70 apparenté interacting protein (CHIP) provoque la dégradation des ILK [26]. Hashiramoto et al. a démontré que HSP90 stabilisé ILK et AKT et ERK1 2 activation /[16] soutenue. Ainsi, nous supposons une relation entre la stabilité de l'ILK et l'activation des kinases en aval. Ras /MAPK de voie de signalisation est essentielle pour la tumorigenèse [27]. augmentation de l'expression de l'ILK est liée au cancer de haut grade gastrique [28], le cancer de la prostate [29] et cancer non à petites cellules du poumon [30], bien que les cellules de ces cancers abritent généralement des mutations Ras [31] - [33]. Ciblage ILK avec le siRNA diminue l'invasion du cancer gastrique cellulaire, la prolifération et la croissance par un mécanisme inconnu [34]. En ce qui concerne la possibilité que l'ILK agit en amont de NF-kB par le contrôle de l'IKKa [13], qui a été impliquée dans la tumorigenèse gastrique [35], l'ILK est spéculé pour activer la croissance cellulaire par l'intermédiaire d'une voie NF-kB régulée. En utilisant des cellules de cancer gastrique (AGS, MKN45 et SNU-1), nous avons étudié la régulation moléculaire de l'ILK et identifié une voie non canonique de ERK1 /2 d'activation de l'ILK régulé pour la croissance de cellules de cancer gastrique NF-kB à médiation par migration, et l'activité de l'ILK et l'expression des résultats de survie promotion. sont essentielles pour NF-kB induite par la croissance des cellules
augmentation de l'activité ou l'expression de l'ILK améliore la tumorigenèse en favorisant la croissance cellulaire [6]. sur la base ARNi ILK silençage atténue la croissance de cellules de cancer gastrique [34], tandis que la surexpression de l'ILK est liée à la tumorigenèse gastrique [28]. Dans les tumeurs gastriques humaines et nodules AGS dérivés chez des souris BALB /c, les cellules proliférantes Ki-67-positives ILK coexprimé comme démontré par la base de fluorescence immunocoloration (figure 1A) et immunomarquage à base d'AEC (fichier supplémentaire 1: Matériaux et méthodes supplémentaires; fichier supplémentaire 2: Figure S1) expériences. Pour étudier les mécanismes possibles la croissance des cellules du cancer gastrique sous-jacent ILK-médiée, plusieurs lignées de cellules épithéliales gastriques ont été caractérisés en fonction de leurs différents taux de croissance des cellules, qui étaient plus élevés pour les AGS et SNU-1 cellules et inférieure pour le MKN45 et les cellules de GES-1 et utilisé dans cette étude (fichier supplémentaire 3: Figure S2A). En comparaison avec les MKN45 cellules, les AGS et SNU-1 cellules avaient aussi élevées expression ILK (fichier additionnel 3: Figure S2B et S2C). Un shRNA à base de lentivirus a été utilisée pour réduire au silence l'ILK
génétiquement dans l'AGS, SNU-1, MKN45 et GES-1 des cellules épithéliales gastriques (figure 1b, panneau supérieur), ainsi que dans des cellules A549 et H1975 cellules d'adénocarcinome du poumon humain, HK-2 cellules proximales rénales humaines tubulaires épithéliales et THP-1 cellules monocytaires humaines (fichiers supplémentaires 3: Figure S2D). Dans ces cellules, ILK taire de manière significative (P
< 0,05) la croissance diminué de cellules (figure 1B; Fichier supplémentaire 3: Figure S2E). En outre, le traitement des cellules avec l'inhibiteur de l'ILK T315 [36] de manière significative (P
< 0,05) et dose-dépendante la croissance cellulaire retardée (figure 1C), sans cytotoxicité (données non présentées). En outre, une diminution de la formation de colonies a été observée dans les cellules AGS ILK-taire (fichier supplémentaire 3: Figure S2F). Ainsi, le silençage génique (fichier additionnel 3: Figure S2G) et des méthodes pharmacologiques (fichier supplémentaire 3: Figure S2H) pour supprimer l'activité ILK ou surexpression conduit à l'arrêt du cycle cellulaire au G 1 phase. Ces résultats montrent le rôle de l'ILK favorisant la croissance. La figure 1 ILK expression est nécessaire pour la croissance cellulaire et l'activation de NF-kB. (A) représentant la coloration immunohistochimique à base de fluorescence montre la coexpression de ILK (de
vert) et Ki-67 (
rouge) dans les tumeurs gastriques humaines et nodules AGS dérivés chez la souris BALB /c. DAPI (bleu
) a été utilisée pour contre-coloration nucléaire. ILK + Ki-67 + cellules dans les coupes de tissus colorés par immunofluorescence sont présentés comme point-parcelles d'une analyse FACS-like en utilisant TissueQuest logiciel. Les cellules ont été calculées en pourcentage et du nombre de cellules des cellules totales (cellules DAPI +) par champ. (B) Western blot de l'expression de l'ILK dans les cellules transfectées avec des shRNA ciblant ILK (shILK
) ou un contrôle luciférase (shLuc
). β-actine a été utilisée comme contrôle interne. test à base de WST-8 montre l'inhibition de la croissance cellulaire dans les cellules ILK-réduits au silence. (C) L'effet dose-dépendante du T315 inhibiteur de l'ILK sur l'inhibition de la croissance de cellules AGS. (D) représentant la coloration immunohistochimique à base de fluorescence montre la coexpression de ILK (de
vert) et phosphorylée NF-kB Ser536 (rouge
) dans les tumeurs gastriques humaines et nodules AGS dérivés chez la souris. DAPI (bleu
) a été utilisée pour contre-coloration nucléaire. Les points-parcelles montrent la coexpression de ILK et NF-kB Ser536. Une analyse de régression (E) logistique a montré une corrélation entre ILK, phosphorylée NF-kB Ser536, et Ki-67 dans 93 spécimens de cancer gastrique testés. Les valeurs P de R-squared (R 2
) et sont présentés. (F) EMSA montrant l'activation de NF-kB. (G) Luciférase reporter assay indique le taux d'activation de NF-kB pour contrôler la luciférase de Renilla dans les cellules traitées avec l'inhibiteur de NF-kB CAP (25 ug /ml). (H) La croissance des cellules /mL AGS CAPE-traités 25 ug. (I) d'activation de NF-kB dans les cellules ou shLuc- shILK transfectées. (J) NF-kB activation après 6 h de traitement T315 dans les cellules AGS. Pour la croissance cellulaire, la formation de colonies, et l'activité de la luciférase, les données sont moyennes ± SD à partir de trois expériences indépendantes. * P
< 0,05, ** P
< 0,01 et *** P
< 0,001 par rapport à jour 0 ou le contrôle relatif. #P
≪ 0,05, ## P
< 0,01 et ### P
<. 0,001 par rapport à shLuc
Pour caractériser les caractéristiques de la croissance des cellules ILK-régulée, NF- signalisation kB a été examiné parce que ILK peut agir en amont de la NF-kB en régulant IKKa [13]. Par immunocoloration, la co-expression de l'ILK et phosphorylées de NF-kB (Ser536) a été observée dans les tissus gastriques humains et murins (figure 1D), ainsi que leur co-expression significative (P
< 0,01) et une corrélation positive avec le nombre de cellules qui prolifèrent , ce qui est indiqué par les 55 cas positifs triple du total de 93 échantillons de cancer de l'estomac (figure 1E, fichier additionnel 4: Figure S3). Immunocoloration pour la translocation de NF-kB nucléaire (fichier supplémentaire 3: Figure S2I), EMSA (figure 1F), et promoteur des essais (Figure 1G) ont confirmé l'activation constitutive de NF-kB dans les cellules AGS, mais pas dans les cellules MKN45. Le traitement des cellules avec l'inhibiteur de NF-kB ACEP significativement (P
< 0,001) a réduit l'activation de NF-kB (figure 1G) et la croissance cellulaire (figure 1H). Soit ILK taire (Figure 1I; Fichier supplémentaire 3: Figure S2J) ou le traitement T315 (figure 1J) de manière significative (P
< 0,05) a arrêté l'activité de NF-kB. L'ILK de ces résultats ont démontré que l'ILK est indispensable à la croissance cellulaire dans les lignées cellulaires testées car il facilite l'activation de NF-kB dans les cancers gastriques. régule l'activité de Ras, en facilitant le complexe de IQGAP1-Ras pour contrôler la MAPK activée par le NF-kB
Parce que les cellules AGS abritent PIK3CA
et KRAS de les mutations [37], nous avons examiné les effets réglementaires possibles de ILK sur la modulation de l'activité de NF-kB par ces 2 kinases [38]. Utilisation d'un kit de matrice humaine phospho-MAPK, nous avons identifié 10 kinases qui sont plus fortement exprimés dans les cellules AGS que dans les cellules MKN45. Ces kinases surtout agi en aval des voies de signalisation PI3K et MAPK (fichiers supplémentaires 5: Figure S4A). Par western blot, nous avons confirmé une phosphorylation accrue de AKT, ERK1 /2 et IKBa accompagnée d'une dégradation IKBa dans les cellules AGS (figure 2A). L'inhibition pharmacologique de la c-Raf, MEK1 /2, et PI3K significativement (P
< 0,05) réduit la croissance des cellules (figure 2B), IKBa phosphorylation (Ser32) et de la dégradation (figure 2C), et l'activité de NF-kB ( La figure 2D), ce qui indique que les deux PI3K- et Ras-activation des voies de signalisation a facilité l'activation de NF-kB. Les effets de l'ILK ont été largement étudiés en raison de ses interactions avec growth- cellulaire et AKT NF-kB associée à [4], [9]. Étonnamment, ILK silençage n'a pas affecté AKT et GSK-3β phosphorylation dans les AGS et SNU-1 cellules, mais nettement réduite c-Raf et ERK1 /2 activation dans toutes les cellules testées (Figure 2E; fichier supplémentaire 5: Figure S4B). Sans AKT désactivation, nous avons évalué une voie alternative pour l'activation de NF-kB par un mécanisme impliquant MAPK /p90RSK /IKBa signalisation [38]. Le knockdown de ILK
réduit la phosphorylation multiple de RSK (Thr573, Thr359 /Ser363 et Ser380) et IKBa phosphorylation (Ser32) et une accumulation accrue IKBa (figure 2E). Inhibition MEK1 /2 a provoqué des effets similaires (fichiers supplémentaires 5: Figure S4C) et un arrêt du cycle cellulaire au G 1 phase (fichier supplémentaire 5: Figure S4D). Un essai de traction vers le bas de Ras a révélé que l'inhibition de l'ILK provoqué Ras désactivation sans affecter la stabilité de la protéine Ras (figure 2F). Ces résultats ont montré une voie non-canonique potentiel de ILK pour moduler NF-kB en régulant la signalisation Ras /c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 /2 /IKBa. Figure complexe IQGAP1-Ras ILK 2 soutient l'activité Ras pour activer c-Raf /MEK1 2 /ERK1 signalisation //2 /RSK /IKBa /NF-kB. (A) Western blot des protéines indiquées dans les cellules AGS et MKN45. β-actine a été utilisée comme contrôle interne. les cellules AGS traitées avec un inhibiteur de c-Raf, GW 5074 MEK1 /2 ou des inhibiteurs U0126 PD98059, ou un inhibiteur de PI3K LY294002 pendant 48 heures ont été évalués pour leur croissance (B), la phosphorylation de iKBa à Ser32 (pIκBα
) et la protéine totale (C ) et l'activation de NF-kB (D). (E) shLuc- ou des cellules transfectées shILK, western blots montrent l'expression des protéines indiquées. β-actine a été utilisée comme contrôle interne. essai d'activation (F) présentant une activité de Ras Ras et de l'expression des protéines dans les cellules AGS et shLuc- shILK transfectées. (G) représentant la coloration immunohistochimique à base de fluorescence montrant la coexpression de ILK (
vert) et ERK1 phosphorylée /2 Tyr202 /Thr204 (rouge
) dans les tumeurs gastriques humaines et nodules AGS dérivés chez la souris BALB /c. DAPI (bleu
) a été utilisée pour contre-coloration nucléaire. Les points-parcelles montrent la coexpression des protéines indiquées. Dans le contrôle et les cellules AGS IQGAP1 ARNsi transfectées à 48 h, l'expression des protéines indiquées (H), l'activation de NF-kB, et la croissance cellulaire (I) ont été présentés. lysats de protéines extraites de cellules AGS non traitées (J) ou avec shLuc et shILK transfection (L, M) ont été immunoprécipités (
IP) avec contrôle IgG (C. IgG
) ou avec des anticorps contre ILK, IQGAP1 et Ras . Immunotransferts (IB
) montrent l'expression de l'ILK, IQGAP1 et Ras. (K) représentant la coloration immunohistochimique à base de fluorescence montrant la coexpression de ILK (
vert), IQGAP1 (rouge
) et Ras (rouge
) dans les cellules AGS. DAPI (bleu
) a été utilisée pour contre-coloration nucléaire. La prolifération et l'activité de la luciférase, les données sont moyennes ± SD à partir de trois expériences indépendantes. ** P
< 0,01 et *** P
< 0,001 par rapport au témoin. triangle vertical, augmentation de l'expression; triangle inversé, diminution de l'expression
ILK peut modifier ERK1 2 activation /sous la croissance et la différenciation cellulaire [22]. cependant, la régulation moléculaire liée à la signalisation Ras n'a pas été documentée [2], [3]. La co-expression de l'ILK et ERK1 phosphorylée /2 (Tyr202 /Thr204) a été démontrée dans les tumeurs gastriques humaines et des nodules AGS dérivées des souris BALB /c (figure 2G). ILK interagit avec IQGAP1 [7], a-like GTPase-activating protein Ras qui est différent de GAP, qui transforme Ras à son état inactif. Parce que IQGAP1 contrôle la signalisation Ras /MAPK, il est oncogène [39], [40]. L'expression des protéines de la famille IQGAP était inchangée dans les AGS et MKN45 cellules, même après ILK silençage (fichier supplémentaire 5: Figure S4E). Cependant, faire taire oncogénique IQGAP1, mais pas IQGAP3, (fichier supplémentaire 5: Figure S4F-S4H)-Raf c MEK1 /de signalisation /2 ERK1 /2 /RSK (figure 2H), l'activité de NF-kB, et la croissance inhibe efficacement /cellule ( Figure 2I). En effectuant un test de coimmunoprécipitation, nous avons démontré un ILK de l'hébergement complexe potentiel, IQGAP1 et Ras (Figure 2J). Immunocoloration a confirmé que ILK a été coexprimé à des niveaux similaires à ceux de IQGAP1 et Ras (Figure 2K; fichier supplémentaire 6: Figure S5). Notamment, ILK taire perturbé le complexe IQGAP1-Ras (Figure 2L et 2M). Ces résultats démontrent que l'ILK a facilité la formation du complexe Ras-IQGAP1 pour soutenir l'activité de Ras.
ILK Enzymatic modulant la formation du /2 induite par la croissance des cellules IQGAP1-Ras complexe et ERK1
Nos résultats ont montré que l'inhibition pharmacologique ILK diminution de la croissance cellulaire, ce qui indique le rôle essentiel de l'activité enzymatique de l'ILK. inhibition de plus ILK par l'approche génétique perturbé la signalisation Ras IQGAP1 médiée. Inhiber l'activité de l'ILK sur le plan pharmacologique avec T315 (figure 3A) ou génétiquement par transfection de l'ILK enzymatique mutant A262V [41] (figure 3B) a également perturbé la formation du complexe IQGAP1-Ras dans les cellules AGS. Trois régions tronquées de ILK (figure 3C) sont surexprimés dans les cellules MKN45 pour identifier le domaine essentiel pour le maintien du complexe IQGAP1-Ras. essais de co-immunoprécipitation ont démontré que ILK surexprimée construit hébergeant PH et les régions du domaine kinase catalytique immunoprécipitées avec IQGAP1 et Ras (Figure 3D). Par conséquent, ILK seule kinase de domaine contenant activé ERK1 /2 (Figure 3E). Par rapport à la ILK pleine longueur (ILK 1-452), la transfection de la ILK mutant kinase-dead A262V n'a pas activé ERK1 /2 (figure 3F). Des expériences supplémentaires ont montré que seule la kinase ILK domain-containing a augmenté MEK1 /2 régulée activation de NF-kB (figure 3G), suivie de MEK1 /2 et la croissance cellulaire du NF-kB régulée (figure 3H) dans les cellules MKN45. Ces résultats montrent que l'ILK enzymatique à médiation de la formation du complexe Ras-IQGAP1 pour déclencher ERK1 /2 et la croissance cellulaire du NF-kB à médiation. La figure 3 Appliqué l'expression de l'ILK facilite la croissance cellulaire en induisant une activation de ERK1 /2 /NF-kB. Des lysats de protéines extraites provenant de cellules traitées avec AGS T315 (A) ou transfectées avec un mutant ILKA262V Myc-tagged DDK (B) ont été immunoprécipités (IP
) avec des anticorps contre l'ILK. Immunotransferts (IB
) montrent l'expression de l'ILK, IQGAP1 et Ras. Plasmides basé sur pcDNA3.1-Flag-ILK contenant pleine longueur ILK (ILK 1
-452
), fragment 171-452 (171
-452 de la
ILK) , fragment 1-170 (1
-170 de
ILK) (C), ou Myc-DDK-tagged ILKA262V mutant ont été transfectées dans MKN45 cellules. (D) coimmunoprécipitation de drapeau avec les protéines indiquées est représenté en utilisant western blot. Par rapport à pcDNA3.1-Flag (Flag
) seulement, western blots montrent l'expression de ERK1 phosphorylée /2 à Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (E, F). β-actine a été utilisée comme contrôle interne. l'activation de NF-kB (G) et la croissance cellulaire (H) ont également été détectées en l'absence ou en présence de PD98059 et CAP. Les données sont des moyennes ± SD à partir de trois expériences indépendantes. ** P
< 0,01 par rapport au témoin. ## P
< 0,01 par rapport à ILK1-452. triangle vertical, l'augmentation de l'expression.
l'activation de PI3K et une diminution de l'expression de PTEN faciliter l'activation de ERK1 /2 /NF-kB par la stabilisation ILK
Puisque l'ILK est dépendante de la production d'PIP3 PI3K à médiation par l'activation de son [4], facteur de croissance et l'activation de PI3K intégrine-médiation ou une mutation de PI3K dans les cellules AGS [37] pourraient contribuer à Ilk expression et activation. Par rapport à la croissance des cellules MKN45, la croissance des cellules AGS n'a pas été affectée par élevées d'IL-6 [42], et l'expression de ß1 et ß3 intégrines n'a pas augmenté (fichier supplémentaire 7: Figure S6). Nous avons en outre confirmé que la génération de PIP3 était plus élevée dans les cellules AGS PI3K-muté (figure 4A). Pour explorer les relations entre les voies PI3K, ILK et de signalisation Ras, les cellules AGS ont été traités avec le MEK1 /2, PI3K, ILK ou Ras inhibiteur pour des durées différentes. A 6 h après le traitement, T315 légèrement inhibée MEK1 /2 et ERK1 /2 phosphorylation (fichier supplémentaire 8: Figure S7). A 24 h après le traitement, l'inhibition de PI3K perturbé l'expression de l'ILK, qui a été suivie par MEK1 24/2 /ERK1 /2 de désactivation h après le traitement (figure 4B). Cependant, l'inhibition Ras n'a pas désactiver AKT ou ILK dans les cellules AGS, bien que Ras peut médier l'activation de PI3K [27]. activité Ras similaires aux cellules AGS ILK-réduit au silence, à la fois MKN45 et les cellules AGS de LY294002 stimulée ont montré une réduction (figure 4C). La facilité ILK downregulation inhibiteur de la traduction induite par le cycloheximide LY294002 (figure 4D) et l'inhibiteur de protéasome MG132 inversent l'effet mentionné ci-dessus et ERK1 /2 inactivation (figure 4E). Le suppresseur de tumeur phosphatase PTEN régule négativement PI3K /PDK1 /signalisation [10], [11] et ILK activité AKT [8], [9], et les cellules AGS présentaient une faible expression de PTEN (figure 2A) [43]. L'expression forcée de PTEN dans les cellules AGS non seulement atténué la phosphorylation constitutive de PDK1, AKT et PAK1, mais l'expression de l'ILK a également inhibé, ERK1 /2 phosphorylation (Figure 4F), et l'activation de NF-kB (Figure 4G). Ces résultats indiquent que l'activation de PI3K et une diminution de l'expression de PTEN stabiliser ILK pour réguler l'activation de ERK1 /2 /NF-kB. Figure 4 d'activation de la PI3K et de diminution de l'expression de PTEN faciliter ERK1 activation /2 /NF-kB par la stabilisation de l'ILK. (A) une masse PIP3 kit ELISA a été utilisé pour déterminer l'activité de la PI3K en mesurant la quantité d'extrait de PIP3 AGS non traitées et des cellules MKN45 et à partir de cellules traitées avec AGS LY294002 pendant 24 h. (B) les cellules AGS ont été traités avec PD98059, LY294002, T315, ou Ras inhibiteur FTI-277 pendant les temps indiqués. Western blots montrent l'expression des protéines indiquées. β-actine a été utilisée comme contrôle interne. (C) l'activité de Ras a été détectée dans l'AGS, MKN45 et les cellules AGS LY294002 traitées après 24 h. Western blots montrent l'expression des protéines indiquées dans les cellules AGS prétraités par l'inhibiteur de la traduction du cycloheximide (CHX)
(D) ou d'un inhibiteur de protéasome MG132 (E) pendant 0,5 h, puis traitée avec LY294002 pendant 24 h. PTEN a été surexprimé dans les cellules AGS en utilisant pcDNA3.1-GFP-PTEN (PTEN
). Western blots montrent l'expression des protéines indiquées par rapport à pcDNA3.1-GFP (Vector
) la transfection (F), et l'activation de NF-kB (G) a également été déterminée. Pour la kinase et l'activité luciférase, les données sont moyennes ± SD à partir de trois expériences indépendantes. * P
< 0,05, ** P
< 0,01 et *** P
< 0,001 par rapport au témoin. triangle vertical, augmentation de l'expression; triangle inversé, une diminution de l'expression.
HSP90 associée ligase E3 CHIP négativement Contrôles stabilisation de l'ILK, l'activation de ERK1 /2 /NF-kB, et la croissance cellulaire
En vérifiant en outre le mécanisme sous-jacent de déstabilisation de l'ILK, nos résultats montrent que l'inhibition de l'AKT n'a pas affecté la stabilité ILK, alors que l'inhibition de PI3K stabilité ILK affecté (fichier supplémentaire 9: Figure S8). HSP90 a ensuite été étudiée car elle peut entraîner une dégradation des ILK [25]. Comme pour les résultats de l'inhibition de PI3K, à base de shRNA (figure 5A) ou l'inhibition pharmacologique de HSP90 (fichier supplémentaire 10: Figure S9A) retardé non seulement PDK1 /AKT phosphorylation mais aussi c-Raf /MEK1 /2 /ERK1 2 activation /après dégradation ILK. En outre, génétiquement ou pharmacologiquement inhibant HSP90 par traitement avec 17-AAG ou de l'inhibiteur de HDAC SAHA, qui emprisonne HSP90 dans un état acétylé, enzymatiquement inactif, l'activité de NF-kB atténuée (figure 5B, le fichier supplémentaire 10: La figure S9B) et la croissance cellulaire ( La figure 5C). Cotraitement avec MG132 a sauvé les effets du 17-AAG (Figure 5D) et SAHA sur la dégradation des ILK et ERK1 /2 inactivation (fichier supplémentaire 10: Figure S9C). Dans les cellules MKN45, le traitement avec MG132 augmente l'expression d'ILK, MEK1 /2 et ERK1 /2 phosphorylation (fichier additionnel 11: La figure S10), et l'activation de NF-kB (données non représentées). Coimmunoprécipitation a montré la formation du complexe Hsp90 ILK (données non présentées). En utilisant une approche basée sur les lentivirus-shRNA (Figure 5E), ligases HSP90 associés E3, y compris CHIP, cullin 4A et 4B cullin [26], [44], [45], ont été examinés pour leur rôle dans la dégradation des ILK. Les résultats ont montré que seulement silencing CHIP secouru dégradation de l'ILK et ERK1 /2 inactivation (figure 5F), la désactivation du NF-kB (figure 5G), et l'inhibition de la croissance cellulaire (figure 5H) après l'inhibition pharmacologique de la PI3K et HSP90. CHIP a été nécessaire pour ILK ubiquitination dans les cellules AGS LY294002-traitées (Figure 5I). Ces résultats ont démontré que la signalisation HSP90 /CHIP régule la stabilisation de l'ILK et PI3K à médiation par l'activation de ERK1 2 ILK régulé //NF-kB et facilite ainsi la croissance des cellules. La figure 5 CHIP détermine ILK déstabilisation ERK1 /2 /NF-kB d'inactivation et l'inhibition de la croissance cellulaire après la PI3K /HSP90 inactivation. les cellules AGS ont été transfectées avec ou shLuc shHSP90 ou prétraitées avec l'inhibiteur de HSP90 17-AAG (0,1 uM) pendant 48 h. Western blots montrent l'expression des protéines indiquées (A) et l'activation de NF-kB (B) et la croissance des cellules (C) ont également été déterminés. (D) MG132 prétraitement (0,5 h) inversée expression ILK et ERK1 phosphorylée /2 à Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) dans les cellules AGS 17-AAG-traités. (E) CHIP, cullin 4A et 4B cullin ont été réduits au silence dans les cellules AGS par shRNA. shARN cellules transfectées ont été traitées avec LY294002 ou 17-AAG pendant 24 h. Transfert de Western a démontré l'expression de l'ILK et ERK1 phosphorylée /2 à Tyr202 /Thr204 (pERK1
/2
) (F), et l'activation de NF-kB (G) et la croissance cellulaire (H) ont également été déterminés. (I) Dans shLuc- et les cellules AGS shCHIP transfectées traitées avec LY294002, ILK a été immunoprécipité, et son ubiquitylation a été sondé. Pour l'analyse Western blot, β-actine a été utilisée comme contrôle interne. Pour l'activité de la luciférase et la croissance cellulaire, les données sont moyennes ± SD à partir de trois expériences indépendantes. ** P
< 0,01 et *** P
< 0,001 par rapport au témoin. ## P
< 0,01 et ### P
< 0,001 par rapport à shLuc ou DMSO. NS: non significatif. triangle vertical, augmentation de l'expression; triangle inversé, diminution de l'expression.
PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 signalisation /NF-kB contribue à la migration cellulaire et la sensibilité au 5-FU et cisplatine
augmentation de l'activité de l'ILK ou l'expression pourrait réguler oncogénique procédés, y compris la prolifération cellulaire, la migration et la survie [3], [6]. Nous avons étudié l'implication potentielle de la PI3K identifié /HSP90 /CHIP /ILK /IQGAP1 /ERK1 /2 /NF-kB voie de signalisation dans les avantages de la croissance cellulaire. Par comparaison avec les cellules MKN45, les cellules AGS montrent une augmentation de l'activité migratoire; cependant, ILK ou IQGAP1 taire de manière significative (P
< 0,001) la migration cellulaire supprimée (fichier supplémentaire 12: Figure S11A). bloquant pharmacologiquement PI3K /HSP90 /ILK /MEK1 2 /signalisation /NF-kB dans les cellules AGS également de manière significative (P
< 0,001) a atténué la capacité migratoire (fichier supplémentaire 12: Figure S11B) et CHIP knockdown considérablement inversé la effets inhibiteurs causés par l'inhibition de la PI3K et HSP90 (figure 6A; fichiers supplémentaires 12: Figure S11C). Les agents anticancéreux 5-FU et cisplatine sont couramment utilisés dans le traitement des cancers gastriques [46]. Traiter les cellules AGS avec 5-FU ou le cisplatine, en particulier après ILK ou IQGAP1 silencing, causé une susceptibilité accrue à l'apoptose (figure 6B). T315 a augmenté la sensibilité des cellules AGS à 5-FU et cisplatine (fichier supplémentaire 12: Figure S11D). l'inhibition pharmacologique PI3K /HSP90 /ILK /MEK1 2 signalisation //NF-kB a également sensibilisé les cellules AGS à la 5-FU induit une apoptose (figure 6C), tandis que CHIP silençage retardé les effets synergiques de LY294002 et 17-AAG, le 5-FU l'apoptose induite par (figure 6D). En revanche, la surexpression de l'ILK contenant un domaine kinase catalytique, y compris l'ILK 1-452 et ILK 171-452, renforcée MEK1 /2 /la migration de NF-kB cellulaire régulée (Figure 6E) et de la cellule de survie après un traitement avec le 5-FU (figure 6F). Ces résultats indiquent les effets communs de ILK et IQGAP1 sur ERK1 activation /2 /NF-kB pour la migration et la survie cellulaire. Figure 6 PI3K /HSP90 /CHIP /ILK /ERK1 signalisation /2 /NF-kB détermine la migration cellulaire et contrôle la sensibilité aux agents anticancéreux 5-FU et cisplatine. (A) l'activité de migration a été testée dans les cellules AGS shLuc- ou shCHIP transfectées traitées avec LY294002 (25 pM) et 17-AAG (0,2 uM) pendant 12 h. shLuc, le siRNA contrôle ou le DMSO ont été utilisés comme témoins négatifs. Le nombre de cellules ayant migré dans le champ observé sont présentés. coloration PI suivie par cytométrie de flux a montré l'analyse 5-FU ou de l'apoptose induite par le cisplatine pendant 2 jours dans les cellules AGS ou shILK- siIQGAP1 transfectées (B), les cellules AGS prétraitées avec les inhibiteurs indiqués pendant 0,5 h (C), et shLuc- ou transfectée shCHIP cellules AGS a traité avec LY294002 ou 17-AAG (D). shLuc, le siRNA contrôle ou le DMSO ont été utilisés comme témoins négatifs. Plasmides basé sur pcDNA3.1-Flag-ILK contenant pleine longueur ILK (ILK 1
-452
), fragment 171-452 (171
-452 de la
ILK) ou fragment 1-170 (1
-170 de
ILK) ont été transfectées dans MKN45 cellules. Par rapport à pcDNA3.1-Flag (Flag
) seulement, la migration cellulaire (E) et l'apoptose induite par le 5-FU (5 uM) (F) ont été détectés en l'absence ou la présence de PD98059 et CAP. Les données sont des moyennes ± SD à partir de trois expériences indépendantes. * P
< 0,05, ** P
< 0,01 et *** P
< 0,001 par rapport au témoin. #P
≪ 0,05, ## P
< 0,01 et ### P
< 0,001 par rapport au témoin. NS:. Non significative
signalisation de l'EGFR régule ILK /IQGAP1 pour activer ERK1 /2, NF-kB, et la migration cellulaire et la prolifération
Pour vérifier le rôle de ILK /IQGAP1 médiée par l'activation de ERK1 /2 et NF-kB nous avons examiné la signalisation EGF /EGFR comme décrit précédemment [47], [48]. β-actine a été utilisée comme contrôle interne. β-actine a été utilisée comme contrôle interne. β-actine a été utilisée comme contrôle interne. β-actine a été utilisée comme contrôle interne. β-actine a été utilisée comme contrôle interne. β-actine a été utilisée comme contrôle interne. β-actine a été utilisée comme contrôle interne. * P
< β-actine a été utilisée comme contrôle interne. * P
< β-actine a été utilisée comme contrôle interne. β-actine a été utilisée comme contrôle interne. ** P
< * P
<

• caractéristiques combinées basées sur l'expression MT1-MMP, la densité CD11b + de immunocytes et LNR prédire les résultats cliniques des caractéristiques de cancer
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