Les microARN-206 inhibe la croissance des cellules de cancer de l'estomac et les métastases

MicroARN-206 supprime la croissance des cellules du cancer gastrique et métastases
cancer gastrique de Résumé est l'une des principales causes de décès par cancer dans le monde entier et réalise un taux de risque élevé métastatique. En plus d'autres oncogènes codant pour des protéines et des gènes suppresseurs de tumeur, les microARN jouent un rôle important dans la progression du cancer gastrique tumorigènes. Ici, nous montrons que miR-206 est exprimé à de faibles niveaux sensiblement dans une cohorte de tumeurs gastriques par rapport à leurs tissus normaux correspondants, et dans un certain nombre de lignées cellulaires de cancer gastrique. La régulation de miR-206 a été particulièrement importante dans les tumeurs avec métastases lymphatiques, invasion locale et avancée TNM. Nous constatons que l'expression forcée de miR-206 a supprimé la prolifération, des colonies de formation, et xénogreffe tumorigenèse des cellules SCG-7901, une lignée de cellules de cancer gastrique. L'expression forcée de miR-206 a également supprimé la migration SCG-7901 et l'invasion cellulaire, ainsi que des métastases dans la culture cellulaire ou des modèles de souris injectées queue veine, respectivement. L'effet anti-métastatique de miR-206 est probablement médiée par le ciblage des gènes régulateurs de métastases STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FrS2, SFRP1, BCL2, BDNF, et K-ras, qui étaient fortement régulée à la baisse par l'expression stable de exogène miR -206 dans les cellules SCG-7901. Pris ensemble, nos résultats indiquent que miR-206 est un suppresseur de tumeur du cancer gastrique agissant à des mesures qui régulent les métastases.
Mots-clés
cancer gastrique miR-206 Métastase tumeur suppresseur cancer gastrique Introduction (GC) classe le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause principale de décès liés au cancer dans le monde [1]. Le pronostic pour les patients atteints de cancer gastrique avancé est pauvre, en dépit des améliorations récentes dans gastriectomy, la chimiothérapie, la radiothérapie et [2]. Depuis GC est une maladie polygénique résultant à la suite de multiples dérégulations géniques, l'élucidation du réseau réglementaire régissant GC tumorigenèse est impératif pour le développement de thérapies novatrices ciblées.
Tumorigenèse dans l'estomac est un processus en plusieurs étapes qui implique des altérations génétiques et épigénétiques de protéines -coding ainsi que non codante proto-oncogènes et gènes suppresseurs de tumeur. Les interactions entre l'hôte, l'environnement et les facteurs bactériens influencent également la progression de la maladie. Helicobacter pylori
(HP) l'infection a été établie en tant que facteur de risque majeur pour GC; les deux sous-types histologiques de cancer gastrique, de l'intestin et les sous-types diffus, sont tous deux associés à l'infection par HP, ce qui contribue à plus de 80% des cas [3], en particulier dans le cancer gastrique antrale /corps [4]. Mécanistique, a été trouvé une infection HP pour provoquer un doublement de l'EGF et l'EGFR dans les tissus de biopsies antrales gastriques, mais son élimination réduit les niveaux de ces deux facteurs à celles des témoins [5]. infection HP chez les patients souffrant de gastrite chronique est également significativement associée à la régulation de la E-cadhérine due à l'augmentation de la méthylation du promoteur [6], alors que l'éradication HP a réduit de manière significative les niveaux de MMP-9, une métalloprotéinase positivement associée à l'invasion tumorale et les métastases [ ,,,0],7], dans l'antre et la muqueuse du corpus [8].
en plus de l'infection par HP, il existe une multitude de causes conduisant à une expression aberrante des gènes dans le cancer gastrique, et le mécanisme de métastases du cancer de l'estomac est très complexe et . La signalisation MAPK Ras-dépendante, ce qui conduit finalement à une augmentation de la prolifération du cancer gastrique et est principalement provoquée par des aberrations de K-ras activation, est souvent associée au cancer gastrique de type intestinal [9]. Stanniocalcine 2 (STC2), glycoprotéine sécrétée ayant des fonctions importantes dans l'homéostase du calcium et du phosphate, a été rapportée pour être exprimé à des taux élevés de tissus cancéreux gastriques, des métastases des ganglions lymphatiques, invasion et veineuse [10]. Le taux de survie à 5 ans était significativement plus faible chez les patients présentant une expression de STC2 par rapport aux patients sans expression STC2 [11]. BDNF (Brain-derived factor neutrophic) expression a été signalé pour montrer augmenté de manière significative l'expression dans les tissus de cancer gastrique par rapport à la muqueuse normale adjacente, et des niveaux élevés de BDNF à l'avant invasive ont été corrélées à l'invasion des vaisseaux, métastases ganglionnaires, dissémination péritonéale, et les pauvres le pronostic chez les patients atteints de cancer gastrique [12]. Malgré les progrès dans l'identification des gènes régulateurs ci-dessus, le mécanisme sous-jacent précis causant GC métastases reste encore à déterminer.
Dérégulations de microARN jouent un rôle très important dans la tumorigenèse. Le rôle des microARN dans la tumorigenèse du cancer gastrique a été bien documentée. Ici, nous nous concentrons sur miR-206, qui, avec ses paralogues étroitement liés miR-1, 133a et miR-133b, joue un rôle très important dans la différenciation musculaire. Ces quatre microARN sont hautement conservées dans l'ordre et de l'organisation génomique, et sont appelés myomiRs parce qu'ils se sont révélés être exprimés à des niveaux élevés dans les muscles [13]. MiR-1-1 /miR-133a-2, miR-1-2 /miR-133a-1, et miR-206 /miR-133b grappes de formulaire dans trois régions chromosomiques différents dans le génome humain 20q13.33, 18q11.2 et 6p12.2, respectivement. Cependant, ces miARN peuvent agir comme suppresseurs de tumeurs dans divers cancers humains [14]; par exemple, miR-1 et miR-133a se sont révélés être fréquemment régulée à la baisse dans les cancers de la vessie, et supprimer la croissance de la tumeur en ciblant TAGLN2 [15]. MiR-1 et miR-206 se sont révélés posséder des rôles semblables suppresseurs de tumeur dans le rhabdomyosarcome en bloquant l'expression de c-Met [16]. MiR-206 a également été rapporté pour agir comme un suppresseur de tumeur dans le cancer du sein [17] et le cancer du poumon [18]. Nous rapportons ici que miR-206 expression est inversement associée à la métastase lymphatique, invasion locale et la mise en scène TNM de malignité de GC, et la force d'expression de miR-206 supprime la croissance des cellules GC, la tumorigenèse et la métastase. Matériaux et méthodes
des échantillons de tissus
chirurgicalement réséquées cancer gastrique et des tissus humains non tumorales adjacentes ont été obtenus à partir de 35 patients admis dans le service de chirurgie gastro-intestinale, l'hôpital affilié de l'Université médicale de Nanjing (Hôpital de Changzhou peuple seconde). Le projet a été approuvé par le Comité d'éthique de la recherche de l'Université médicale de Nanjing, et un consentement écrit a été obtenu à partir de chaque patient inscrit dans cette étude. Tous les échantillons de tissus ont été traités pour le stockage dans de l'azote liquide et H &. E coloration pour l'analyse pathologique
lignées cellulaires et gastriques humaines lignées de cellules du cancer de la cellule culture SGC-7901, BGC-823, AGS, cellules gastriques non malignes GES-1 ligne, et les cellules HEK293T ont été achetés auprès de la cellule Resource Center, Institut de Shanghai de biochimie et de biologie cellulaire, l'Académie chinoise des sciences. Ces cellules ont été maintenues dans un incubateur humide à 37 ° C, 5% CO 2 et CGS-7901, BGC-823 et Ges-1 des cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640, les cellules HEK293T dans du DMEM et les cellules AGS à F12K moyenne, respectivement. Tous les milieux de culture ont été complétées par 10% de sérum et d'antibiotiques de foetus de bovin. Extraction
d'ARN et quantitative en temps réel L'ARN total
PCR à partir de tissus gastriques ou des lignées cellulaires ont été extraites en utilisant le réactif Trizol (Takara) selon les instructions du fabricant. L'ADNc a été synthétisé avec le kit de réactifs PrimeScript RT (Takara). RT-PCR quantitative a été effectuée avec une trousse SYBR Prémélange Ex Taq (Takara) sur un système de PCR en temps réel 7500 (ABI) et analysées avec le progiciel d'analyse SDS (version 2.0.1, Applied Biosystems). Des amorces de PCR ont été obtenus auprès d'Invitrogen, et la réaction a été de 95 ° C, 10 min, suivie de 40 cycles de 95 ° C, 15 secondes et 60 ° C, 1 min. Le U6 snRNA a été utilisé comme témoin interne. Les résultats ont été présentés comme facteur de changement, calculée en utilisant la 2 -. Vecteur de △ CT méthode, et un rapport d'expression dans les tumeurs par rapport aux normales des tissus moins de 1,0 a été considéré comme faible construit
Pri -mir-206 a été amplifié à partir d'ADN génomique humain normal par PCR en utilisant les amorces: 206 Pour-5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGATGCGGGCTGCTTCTGGA-3 'et 206-Rev 5'-AGCTTTGTTTAAACCCTTGGTGAGGGAGTCATTTGC-3'. Le fragment de PCR a été inséré dans le vecteur MSCV-P2GM pour générer P2GM-miR-206. Le P2GM vecteur vide a été utilisé comme témoin. Le plasmide de transfection de cellules
transfection de cellules SGC-7901 ont été effectuées en utilisant la lipofectamine 2000 (Invitrogen) et des clones stables portant P2GM-miR-206 ou le vecteur vide ont été sélectionnés pour la résistance à la puromycine (10 pg /ml). MiR-206 et imite témoins négatifs ont été obtenus à partir de Ribobio (Guangzhou, Chine) et la transfection de cellules dans imite SGC-7901 a été fait en utilisant oligofectamine (Invitrogen). En bref, les cellules SGC-7901 étalées 1 jour plus tôt ont été transfectées avec 100 nm de miR-206 ou de contrôle imite à atteindre 50% de confluence. Après 48 h, les cellules ont été traitées pour une analyse ultérieure. Essai de prolifération cellulaire

test MTT a été utilisé pour estimer le taux de prolifération des cellules SGC-7901. En bref, les cellules SGC-7901 ont été trypsinzed 2 jours après transfection et réensemencées à 2,5 x 10 3 cellules par puits dans des plaques à 96 puits. MTT (bromure de 3- (4, 5-diméthylthiazol-2-yl) -2, 5-diphényl-tetrazoliumbromide) a été ajouté au milieu de culture à des intervalles déterminés pour xx h, et l'absorbance à 490 nm a été mesurée avec un spectrophotomètre. Chaque essai a été réalisé en triple et répété trois fois indépendamment Colony formation test
.
Cellules SCG-7901 stables portant miR-206 ou le contrôle vide ont été trypsinisées et réensemencées à 1 × 10 3 par puits dans 6 -Bien plaques. Après 14 jours de culture dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FBS, les colonies ont été fixées avec 3,7% de methanol et colorées avec du cristal violet à 0,1%. Les colonies contenant au moins 50 cellules ont été notées. Chaque essai a été réalisé en triple.
Cytométrie de flux
SGC-7901 cellules transfectées avec miR-206 contrôle mimique ou négative ont été trypsinisées et remises en suspension dans 1 x tampon de liaison à 1 × 10 6 cellules /ml. 100 ul de cette suspension cellulaire ont été mises en incubation avec 5 l d'annexine V-FITC et 5 ul d'iodure propridium (PI) pendant 15 minutes dans l'obscurité. La réaction a été terminée par l'addition de 400 ul de 1 x tampon de liaison et on l'analyse avec (FACSCalibur à l'aide du logiciel CellQuest (Becton Dickinson). FITC-annexine cellules V-positives et PI-négatif ont été considérés comme apoptotiques et les expériences ont été réalisées en migration et l'invasion des tests de triplicats.
cicatrisation de la plaie la migration des cellules a été évaluée en mesurant le mouvement des cellules dans une zone acellulaire créé par raclage la pelouse de cellules confluentes avec une pointe de pipette de 200 pi. la fermeture de la plaie a été photographié 48 heures plus tard sous un microscope. pour transwell essais de migration, 5 x 10 4 cellules ont été ajoutées dans la chambre supérieure de l'insert (BD science, Sparks, MD, USA), tandis que 1 × 10 5 cellules ont été utilisées pour matrigel des essais d'invasion. dans ces expériences, les cellules ont été trypsinisées et remises en suspension dans un milieu dépourvu de sérum avant d'être ensemencés dans la chambre supérieure. le milieu de culture complet contenant 10% de FBS a été ajouté dans la chambre inférieure. Les cellules ont été incubées dans un incubateur humidifié à 37 ° C pendant 24 heures. Les cellules sur la membrane ont été fixées, colorées et comptées. Chaque expérience a été réalisée en triple modèle de tumeur xénogreffe de.
Jeune souris nude athymiques femelles (6 semaines) ont été achetés à partir du Centre de recherche Modèle animal de l'Université de Nanjing. Environ 1,5 x 10 6 cellules SGC-7901 stables portant P2GM-miR-206 ou le vecteur vide ont été injectés par voie sous-cutanée dans les flancs inférieurs de 5 souris nude. Les volumes des tumeurs ont été mesurés tous les 3 jours après la sixième injection de poste de jour en avant pendant 24 jours avant que les animaux ont été sacrifiés. Le volume final et le poids ont été mesurés après que les tumeurs ont été disséquées. Les souris nues ont été manipulés et pris en charge selon les NIH et soin des animaux Utilisation Comité des lignes directrices dans l'expérience Animal Center de l'Université de Nanjing médical (Nanjing, Jiangsu, province, Chine).
analyse statistique
analyse statistique a été réalisée à l'aide le paquet SPSS logiciel (SPSS version standard 16.0, SPSS Inc). Les données sont montrées comme la moyenne ± SEM. Les échantillons appariés t
-test a été utilisé dans l'analyse du différentiel miR-206 expression entre la tumeur et les tissus normaux. Pour in vitro et des expériences in vivo, indépendants échantillons t
-test a été utilisé pour évaluer l'importance de la différence entre les groupes de traitement et de contrôle. P valeur < Résultats de 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
Down-régulation de miR-206 en corrélation avec la tumorigenèse humaine gastrique du cancer, l'invasion et la métastase
Dans une vaste enquête sur le génome pour l'expression de microARN, nous l'avons déjà identifié plusieurs membres de la famille myomiR, à savoir miR-1 /133a et miR-133b /206, dont les niveaux ont été réduits dans un cancer neuroectodermique (résultats non publiés). Ces micro-ARN sont principalement connus pour fonctionner dans la différenciation myogénique et, dans une moindre mesure, de la tumorigenèse du cancer pédiatrique. Pour explorer si ces myomiRs pourraient aussi avoir un rôle dans le tumorigensis des cancers courants chez l'adulte, nous avons examiné leurs niveaux d'expression en temps réel par la quantification tige-boucle RT PCR dans une cohorte de tumeurs gastriques fraîchement réséquées et de leur correspondant à des tissus normaux, et a révélé que le rapport entre la médiane de miR-206 par rapport à l'ARNsn U6 des 35 tumeurs était 4 fois plus faible que celle des tissus normaux (figure 1A). Comparaison de Pair-wise a indiqué que plus de 85% des tumeurs a montré une réduction de plus de 2 fois l'expression de miR-206 par rapport à leurs contrôles correspondants, avec seulement deux paires montrant augmentation (figure 1B). L'expression de miR-206 a également été diminuée dans un certain nombre de lignées cellulaires de cancer gastrique humain, y compris SGC-7901, BGC-823, MGC-803 et les cellules AGS, par rapport à celle Ges-1 des cellules gastriques normales (figure 1c). dossiers clinicopathologiques de ces tumeurs ont montré que la réduction de l'expression de miR-206 était significativement associée à la métastase lymphatique, invasion locale et le TNM malignité mise en scène, mais pas avec l'âge, le sexe, la taille de la tumeur ou l'emplacement (tableau 1). Ces données impliquent que miR-206 peut normalement exercer un contrôle inhibiteur sur la tumorigenèse gastrique, l'invasion et les métastases. La figure 1 a réduit les niveaux d'expression de miR-206 dans des tissus de cancer de l'estomac et des lignées cellulaires. (A) Distribution d'expression miR-206 dans une cohorte de 35 tissus GC et noncancerous humains par qRT-PCR. L'ARN U6 endogène a été utilisé comme contrôle interne. (B) de comparaison par paires d'expression miR-206 entre GC et correspondant à des tissus non cancéreux montrant miR-206 expression a été réduite à 86% (30/35) des paires d'échantillons. (C) Expression relative de miR-206 dans quatre lignées de cellules GC et une lignée cellulaire gastrique normal (GES-1).
Tableau 1 Caractéristiques anatomocliniques de miR-206
Catégories
NO. des patients
niveaux relatifs de miR-206 (moyenne ± SEM)
P-valeur
de Genre Homme
21
0,49 ± 0,07
0,32
Femme
14
0,40 ± 0,06
âge (années)
≥60
19
0,45 ± 0,05 0,93

< 60
16
0,46 ± 0,09
Diamètre (cm)
≥5
13
0,46 ± 0,09
0.90
< 5
22
0,45 ± 0,05
Moyen et proximale troisième
emplacement 23
0,47 ± 0,06
0,65
distal troisième
12
0,42 ± 0,07
Degré de différenciation
bien et modérément
12
0,48 ± 0,07
0,70
mal
23
0,44 ± 0,07
T1 + T2
invasion locale
10
0,65 ± 0,07
0,01
T3 + 25
0,37 ± 0,05
ganglionnaire de métastases de T4
NO
14
0,57 ± 0,06 0,04

OUI
21
0,38 ± 0,07
stade TNM
I + II
12
0,60 ± 0,07 0,02

III + IV
23
0,38 ± 0,06 de l'expression de miR-133a a également été trouvé pour être régulée à la baisse dans les tumeurs par les critères ci-dessus (fichier additionnel 1: Figure S1), mais l'expression de miR-1, dont les gènes sont regroupés avec ceux codant pour miR-133a [14], n'a pas été (fichier supplémentaire 2: Figure S2). Depuis miR-206 est codée par un gène unique, il a été choisi pour une analyse ultérieure.
MiR-206 inhibe la croissance des cellules du cancer gastrique
Pour déterminer si miR-206 a la propension à supprimer la tumorigenèse du cancer gastrique, nous avons introduit un synthétiques double brin miR-206 imite, 206mi, pour modifier le niveau du total miR-206 dans les cellules cancéreuses gastriques SGC-7901, qui expriment un faible niveau de miR-206 par rapport à celui de GSE-1 des cellules normales de contrôle (figure 1C) et surveiller le taux de croissance des cellules en utilisant le colorant de tétrazolium, l'acide 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényl tétrazolium (MTT). Tige-boucle PCR a confirmé le taux élevé de miR-206 dans les cellules transfectées SGC-7901 (figure 2A), et les résultats de l'essai MTT a indiqué que le taux de ces cellules de croissance a été nettement réduite par rapport à celle des cellules de réception non- imite spécifiques de contrôle, miR-ctrl, sur une période de 5 jours (figure 2B). Nous avons également généré un plasmide de pré-miR-206 exprimant dans le vecteur P2GM et des cellules de tri activé par fluorescence (FACS) L'analyse montre que le G1 en phase prolongée et la phase S raccourcies dans P2GM-206 (P206) transfectée par rapport à le vecteur P2GM cellules transfectées SGC-7901 (figure 2C), corroborant ainsi le résultat de la 206mi expérience synoptique ci-dessus. augmenter artificiellement le niveau total de miR-206 avec 206 mi a également entraîné une augmentation significative de l'apoptose dans les 48 heures dans les cellules SGC-7901 sur les synoptiques de contrôle des cellules transfectées tel que déterminé par analyse de cytométrie de flux de PI et double absorption Annexin V (Figure 2D et E). Ces données indiquent que miR-206 est un régulateur puissant anti-prolifération des cellules cancéreuses gastriques cultivées. Figure 2 L'expression forcée de miR-206 supprime la prolifération des cellules cancéreuses gastriques SGC-7901. (A) les niveaux totaux de miR-206 dans des cellules SGC-7901 transfectées avec le miR-ctrl ou les imite synthétiques de miR-206, 206mi (*** P < 0,0001). (B) pour les dosages MTT SGC-7901 cellules transfectées avec miR-206 mimétiques à une concentration finale de 100 nM. A partir de 24 h post-transfection, les essais a été lu toutes les 24 h pendant 5 jours consécutifs. Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM à partir de trois expériences indépendantes. (*** P < 0,0001). (C) Une distribution du cycle cellulaire de l'histogramme représentant des cellules SGC-7901 transitoirement transfectées avec P2GM-miR-206 ou P2GM-ctrl (100 nM). Les résultats représentent les moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes (* p < 0,05). (D) Les cellules de coloration positive pour Annexin V-FITC et négatif pour PI à 48 h post-transfection ont été considérés comme ayant subi l'apoptose. (E) Taux apoptotique moyenne de trois expériences indépendantes ± SEM sont indiquées (*** P < 0,0001).
MiR-206 inhibe gastrique la croissance des cellules cancéreuses et la tumeur xénogreffe formation d'ancrage dépendant
Pour examiner le long terme impact de miR-206 sur la croissance cellulaire et la formation de colonies, nous avons généré une lignée stable de cellules SGC-7901, P2GM-miR-206, qui exprime miR-206 à partir d'un vecteur constitutivement active, MSCV-P2GM, et une ligne de vecteur vide cellules -carrying, P2GM-miRctrl. Tout d'abord, nous avons examiné le niveau de miR-206 expression dans ces deux lignées cellulaires stables et a constaté que miR-206 a été considérablement élevée dans P2GM-miR-206 lignée cellulaire stable (figure 3A). Ensuite, nous avons analysé l'effet de miR-206 sur la croissance de l'ancrage à charge par les cellules faiblement ensemencement trypsinisées directement sur boîte de Pétri et de visualiser les colonies cellulaires par coloration au cristal violet après 14 jours de culture. Les résultats ont montré que les cellules stables contrôle vecteur porteur formé de manière significative plus de colonies que les cellules miR-206 exprimant (Figure 3B et C). Nous avons également injecté ces cellules stables sous-cutanée dans deux dos bilatéraux inférieurs de souris nude, et surveillé la croissance tumorale par jour. Vingt-quatre jours après l'injection, les souris ont été sacrifiées et les tumeurs ont été excisées et pesées (figure 3D et E). Les résultats ont montré que la moyenne des volumes de tumeurs miR-206-surexprimant a augmenté à un rythme beaucoup plus lent que les tumeurs de contrôle et le poids final moyen était significativement inférieure à celle des témoins (Figure 3F et G). La figure 3 miR-206 inhibe la croissance des cellules GC dépendantes de l'ancrage et la formation de tumeurs de xénogreffes. (A) Le niveau d'expression de miR-206 dans P2GM-miR-206 lignée cellulaire stable et cellules stables contrôle vecteur porteur (*** P < 0,0001). (B) Un millier de cellules CGT-7901 stables de miR-206 et un contrôle négatif ont été étalées sur des plaques 6 puits et un essai de formation de colonies réalisée. Les résultats représentatifs de la formation de colonies de P2GM-miR-commande, P2GM-miR-206. (C) Le nombre de colonies a été compté le 14e jour après le semis. Stable cellules SGC-7901 de miR-206 ont atteint une densité plus faible par rapport à NC. Les résultats représentent les moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes (** p < 0,01). (D) des cellules SGC-7901 avec une expression stable de miR-206 ou non ont été inoculées par voie sous cutanée dans les deux flancs de souris nude (n = 5 par groupe). photographies représentatives des souris nude 24 jours après l'inoculation sont présentés. (E) Les souris ont été tuées et les tumeurs ont été pondérées 24 jours après l'inoculation, les xénogreffes avec miR-206 surexpression étaient significativement plus petites que les xénogreffes de contrôle. (F) montre la courbe de croissance de la tumeur (* p < 0,05 et ** P < 0,01). (G) des tumeurs de chaque groupe ont été pesés immédiatement après le retrait. Le poids moyen de la tumeur est indiquée comme moyenne ± SEM (* p < 0,05).
MiR-206 inhibe l'invasion des cellules du cancer gastrique et la migration
réduit l'expression de miR-206 dans les tumeurs localement invasives et métastatiques (tableau 1) suggère que ce microARN peut réglementer processus migratoire des cellules. Pour déterminer si tel est bien le cas, nous avons procédé à la guérison des plaies et Transwell tests de migration utilisant les cellules SGC-7901 stables miR-206 exprimant. Les résultats ont montré que la surexpression ectopique de miR-206 a provoqué une suppression de la migration cellulaire dans des cellules CGT-7901 comme il ressort de l'essai de cicatrisation (figure 4A et B) et le dosage de migration cellulaire Transwell (figure 4C et D). surexpression ectopique de miR-206 l'invasion des cellules SGC-7901 encore inhibé comme démontré par l'invasion essai Matrigel (Figure 4E et F). Par conséquent, miR-206 affiche une propriété suppressive dans la migration des cellules cancéreuses et l'invasion des tests in vitro. Figure 4 miR-206 supprime la migration des cellules GC et l'invasion in vitro. (A) Le test de cicatrisation montré différentes motilité de cellules dans miR-commande, miR-206 cellules. L'expression ectopique de miR-206 évidemment inhibé la migration des cellules SGC-7901. (B) montre les résultats statistiques. Les données représentent les moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes. (** P < 0,01). Surexpression de miR-206 capacités considérablement entravé la migration cellulaire (C) et de l'invasion (E) dans le miR-206 cellules exprimant SGC-7901 stables par rapport au contrôle négatif. (D, F) présente les résultats statistiques, respectivement. Les données représentent les moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes. (** P < 0,01, *** P < 0,0001).
MiR-206 inhibe les métastases du foie de GC in vivo
Pour étudier l'effet de miR-206 sur les métastases in vivo, nous avons effectué la queue injection -vein de P2GM-miR-206 et le vecteur seul cellules P2GM avec des souris nude, 42 jours après l'injection, nous avons récolté et photographié les foies (figure 5A, panneaux supérieurs). H & E coloration des coupes de tissus ont indiqué une 7 fois plus faible nombre de nodules tumoraux métastatiques par unité de surface dans les foies injectés avec P2GM-miR-206 cellules que celles injectées avec des cellules témoins P2GM (figure 5A, les panneaux inférieurs et B). En outre, la taille des nodules de tumeur dans le foie injecté cellules P2GM-miR-206 étaient beaucoup plus petites que celles du groupe témoin (figure 5A). Ce résultat soutient fortement que miR-206 peut normalement avoir un rôle de suppresseur de tumeur prévention des métastases de cellules cancéreuses gastriques. Figure 5 miR-206 inhibe les métastases du foie de GC in vivo. (A) d'images macroscopiques représentatifs de foie de souris, 42 jours après l'inoculation, (La partie supérieure). photographies représentatifs de H & E tachés métastases hépatiques spontanées. Grossissement: 10 × (La partie inférieure). Les résultats montrent que les nodules de tumeur dans le groupe P2GM-miR-206 sont plus petites et moins par rapport au groupe témoin. (B) Le nombre de foie loci métastatique ont été comptées et comparées entre les souris porteuses SGC-7901 cellules de contrôle des vecteurs et des cellules SGC-7901 exprimant miR-206. Les données représentent la moyenne ± SEM, (*** P < 0,0001). (C) niveau de l'ARNm relative des cibles potentielles de miR-206 entre SGC-7901-miR-P2GM et SGC-7901-miR-206 cellules. (D) Le niveau d'ARNm relative des cibles potentielles de miR-206 entre GES-1 et des lignées cellulaires SGC-7901.
Pour déterminer le mécanisme par lequel miR-206 exerce son rôle anti-métastatique, nous avons cherché possible Mir- 206 gènes cibles en utilisant une combinaison d'outils d'acquisition de cible de microARN en ligne, et des renvois aux candidats qui en résultent pour ceux qui ont été signalés à jouer un rôle dans les métastases. Dans un groupe de 20 de ces gènes, nous avons trouvé 9 d'entre eux (fichier supplémentaire 3: Tableau S1), à savoir STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, et K-ras, ont été drastiquement réglementés vers le bas par miR-206 dans les P2GM-miR-206 cellules stables par rapport à leurs niveaux respectifs dans les cellules stables P2GM vecteur (Figure 5C). Certains de ces gènes cibles de miR-206 étaient nettement régulée à la hausse dans les cellules tumorales GC parentales SCG-7901 par rapport à GES-1 gastrique normale des cellules (figure 5D), ce qui suggère un événement causal probable. Ainsi, miR-206 inhibe probablement la métastase des cellules GC tumorales à travers un réseau de gènes régulateurs.
Discussion
Bien que la dysrégulation des miARN a été signalé dans divers types de cancers humains [19], l'expression aberrante et rôle potentiel des miARN dans cancers gastriques ont été peu étudiées. Ici, nous démontrons que miR-206 est fréquemment régulés à la baisse dans les cancers gastriques humaines et des lignées cellulaires cancéreuses. Compte tenu de l'expression de miR-206 réduit rapportée dans plusieurs types de tumeurs, nos résultats suggèrent que la réduction de l'expression de miR-206 est vraisemblablement un événement préalable à la tumorigenèse. Cette exigence a été rendue encore plus pertinent lorsque nous avons constaté que de faibles niveaux de miR-206 étaient significativement associés à des métastases lymphatiques, invasion locale, et le stade TNM. Cette notion a été corroborée par les résultats de l'expression ectopique de miR-206 dans la lignée cellulaire de cancer du GC SCG-7901, qui a montré que miR-206 réprimé la prolifération des cellules de GC, la formation de colonies, l'invasion et la migration. Enfin, la capacité de miR-206 pour supprimer la métastase des cellules SCG-7901 dans le foie a fourni une explication claire de la corrélation entre les faibles niveaux de miR-206 et des cancers gastriques invasifs et métastatiques. Récemment STC2 a été identifié comme un marqueur prédictif de métastases ganglionnaires dans l'oesophage de carcinome à cellules squameuses [20]. Expression de TrkB et BDNF est associée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de CPNPC [21]. Plusieurs études ont rapporté que l'expression de IGF1R est élevée dans le cancer de la prostate métastatique et une progression de la résistance aux hormones [22, 23]. expression de BCL2 dans le cancer de la prostate primaire est un marqueur de mauvais pronostic, avec un risque accru de récidive [24]. Ce qui est dit ci-dessus suggère un rôle oncogénique commun dans le cancer humain. En outre, nous avons identifié STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF et K-ras comme cibles fonctionnels putatifs de miR-206, dans le cadre d'entre eux ont été parlé ci-dessus. Prises ensemble, nos résultats suggèrent un rôle de suppresseur de tumeur de miR-206 dans le cancer gastrique humain
Preuve de miR-206 en tant que suppresseur de la croissance tumorale a été rapporté dans plusieurs cancers. MiR-206 a été trouvé d'abord être régulée à la baisse dans ERalpha les tissus de cancer du sein humain et l'introduction -positif de miR-206 dans les cellules MCF-7 du cancer du sein estrogène dépendantes inhibe la croissance des cellules dans une relation dose-dépendante du temps et de manière [25]. En outre, miR-206 pourrait favoriser la croissance et la différenciation myogénique bloc de tumeur chez des souris xénogreffées régulant par le bas du produit du proto-oncogène MET: Met tyrosine kinase du récepteur [26]. Yan a également constaté que l'inhibition de miR-206 fonction pourrait contribuer à une prolifération cellulaire aberrante et la migration, conduisant au développement d'un rhabdomyosarcome par la suppression de c-Met [16]. Pendant ce temps, miR-206 peut être utilisé pour inhiber la migration des cellules HeLa et concentrer la formation à la fois en inhibant la protéine Notch3 et de l'ARNm [27]. En outre, miR-206 a été régulée à la baisse dans le cancer du poumon élevé par rapport aux métastases de tumeurs et de métastases faibles tissus pulmonaires normaux, la surexpression de miR-206 a inhibé la migration et l'invasion des cellules cancéreuses du poumon [18]. MiR-206 expression a diminué en récepteurs d'œstrogènes α (ERa) -positif endomètre endometrioid adénocarcinome (CEE) et sa surexpression inhibé la prolifération ERa-dépendante, une altération de l'invasivité et induit un arrêt du cycle cellulaire des lignées cellulaires CEE ERa-positifs [28]. Tous ces résultats indiquent que miR-206 peut jouer un rôle de suppresseur de tumeur dans divers cancers.
Métastase contribue à la plupart des décès liés au cancer. GC est la deuxième principale cause de décès lié au cancer dans le monde entier en raison de son taux élevé de métastases, y compris les ganglions lymphatiques, le péritoine, le foie, etc. En particulier, le taux de survie à 5 ans de tumeur gastrique avec métastases hépatiques ne dépasse pas 10% et la médiane la survie sans traitement est d'environ 3 mois à 5 [29]. Des gènes multiples ont joué un rôle central dans la GC métastase: tels que la surexpression du facteur de croissance du récepteur-I (IGF-IR) analogue à l'insuline et l'activation de ses voies de signalisation à la fois jouent un rôle crucial dans le développement et la progression du cancer gastrique. Cognement-down de l'expression Spl par un petit ARN inhibiteur conduit à une diminution IGFIR expression et la croissance atténuée et les métastases des cellules cancéreuses gastriques [30], sinon, IGF1R peut être régulée à la baisse par miR-7 et réduit de manière significative la migration des cellules GC et l'invasion [31]. Adachi a constaté que le blocage de l'IGF-IR est impliqué dans la répression de l'invasion des cellules cancéreuses grâce à une régulation négative de matrilysine [32]. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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