МикроРНК-206 подавляет желудочную рост раковых клеток и metastasis

микроРНК-206 подавляет желудочную рост раковых клеток и метастазирование
Аннотация
рак желудка является одной из ведущих причин смерти от рака во всем мире и несет в себе высокий уровень риска метастазирования. В дополнение к другим белок-кодирующих генов онкогенов и опухолевых супрессоров, микроРНК играют важную роль в возникновении рака желудка онкогенного прогрессии. Здесь показано, что микроРНК-206 выражается в заметно низком уровне в когорте опухолей желудка по сравнению с их соответствующими нормальными тканями, и в ряде желудочных линий раковых клеток. Вниз-регулирования микроРНК-206 был особенно значительным в опухолях с лимфатической метастазирования, местного вторжения, и передовые TNM постановки. Мы считаем, что принудительное выражение микроРНК-206 подавляла пролиферацию, колониестимулирующий образование и ксенотрансплантата туморогенез из SCG-7901 клеток, линию клеток рака желудка. Принудительная экспрессия микроРНК-206 также подавляется SCG-7901 клеточную миграцию и инвазию, а также метастазирование в культуре клеток или хвостовой вены инжектированных моделей мышей, соответственно. Анти-метастатический эффект микроРНК-206, вероятно, опосредуется нацеливание метастаза регуляторных генов STC2, HDAC4, Klf4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, и K-Ras, которые были резко понижающей регуляции стабильной экспрессии экзогенного MIR -206 в SCG-7901 клеток. Взятые вместе, наши результаты указывают на то, что микроРНК-206 представляет собой опухоль супрессор рака желудка, действующего на этапах, которые регулируют метастазирование.
Ключевые слова
Желудочный рак микроРНК-206 Метастазы опухолевый супрессор Введение
Рак желудка (GC) занимает четвертым наиболее распространенным видом рака и второй ведущей причиной рака, связанных смерти во всем мире [1]. Прогноз для пациентов с распространенным раком желудка оставляет желать лучшего, несмотря на недавние улучшения в gastriectomy, химиотерапии, и лучевой терапии [2]. Поскольку GC является полигенна болезнь, возникающая в результате множественных dysregulations генов, выяснение регулирующей сети, регулирующей GC туморогенез является обязательным для разработки новых целевых терапии.
Онкогенеза в желудке является многоэтапный процесс, который влечет за собой генетические и эпигенетические изменения белка -coding а также некодирующие Протоонкогены и гены опухолевых супрессоров. Взаимодействие между хозяином, окружающей среды и бактериальных факторов также влияют на прогрессирование заболевания. Хеликобактерной
(HP) инфекция была создана в качестве одного из основных факторов риска для GC; два гистологических подтипов рака желудка, кишечного и диффузного подтипов, оба связаны с инфекцией HP, что способствует более чем 80% случаев [3], особенно в антральная /тела рака желудка [4]. Механически, был найден HP инфекция вызывает двукратное увеличение EGF и EGFR в антрального отдела желудка биопсии тканей, но ее ликвидация снижает уровни обоих факторов таковым из [5] управления. НР-инфекции у пациентов с хроническим гастритом также в значительной степени связано с понижающей регуляции E-кадгерина вследствие увеличения метилирования промотора [6], в то время как эрадикации НР значительно уменьшило уровни MMP-9, металлопротеиназы положительно связана с опухолевой инвазии и метастазирования [ ,,,0],7], в антральном и согриз слизистой оболочки [8].
Помимо НР-инфекции, существует множество причин, приводящих к аберрантной экспрессии генов при раке желудка, а также механизм желудка ракового метастазирования является очень сложным, а также , Ras-зависимой сигнализации МАРК, что в конечном итоге приводит к увеличению пролиферации при раке желудка и в основном вызвано аберраций активации K-Ras, часто ассоциируется с раком желудка кишечного типа [9]. Stanniocalcin 2 (STC2), секретируемый гликопротеин с важными функциями в кальция и фосфата гомеостаза, как сообщается, выражается в высоких уровнях раковых тканей желудка, узел метастазирования лимфатических и венозных инвазии [10]. Уровень 5-летней выживаемости была значительно ниже у пациентов с выражением STC2 по сравнению с пациентами без экспрессии STC2 [11]. BDNF (Brain происхождения neutrophic фактор) выражение было сообщено, чтобы показать значительно повышенную экспрессию в желудочной ткани рака по сравнению с соседней нормальной слизистой оболочки, а также высокий уровень BDNF на инвазивной фронта были соотнесены с вторжением судна, узел метастаза лимфатический, перитонеального распространения и бедных прогноз у больных раком желудка [12]. Несмотря на прогресс в выявлении вышеуказанных регуляторных генов, точный базовый механизм, вызывающий GC метастаз еще предстоит определить.
Dysregulations микроРНК играют очень важную роль в онкогенеза. Роль микроРНК в желудочном онкогенеза рака были хорошо документированы. Здесь мы ориентируемся на MIR-206, который вместе со своими близкородственных паралогов микроРНК-1, 133а, и микроРНК-133b, играет очень важную роль в мышечной дифференцировки. Эти четыре микроРНК высоко консервативны в последовательности и геномной организации, и называются myomiRs, потому что они были найдены, чтобы быть выражены на высоких уровнях в мышцах [13]. MIR-1-1 /микроРНК-133а-2, микроРНК-1-2 /микроРНК-133а-1, и микроРНК-206 /микроРНК-133B образуют кластеры в трех разных участках хромосом в геноме человека 20q13.33, 18q11.2 и 6p12.2, соответственно. Тем не менее, эти микроРНК могут выступать в качестве супрессоров опухолей в различных злокачественных опухолях человека [14]; например, были найдены микроРНК-1 и микроРНК-133а часто быть понижающей регуляции при раке мочевого пузыря, а также подавляют рост опухоли путем ориентации TAGLN2 [15]. MIR-1 и микроРНК-206 было показано, обладают сходными роли опухолевого супрессора в рабдомиосаркома через блокирование экспрессии с-Met [16]. MIR-206 было также сообщено выступать в качестве опухолевого супрессора при раке молочной железы [17], и рака легких [18]. Мы сообщаем, что экспрессия микроРНК-206 обратно связана с лимфатической метастазирования, местного вторжения, и TNM злокачественности постановки GC, и силу экспрессии микроРНК-206 подавляет рост клеток GC, канцерогенез и метастазирование.
Материалы и методы
образцы тканей
хирургически резецированные рак желудка человека и прилегающих тканей неопухолевые были получены из 35 пациентов, госпитализированных в отделении хирургии желудочно-кишечного тракта, в филиал больницы Нанкин медицинского университета (Чанчжоу Второго народная больница). Проект был одобрен Комитетом по этике исследования Нанкин медицинского университета им, и письменное согласие было получено от каждого пациента, зарегистрированного в данном исследовании. Все образцы ткани обрабатывали для хранения в жидком азоте и H &Amp; е. Окрашивание для патологического анализа
Клеточные линии и в клеточной культуре
желудка человека линии раковых клеток СГК-7901, КУП-823, АГС, незловредный клеток желудка линия ГЭС-1 и HEK293T клетки были приобретены от Cell ресурсный центр, Шанхайский институт биохимии и клеточной биологии, китайской академии наук. Эти клетки выдерживали в термостате влажности при 37 ° С в атмосфере 5% СО <суб> 2 и СГК-7901, КУП-823, и ГЭС-1-клетки культивировали в среде RPMI1640, HEK293T клеток в среде DMEM, и AGS клетки в F12K среда, соответственно. Все культуральные среды были с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков. Экстракции
РНК и количественная ПЦР в реальном времени
Суммарную РНК из желудочных тканей или клеточных линий, извлекали с помощью реагента тризола (Takara) в соответствии с инструкциями изготовителя. кДНК синтезировали с помощью набора реагентов PrimeScript RT (Takara). Количественный ОТ-ПЦР проводили с набором SYBR Премикс Ex Taq (Takara) на 7500 в реальном масштабе времени система PCR (ABI) и анализировали с использованием программного обеспечения для анализа пакета SDS (версия 2.0.1, Applied Biosystems). ПЦР-праймеры были получены от Invitrogen, и реакция была 95 ° С, 10 мин, затем 40 циклов при 95 ° C 15 секунд и при 60 ° С, 1 мин. U6 мяРНК был использован в качестве внутреннего контроля. Результаты были представлены в виде кратности изменения, рассчитывается с использованием 2 -.
△ методом КТ, и соотношение экспрессии в опухолях относительно нормальных тканей менее 1,0 считалась низкая векторных конструкций
Pri -miR-206, амплифицировали из нормальной человеческой геномной ДНК с помощью ПЦР с использованием праймеров: 206-Для 5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGATGCGGGCTGCTTCTGGA-3 'и 206-Rev 5'-AGCTTTGTTTAAACCCTTGGTGAGGGAGTCATTTGC-3'. ПЦР-фрагмент был вставлен в вектор MSCV-P2GM для генерации P2GM-MIR-206. Пустой вектор P2GM был использован в качестве контроля.
Трансфекции клеток
плазмидной трансфекции СГК-7901 клеток проводили с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen), и стабильные клоны, несущие P2GM-MIR-206 или пустой вектор были выбраны для пуромицин сопротивления (10 мкг /мл). MIR-206, так и отрицательные подражает контроля были получены из Ribobio (Гуанчжоу, Китай) и трансфекции мимику в SGC-7901 клеток проводили с использованием Oligofectamine (Invitrogen). Вкратце, SGC-7901 клетки высевают на 1 день раньше трансфицировали 100 нм микроРНК-206 или контрольных мимики при достижении 50% слияния. Через 48 ч клетки были обработаны для дальнейшего анализа.
Сотовый анализ пролиферации
МТТ был использован для оценки пролиферативной скорости СГК-7901 клеток. В кратком изложении, СГК-7901 клетки трипсинизировали через 2 дня после трансфекции и пересевают при 2,5 × 10 3 клеток на лунку в 96-луночные планшеты. МТТ (3- (4, 5-диметилтиазол-2-ил) -2, 5-дифенил-tetrazoliumbromide) добавляли к культуральной среде через определенные интервалы времени для хх часов, и оптическую плотность при 490 нм измеряли с помощью спектрофотометра. Каждый анализ проводили в трех повторах и повторяли три раза независимо.
Анализ образования колоний
Стабильные SCG-7901 клеток, несущих микроРНК-206 или пустой контроль трипсином и пересевали на 1 × 10 3 на лунку в 6 -Ну пластины. Через 14 дней в культуре в RPMI 1640, дополненной 10% FBS, колонии фиксировали 3,7% метанола и окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым. Колонии, содержащие по крайней мере, 50 клеток были забиты. Каждый анализ проводили в трех повторностях.
Проточной цитометрии
SGC 7901-клеток, трансфецированных с микроРНК-206 имитируют или отрицательного контроля трипсином и повторно суспендируют в 1 × буфере для связывания на 1 × 10 6 клеток /мл. 100 мкл этой суспензии клеток инкубировали с 5 мкл FITC-аннексина V и 5 мкл propridium йодида (PI) в течение 15 минут в темноте. Реакцию останавливали добавлением 400 мкл 1 × буфера для связывания и анализировали с (FACSCalibur использованием CellQuest программного обеспечения (Becton Dickinson). FITC-аннексина V-положительные, так и PI-негативных клеток считались апоптическая и опыты были проведены в трехкратном повторе.
миграция и инвазия анализы
заживлении ран миграцию клеток оценивали путем измерения перемещения клеток в бесклеточной области, созданной путем соскоба газона сливающийся клеток с 200 мкл кончика пипетки. замыкание рана была сфотографирована 48 час спустя под микроскопом. для Transwell миграции анализов, 5 × 10 4 клеток добавляли в верхнюю камеру вставки (BD Science, Sparks, MD, США), в то время как 1 × 10 5 клеток были использованы для Матригель инвазия анализы. в этих экспериментах клетки обрабатывали трипсином и ресуспендировали в среде без сыворотки, прежде чем засевают в верхнюю камеру. полная культуральную среду, содержащую 10% FBS, добавляли в нижнюю камеру. Клетки инкубировали в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 24 ч. Клетки на мембране фиксировали, окрашивали и подсчитывали. Каждый эксперимент проводили в трех повторах.
Модель опухоли ксенотрансплантата
Молодые женщины бестимусных голых мышей (6 недель) были приобретены у животной модели исследовательского центра Nanjing университета. Приблизительно 1,5 × 10 6 стабильных SGC-7901 клетки, несущие P2GM-MIR-206 или пустой вектор вводили подкожно в нижнюю часть флангах 5 голых мышей. Объемы опухолей измеряли каждые 3 дня с шестого дня после инъекции и далее в течение 24 дней до того, как животные были умерщвлены. Окончательный объем и вес были измерены после того, как опухоли были расчленены. Голые мыши были подтасованы и уход в соответствии с NIH по уходу и использованию животных комитета руководящих принципов в эксперименте на животных Центра Нанкин медицинского университета (Нанкин, провинция Цзянсу, провинция, PR Китай).
Статистический анализ
Статистический анализ проводился с использованием пакет программного обеспечения SPSS (SPSS Стандартная версия 16.0, SPSS Inc.). Данные представлены как средние значения ± SEM. Спаренные-образцы т
-test был использован при анализе дифференциальной микроРНК-206 экспрессии между опухолью и нормальными тканями. Ибо в пробирке и в естественных условиях экспериментов, независимых образцов т
-test использовали для оценки значимости различий между группами лечения и контроля. Значение P &л; 0,05 рассматривалось как статистически значимое.
Результаты
понижающую регуляцию MIR-206 коррелирует с желудка человека онкогенеза рака, инвазию и метастазирование
в широком обследовании генома для экспрессии микроРНК, ранее мы определили несколько членов семья myomiR, а именно микроРНК-1 /133а и микроРНК-133b /206, уровни которых были сокращены в neuroectodermic рака (неопубликованные результаты). Эти микроРНК были в основном известны, чтобы функционировать в миогенной дифференцировки и, в меньшей степени, онкогенеза педиатрических видов рака. Для того, чтобы исследовать, если эти myomiRs также могут играть определенную роль в tumorigensis распространенных видов рака у взрослых, мы исследовали их уровни экспрессии с помощью в режиме реального времени стволовых петля RT PCR квантификации в когорте свеже резекции опухоли желудка и их соответствие нормальных тканей, и обнаружили, что средний коэффициент микроРНК-206 по отношению к U6 мяРНК из 35 опухолей был в 4 раза ниже, чем у нормальных тканей (Фигура 1А). Парного сравнения показали, что более 85% опухолей показал больше, чем 2-кратное снижение экспрессии микроРНК-206 по сравнению с их контролем соответствия, только с двумя парами, показывающие увеличение (рис 1B). Выражение MIR-206 также уменьшалось в ряде желудочных линий раковых клеток человека, в том числе СГК-7901, BGC-823, MGC-803 и AGS клеток, по сравнению с, что в ГЭС-1 нормальных клетках желудка (рис 1C). Клинико-патологическими записи этих опухолей показали, что снижение экспрессии микроРНК-206 был в значительной степени связано с лимфатической метастазирования, местного вторжения, и TNM злокачественности стадирования, но не с возрастом, полом, размер опухоли или местоположения (таблица 1). Эти данные указывают на то, что микроРНК-206 обычно может оказывать тормозящее контроль над желудочной онкогенеза, инвазию и метастазирование. Рисунок 1 Снижение уровня экспрессии микроРНК-206 в желудочном раковых тканях и клеточных линиях. (A) Распределение экспрессии микроРНК-206 в когорте 35 человека GC и нераковых тканей с помощью QRT-PCR. Эндогенный U6 РНК используют в качестве внутреннего контроля. (B) парного сравнения экспрессии микроРНК-206 между GC и соответствующих нераковых тканей, показывающих экспрессию микроРНК-206 была снижена в 86% (30/35) пар образцов. (C) Относительная экспрессия микроРНК-206 в четырех ГХ клеточных линий и нормальной желудочной клеточной линии (ГЭС-1).
Таблица 1 клиникопатологическими характеристики микроРНК-206
Категории

НЕТ. больных

Относительные уровни микроРНК-206 (среднее ± SEM) завод
P-значение

Гендер
Мужской
21
0,49 ± 0,07
0,32
Женский
14
0,40 ± 0,06
Возраст (лет)
≥60
19
0,45 ± 0,05 0,93

&л; 60
16
0,46 ± 0,09
Диаметр (см)
≥5
13
0,46 ± 0,09 0,90

&л; 5
22
0,45 ± 0.05
Локация
Средний и проксимальной трети
23
0,47 ± 0,06 0,65

дистальной трети
12
0,42 ± 0,07
Степень дифференциации
ну и умеренно
12
0,48 ± 0,07 0,70

Плохо
23
0,44 ± 0,07
локальной инвазии
T1 + T2
10
0,65 ± 0,07 0,01

T3 + T4
узла метастазирование 25
0,37 ± 0,05

NO лимфатических
14
0,57 ± 0,06 0,04

YES
21
0,38 ± 0,07
TNM стадии
I + II
12
0,60 ± 0,07 0,02

III + IV
23
0,38 ± было также установлено, 0.06
выражение MIR-133а быть понижающей регуляции в опухолях по указанным выше критериям (дополнительный файл 1: Рисунок S1), но экспрессия MIR-1, чьи гены группируются с теми кодирования MIR-133а [14], не было (Дополнительный файл 2: Рисунок S2). Так как микроРНК-206 кодируется уникальным геном, он был выбран для дальнейшего анализа.
MIR-206 ингибирует желудочную
роста раковых клеток, чтобы определить, является ли микроРНК-206 имеет склонность подавлять желудка туморогенез рака, мы ввели синтетические двухцепочечные микроРНК-206 подражает, 206mi, чтобы изменить уровень общего MIR-206 в SGC-7901 рака желудка клетки, которые выражают низкий уровень микроРНК-206 по отношению к массе GSE 1-нормальных контрольных клеток (рис 1C) , и контролировать скорость роста клеток, используя тетразолиевый краситель, 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил-тетразолия бромид (МТТ). Стебель контур ПЦР подтвердил повышенный уровень микроРНК-206 в трансфицированных SGC-7901 клеток (рис 2А), а также результаты анализа МТТ показали, что скорость роста этих клеток была снижена заметно по сравнению с клетками, получающих не- специфические подражает управления, микроРНК-Упр, в течение 5-дневного периода (рис 2В). Мы также генерироваться предварительно микроРНК-206, экспрессирующей плазмиды в векторе P2GM, и флуоресценцию активированные клеточно сортировки (FACS) анализ показал, что пролонгированное G1-фазы и сокращенную S-фазы в P2GM-206 (Р206) трансфи- по сравнению с вектор P2GM трансфицировали SGC-7901-клетки (рис 2в), таким образом, подтверждающей результат из приведенного выше 206mi мимической эксперимента. Искусственное увеличение общего уровня MIR-206 с 206 миль также привело к значительному увеличению апоптоза в 48 часов в SGC-7901 клетках над мимикой контрольных трансфицированных клеток, как определено методом проточной цитометрии анализа PI и аннексина V двойного поглощения (рис 2D и Е). Эти данные указывают на то, что микроРНК-206 является мощным антипролиферативным регулятором культивируемых клеток рака желудка. Рисунок 2 Принудительная экспрессия микроРНК-206 подавляет пролиферацию SGC-7901 рака желудка клетки. (A) Всего уровней микроРНК-206 в SGC-7901 клетках, трансфицированных микроРНК-Ctrl или синтетических имитаторов СИК-206, 206mi (*** Р &л; 0,0001). (B) MTT анализы для SGC 7901-клеток, трансфецированных с микроРНК-206 мимике при конечной концентрации 100 нМ. Начиная с 24 ч после трансфекции анализы считывали через каждые 24 ч в течение 5 дней подряд. Результаты выражены в виде средних значений ± SEM из трех независимых экспериментов. (*** Р &л; 0,0001). (C) Гистограмма, изображающий распределение клеточного цикла SGC-7901 клеток транзиторно трансфицированных P2GM-микроРНК-206 или P2GM-CTRl (100 нм). Результаты представляют собой средние значения ± SEM трех независимых экспериментов (* P &ЛТ; 0,05). (D), были рассмотрены клетки окрашивающие положительными для аннексина V-FITC и отрицательным для PI в 48 ч после трансфекции, подвергшиеся апоптозу. (Е) Средняя скорость апоптическая трех независимых экспериментов ± SEM показаны (*** Р &л; 0,0001).
MIR-206 ингибирует желудочную образование роста раковых клеток и опухолей ксенотрансплантата креплении-зависимой
для изучения на долгий срок влияние MIR-206 на рост клеток и образование колоний, мы получили стабильную линию SGC-7901 клеток, P2GM-MIR-206, который выражает MIR-206 от конститутивно активного вектора, MSCV-P2GM и линию пустого вектора -проведение клетки, P2GM-miRctrl. Во-первых, мы исследовали уровень экспрессии микроРНК-206 в этих двух стабильных клеточных линиях, и обнаружили, что микроРНК-206 был значительно повышен в P2GM-микроРНК-206 стабильной клеточной линии (фиг.3А). Затем мы проанализировали влияние микроРНК-206 на якорной-зависимый рост по скудно ПОСЕВНОЙ трипсином клетки непосредственно на чашку Петри и визуализировать колонии клеток путем окрашивания кристаллическим фиолетовым следующие 14 дней культивирования. Результаты показали, что вектор-несущий контрольные стабильные клетки образуются значительно больше колоний, чем микроРНК-206-экспрессирующих клеток (фигура 3В и С). Кроме того, мы вводили эти стабильные клетки подкожно в два двусторонних нижних спины голых мышей, и контролировать рост опухоли ежедневно. Через двадцать четыре дня после инъекции, эти мыши были умерщвлены и опухоли вырезали и взвешивали (рис 3D и Е). Результаты показали, что средние объемы микроРНК-206 сверхэкспрессией опухоли росли гораздо более медленными темпами, чем контрольные опухоли и средней конечной массы было значительно меньше, чем у контрольной группы (рис 3F и G). Рисунок 3 MIR-206 подавляет рост клеток GC креплении-зависимой и образование ксенотрансплантата опухоли. (A) Уровень экспрессии микроРНК-206 в P2GM-микроРНК-206 стабильной клеточной линии и контрольных клеток стабильных векторных несущих (*** Р &л; 0,0001). (Б) одна тысяча стабильных СГК-7901 клетки микроРНК-206 и отрицательный контроль высевали на чашки с 6-луночные планшеты и анализ образования колоний проводят. Представитель результаты формирования колоний P2GM-MIR-контроль, P2GM-MIR-206. (C) Число колоний подсчитывали на 14-й день после посева. Стабильные SGC-7901 клетки MIR-206 вырос до более низкой плотности по сравнению с ЧПУ. Результаты представляют собой средние значения ± SEM трех независимых экспериментов (** P < 0,01). (D) SGC-7901 клетки со стабильной экспрессии микроРНК-206 или не были привиты подкожно в оба бока голых мышей (n = 5 на группу). Представительные фотографии голых мышей через 24 дня после инокуляции показаны. (Е) мышей забивали и опухоли взвешивали через 24 дня после инокуляции, ксенотрансплантаты с микроРНК-206 повышенной экспрессией были значительно меньше, чем на ксенотрансплантаты управления. (F) показывает кривую роста опухоли (* P &лт; 0,05 и ** P &л; 0,01). (G) Опухоли из каждой группы взвешивали сразу после удаления. Средний вес опухоли обозначается как средние значения ± SEM (* P &лт; 0,05).
MIR-206 ингибирует желудочную инвазии раковых клеток и миграцию
Снижение экспрессии микроРНК-206 в локально инвазивными и метастатических опухолей (таблица 1) предполагает, что эта микроРНК может регулировать процесс миграции клеток. Для того, чтобы определить, если это действительно так, то мы провели ранозаживляющим и Transwell анализы миграции с использованием микроРНК-206-выражающие устойчивые SGC-7901 клетки. Результаты показали, что эктопическая избыточная экспрессия микроРНК-206 вызвало подавление миграции клеток в SGC-7901 клеток как видно в ранозаживляющего анализа (рис 4A и B) и анализа миграции Transwell клеток (рис 4C и D). Внематочная избыточная экспрессия микроРНК-206 дополнительно тормозится вторжение SGC-7901 клеток, как показано вторжением анализа Матригель (рис 4E и F). Следовательно, микроРНК-206 отображается угнетающее свойство в миграции раковых клеток и инвазионных анализов в лабораторных условиях. Рисунок 4 MIR-206 подавляет GC клеточную миграцию и инвазию в лабораторных условиях. (A) ранозаживляющие Анализ показал различные клеточные в данные подвижности MIR-контроля, микроРНК-206 клеток. Эктопическая экспрессия микроРНК-206, очевидно, ингибирует миграцию SGC-7901 клеток. (В) показывает статистические результаты. Данные представляют собой средние значения ± SEM из трех независимых экспериментов. (** Р &л; 0,01). Избыточная экспрессия микроРНК-206 значительно затрудняло возможностей миграции клеток (С) и инвазии (E) в MIR-206, экспрессирующих стабильные СГК-7901 клеток по сравнению с отрицательным контролем. (D, F) показывает статистические результаты соответственно. Данные представляют собой средние значения ± SEM из трех независимых экспериментов. (** P &л; 0,01, *** Р &л; 0,0001).
MIR-206 ингибирует метастаз в печени GC в естественных условиях
Для изучения влияния MIR-206 на метастаз в естественных условиях, мы провели хвост -vein инъекция P2GM-MIR-206 и одна векторных P2GM клеток с голым мышам, через 42 дня после инъекции, мы собирали и фотографировали печень (рис 5A, верхние панели). H &Amp; E окрашивание срезов тканей показано 7 раз меньшее количество метастатических опухолевых узелков на единицу площади в печенках, инъецированных клетками P2GM-микроРНК-206, чем те, вводили контрольными клетками P2GM (рис 5A, нижние панели и B). Кроме того, размеры опухолевых узелков на сотовом впрыскивается печенью P2GM-микроРНК-206 были намного меньше, чем у контрольной группы (рис 5А). Этот результат сильно утверждает, что микроРНК-206, как правило, могут иметь супрессор опухолей роль предотвращающий метастазированию клеток рака желудка. Рисунок 5 MIR-206 ингибирует метастаз в печени GC в естественных условиях. (A) Характерные макроскопические картины печени мышей, 42 дней после прививки (верхняя). Типичные фотографии H &Amp; E окрашивали спонтанные метастазы в печени. Увеличение: 10 × (нижняя). Результаты показывают, что опухолевые узелки в группе P2GM-микроРНК-206 были меньше и меньше, по сравнению с контрольной группой. (B) Число печени метастатическим локусов подсчитывали и сравнивали мышей с SGC-7901 контрольные клетки вектора и SGC-7901 клетки, экспрессирующие MIR-206. Данные представляют собой средние значения ± SEM, (*** Р &л; 0,0001). (C) относительный уровень мРНК предполагаемых мишеней микроРНК-206 между SGC-7901-MIR-P2GM и SGC-7901-микроРНК-206 клеток. (D) Относительный уровень мРНК предполагаемых мишеней микроРНК-206 между ГЭС-1 и SGC-7901 клеточных линий.
Чтобы определить механизм, с помощью которого микроРНК-206 проявляет свою антиметастатическую роль, мы искали возможно зер- 206 генов-мишеней, используя комбинацию инструментов онлайн целевой микроРНК приобретения, а также перекрестные ссылки полученных кандидатов на те, которые были зарегистрированы, чтобы играть роль в метастазировании. В пуле 20 таких генов, мы обнаружили, 9 из них (Дополнительный файл 3: Таблица S1), а именно STC2, HDAC4, KLF4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF, и K-Ras, были резко вниз регулируется от MIR-206 в P2GM-микроРНК-206 устойчивых клеток по сравнению с их соответствующих уровней в P2GM векторных устойчивых клеток (рис 5в). Некоторые из этих генов-мишеней микроРНК-206 были заметно повышающей регуляции в родительских SCG-7901 опухолевых клеток GC по сравнению с нормальными желудочных ГЭС-1 клеток (рис 5D), что указывает на вероятное причинное событие. Таким образом, микроРНК-206, вероятно, ингибирует метастазирование опухолевых клеток GC через сеть регуляторных генов.
Обсуждение
Хотя дисрегуляция микроРНК сообщалось в различных типах злокачественных опухолей человека [19], аномальным выражения и потенциальной роли микроРНК в рака желудка были изучено недостаточно. Здесь мы покажем, что микроРНК-206 часто подавляются в рака желудка человека и линий раковых клеток. В свете приведенного выражения микроРНК-206, сообщалось в нескольких типах опухолей, наши результаты свидетельствуют о том, что снижение экспрессии микроРНК-206, вероятно, является необходимым условием событие онкогенеза. Это требование было сделано еще более актуальной, когда мы обнаружили, что низкие уровни микроРНК-206 были связаны с лимфатической метастазирования, местного вторжения, и стадии TNM. Это понятие было подтверждено результатами эктопической экспрессии микроРНК-206 в клеточной линии рака GC SCG-7901, которые показали, что микроРНК-206 репрессирован пролиферацию GC клеток, образование колоний, вторжение, и миграцию. И, наконец, способность MIR-206, чтобы подавить метастазирование SCG-7901 клеток в печень при условии четкого объяснения для корреляции между низкими уровнями микроРНК-206 и инвазивных и метастатических видов рака желудка. Недавно STC2 был идентифицирован как прогностического маркера для метастазов в лимфатических узлах в пищеводе плоскоклеточный рак [20]. Выражение TrkB и BDNF ассоциируется с плохим прогнозом у пациентов с немелкоклеточным раком легких [21]. Некоторые исследования показали, что экспрессия IGF1R повышается при метастатическим раком простаты и прогрессии сопротивления гормона [22, 23]. Выражение BCL2 в первичном раке простаты является маркером плохого прогноза, с повышенным риском рецидива [24]. Сказанное предполагает общую онкогенного роль в развитии рака человека. Далее мы определили STC2, HDAC4, Klf4, IGF1R, FRS2, SFRP1, BCL2, BDNF и K-Ras в качестве предполагаемых функциональных целей микроРНК-206, так как часть из них говорили выше. Взятые вместе, наши данные свидетельствуют о подавителя опухоли роль микроРНК-206 в развитии рака желудка человека
Доказательства микроРНК-206 в качестве супрессора роста опухоли сообщалось в нескольких видов рака:. МикроРНК-206 был впервые обнаружен быть подавлена ​​в ERalpha -положительные ткани человека с раком молочной железы и введение MIR-206 в эстроген-зависимых MCF-7 клеток рака молочной железы ингибирует рост клеток в дозы и времени зависимым образом [25]. Кроме того, микроРНК-206 может способствовать росту миогенной дифференцировки и блокировать опухоли у мышей ксенотрансплантированной downregulating продукт МЕТ протоонкогена: Met тирозинкиназы рецептора [26]. Ян также обнаружили, что ингибирование микроРНК-206 функций может способствовать пролиферации аберрантных и миграции клеток, что приводит к развитию рабдомиосаркомы путем подавления C-Met [16]. В то же время микроРНК-206 может быть использован для ингибирования миграции клеток HeLa и сосредоточиться образование путем ингибирования белка как Notch3 и мРНК [27]. Кроме того, микроРНК-206 был подавляются в высокой метастазирования рака легких по сравнению с низкими опухолей и метастаз нормальных тканей легких, избыточная экспрессия микроРНК-206 заторможенной миграции и инвазии клеток рака легких [18]. MIR-206 экспрессия уменьшается в эстроген рецептор-альфа (ERα) -положительным эндометриальная эндометриоидной аденокарциномы (ЕЭС) и его избыточная экспрессия ингибирует ERα-зависимую пролиферацию, нарушенную инвазивность и индуцированный клеточного цикла арест ERα-позитивных ЕЕС клеточных линий [28]. Все эти данные показали, что микроРНК-206 может играть роль супрессор опухолей в различных видов рака.
Метастазы способствует большинство смертельных случаев, связанных с раком. GC занимает второе место среди причин рака, связанных смерти во всем мире, потому что его высокий уровень метастазирования, в том числе лимфатических узлов, брюшины, печени и т.д. Особенно 5-летняя выживаемость желудка опухоль с метастазами в печени не превышает 10%, а медиана выживаемости без какого-либо лечения составляет приблизительно от 3 до 5 месяцев [29]. Несколько генов играют ключевую роль в GC метастазирования: такие, как избыточная экспрессия инсулиноподобного фактора роста рецептора-I (IGF-IR) и активация его сигнальных путей и играют важную роль в развитии и прогрессии рака желудка. Стук-вниз Spl экспрессии малыми ингибиторной РНК привело к снижению IGFIR экспрессии и ослабленный рост и метастазирование клеток рака желудка [30], в противном случае IGF1R может быть подавлена ​​с помощью микроРНК-7 и значительно сократить миграцию GC клеток и вторжения [31]. Адачи обнаружили, что блокада ИФР-IR участвует в подавлении инвазии раковых клеток с помощью понижающей регуляции матрилизина [32]. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Белок эндотелиальной липазы является перспективным недержание биомаркеров для диагностики рака желудка
• Значение подсадной рецептора 3 (Dcr3) и внешнего сигнала регулируется киназы 1/2 (ERK1 /2) при раке желудка