L'induction de l'instabilité chromosomique et cancer de l'estomac en modifiant le profil d'expression des gènes de point de contrôle mitotique chez les souris exposées à noix d'arec

L'induction de l'instabilité chromosomique et cancer de l'estomac en modifiant le profil d'expression des gènes de point de contrôle mitotique chez les souris exposées à noix d'arec
Résumé de l'arrière-plan
Il y a de fortes indications pour une association causale entre la consommation noix d'arec et les cancers. Dans Meghalaya, en Inde, la variété de noix d'arec est utilisé comme forme brute et non transformés, dont la composition et les actions pharmacologiques chimiques ont été rapportés. Pourtant, nous savons peu de choses sur le chemin initial impliqué dans noix d'arec carcinogenèse associé, car il est difficile d'évaluer ses effets sur les altérations génétiques sans interférence d'autres facteurs aggravants. Par conséquent, cette étude a été réalisée chez la souris afin de vérifier la capacité des premières noix d'arec (RAN) pour induire le cancer et pour surveiller l'expression de certains gènes impliqués dans la carcinogenèse. Cette étude ne visait pas à isoler les principes actifs de la RAN et de regarder son action.
Méthodes
Trois groupes de souris (n = 25 chacun) ont été prises et utilisées à différents points de temps pour l'analyse expérimentale différente . Les trois autres groupes de souris (n = 15 chacun) ont été envisagées pour des études d'induction tumorale. Dans chaque série, deux groupes ont été administrés RAN-extrait ad libitum
dans l'eau potable avec ou sans chaux. L'expression de certains gènes classiques a été évaluée par RT-PCR et immunotransfert. Les souris ont reçu l'ensemble RAN-extrait avec et sans chaux afin d'imiter le style de RAN de la consommation humaine.
Résultats
préparation histologique des tissus de l'estomac a révélé que RAN induit le cancer de l'estomac. Une augmentation progressive de la fréquence des cellules aneuploïdes anaphase et précoce a été observée dans les cellules de la moelle osseuse avec un plus grand incrément suivant RAN + administeration de chaux. Les niveaux de p53, Bax, Securin
et p65
dans les cellules de l'œsophage et de l'estomac ont été élevées au cours des premiers jours d'exposition RAN tandis que celles des différentes protéines mitotique de point de contrôle ont été downregulated. La mort cellulaire apoptotique a été détectée dans les cellules de l'estomac non cancéreuses mais pas dans les cellules tumorales qui ont montré une surexpression de Bax
et l'absence de PARP
.
Conclusion
Présente étude a suggéré (a) RAN induit le cancer de l'estomac, cependant, la présence de chaux promu plus la transformation cellulaire et le cancer ainsi développé plus tôt, (b) des perturbations dans les composants de la machine chromosome de ségrégation pourraient être impliqués dans le processus initial de cancérogénicité et (c) l'importance de l'anaphase précoce comme un marqueur de dépistage pour l'identification des défauts de point de contrôle mitotique durant premiers jours.
Mots-clés
chromosome instabilité mitotique checkpoint gènes apoptose le Contexte de Securin
carcinome épidermoïde oesophagien (ESCC) et les cancers gastriques sont les cancers les plus fréquents en Inde, avec le plus haut incidence de la ESCC étant dans les Etats du nord-est de l'Inde [1]. Il y a de fortes indications pour une association causale entre noix d'arec ou les habitudes de mastication et quid de ces cancers. Plusieurs études chez différentes espèces animales ont montré l'induction positive de tumeurs dans les deux cibles (joue-poche, de l'œsophage et de l'estomac) et non-cible des tissus (poumons et le foie) lorsque arécoline (ARC) ou noix d'arec extrait a été administré par différents moyens tels intubation orale [2], mélangé avec le régime alimentaire [3], et l'application joue-poche [4]. Par conséquent, il semble que l'activation métabolique des alcaloïdes est nécessaire pour la conversion finale dans les cancérogènes ultimes, qui est fortement influencée par les conditions physiologiques et la présence de certains facteurs [5]. Des rapports ont indiqué la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) à partir d'ingrédients arec-noix dans des conditions alcalines [6, 7]. En raison de la présence de chaux dans la préparation de bétel-quid, la salive de mâcheurs arec de noix change typiquement de neutre à une condition alcaline qui pourrait être idéal pour générer des ROS [7]. Nair et al. [6] ont également noté que, outre l'ARC, l'auto-oxydation des polyphénols arec-noix pourrait générer H 2O 2 et les radicaux superoxydes à pH alcalin.
Dans l'Etat de Meghalaya, en Inde, la variété des noix d'arec, appelé localement «kwai», est utilisé comme forme brute unripe et non transformés qui a des teneurs plus élevées de alcaloïdes, les polyphénols et les tanins par rapport à la forme séchée [8]. Le bétel-quid utilisé dans Meghalaya contient noix d'arec brut (RAN), la pâte de chaux et petite portion de bétel feuille sans tabac et d'autres constituants. Ici, les gens avalent tout quid après la mastication au lieu de cracher ce qui pourrait être un facteur important pour ESCC et cancer de l'estomac. Récemment, 40% des échantillons de cancer oesophagien recueillies auprès de patients d'Etat Meghalaya ayant seulement l'habitude RAN-gum ont montré la suppression de la marqueurs microsatellites D9S1748 et D9S1749, situé à proximité de l'exon 1β du gène de CDKN2A /ARF à 9p21. Le hyperméthylation de promoteur du gène CDKN2A de était significativement plus élevée dans les échantillons avec l'habitude de RAN-gum seul que ceux qui ont l'habitude d'utilisation à la fois RAN et le tabac [9]. Jusqu'à présent, nous ne savons pas grand-chose sur la voie initiale consiste à bétel carcinogenèse associé dans l'œsophage et de l'estomac. Il est également difficile d'évaluer les effets de purement et altérations génétiques principalement noix d'arec induite chez l'homme sans interférence par d'autres facteurs aggravants comme la mastication de tabac ou de fumer, la consommation d'alcool, divers types d'aliments non-végétariens, etc. De plus, la présence de la chaux fait une condition alcaline qui est pas idéal pour vitro
culture dans des cellules et donc l'effet de noix d'arec ne peuvent pas être testés dans des systèmes de culture cellulaire. Compte tenu de cela, la présente étude a été réalisée chez des souris pour vérifier la capacité du réseau RAN extrait avec ou sans addition de chaux, afin de provoquer le cancer et d'évaluer simultanément le motif d'expression de certains gènes qui jouent un rôle important dans le processus initial de la cancérogenèse.
La composition chimique et les actions pharmacologiques de noix d'arec ont été signalés et examinés par plusieurs travailleurs [10, 11]. Plusieurs études animales ont confirmé que les produits noix d'arec et nitrosamines spécifiques de bétel, ont la capacité d'induire des changements néoplasiques chez les animaux de laboratoire [11]. Des preuves considérables suggèrent que noix d'arec-alcaloïdes, principalement arécoline (ARC) sont les principaux facteurs de BN-toxicité [11]. Il a été montré que l'ARC peut induire des dommages de l'ADN dans les cellules osseuses de la souris de la moelle [12] et les dommages de l'ADN peut être réduite lorsque l'ARC est administré avec la N-acétyl-L-cystéine [13]. Par conséquent, il convient de mentionner que la présente étude ne visait pas à isoler les principes actifs de la RAN et de regarder son action. Le but de l'étude était d'identifier la voie initiale impliquée dans RAN associé cancérogenèse chez la souris, et donc les souris ont reçu l'ensemble RAN-extrait avec et sans chaux afin d'imiter l'habitude de consommation de l'homme.
Plusieurs gènes, comme p53 , p65, Securin
et bien d'autres, sont connus pour être habituellement surexprimé lors de la carcinogenèse [14-16]. Par ailleurs, l'instabilité génétique est également associée à une instabilité chromosomique (CIN), ce qui conduit à une aneuploïdie, une caractéristique du cancer. Un tel aneuploïdie peut faciliter la tumorigenèse par la perte de la fonction du gène suppresseur de tumeur. Il a été observé que la perte partielle du contrôle du point de contrôle mitotique conduit à une CIN dans les cellules cancéreuses humaines [17, 18]. Par conséquent, dans la présente étude, nous avons évalué le profil d'expression de p53, p65, Securin
et plusieurs gènes de point de contrôle mitotique et d'assemblage de broche à différents points de temps. Méthodes
Préparation de Nous avons observé que RAN peut provoquer le cancer de l'estomac en perturbant les composants de la machinerie chromosome de ségrégation. D'extraits
Après décorticage les couches fibreuses de noix d'arec brut et unripe non transformés (RAN), 100 g du RAN ont été broyés et mis en suspension dans 125 ml d'eau distillée et on mélange soigneusement pour obtenir une pâte lisse pour la préparation d'un extrait aqueux de RAN. Au bout de 24 h, la pâte a été agité pendant 3 h à 37 ° C et on l'extrait aqueux a été recueilli par centrifugation. Cette procédure d'extraction a été répétée une fois de plus en ajoutant 125 ml d'eau au résidu. Les deux extraits ont été rassemblés, ce qui représente 100 g de RAN dans 250 ml d'eau distillée, filtré et congelé à - 80 ° C. Le filtrat a été lyophilisé dans un lyophilisateur Secfroid Lyolab BII (Danemark). La masse lyophilisée a été maintenu à 4 ° C jusqu'à utilisation. L'extrait contenait 0,9 g /100 g de matière extractible à l'eau
. Animaux d'entretien et de traitement
souris suisses albinos (25-30 g), 2-3 mois ont été maintenus dans le laboratoire dans des cages communautaires dans une chambre avec température contrôlée (20 ± 2 ° C) et un éclairage contrôlé (12 h de lumière, 12 heures d'obscurité). alimentation standard de la souris (NMC Oil Mills Ltd., Pune, Inde) et de l'eau ad libitum
ont été utilisés dans toutes les expériences. Les expériences ont été menées conformément aux directives institutionnelles et approuvées par nos «normes institutionnelles pour le soin des animaux et l'utilisation" Board.
Dans Set-1, trois groupes de souris (n = 25 chacun) ont été prises qui ont été utilisés à différentes points de temps pour l'analyse expérimentale différente. Fixer-2, trois groupes de souris (n = 15 chacun) ont été examinés pour des études d'induction tumorale. La figure 1 donne un aperçu schématique sur le protocole expérimental global qui a été pris en compte dans cette étude. Dans chaque ensemble, un groupe a été traité avec de l'eau simple boisson considérée comme non traitée alors que deux groupes ont été administrés RAN extraire ad libitum
dans l'eau potable avec ou sans chaux (pH 9,8). On a estimé que chaque souris a consommé 1 mg d'extrait par jour. Cette administeration orale a été poursuivie pendant 60 jours, après quoi la dose a été augmentée de 1 mg à 2 mg par jour jusqu'à 120 jours. De même, tous les 60 jours plus tard, la dose a été augmentée de 1 mg consommation par jour. Figure 1 Schéma du modèle expérimental pour l'analyse des premières noix d'arec médiée Carcinogenesis chez la souris. arec noix brutes RANDOM; jours d-.
Préparation de métaphases et la notation des aberrations chromosomiques
Pour la préparation de la métaphase, les cellules de la moelle osseuse (BMC) ont été recueillies à partir de deux souris par point de non traitées, 15 et 30 jours de groupe traité et trois souris par point pour le reste. Dans les groupes traités, BMC ont été prélevés après 15, 30, 60, 120 et 180 jours de traitement. BMC ont également été recueillies à partir des deux souris ayant une tumeur de l'estomac. BMC ont été recueillies après 2 h de traitement à la colchicine (15 mg /kg). Les animaux ont été tués par dislocation cervicale. Les fémurs ont été disséqués et BMC ont été vidées en injectant 2 ml de KCl 0,075 M préchauffée à 37 ° C. Les cellules ont été traitées dans une solution hypotonique pendant 15 min et fixées dans de l'acide acétique et de methanol (1: 3). Les lames ont été préparés par la méthode de séchage à la flamme, teinté dans 5% de Giemsa pendant 5 min et monté dans un milieu synthétique. Images des écarts de métaphase ont été prises sous Zeiss Axioskop microscope (Allemagne).
Pour l'étude des chromosomes, les lames ont été codées au hasard et au moins 100 plaques de métaphase bien réparties ont été sélectionnés pour l'étude de chaque souris. Nous avons effectué des comptages chromosomiques sur métaphase propagation. aberrations chromosomiques ont été marqués comme les pauses isochromatides et cassures de chromatides. Voir Procédures expérimentales étendues pour plus de détails dans le fichier 1 supplémentaires:. Information supplémentaire
immunoempreinte de Cellules de moelle osseuse, de l'œsophage (en grattant la couche interne) et de l'estomac (en grattant partie intérieure) ont été lavées deux fois avec du PBS (phosphate une solution saline tamponnée) et ont été lysées dans un tampon de radioimmuno-précipitation (0,1% de SDS, 2 mM d'EDTA, 1% de NP-40, le désoxycholate de sodium à 1%, fluorure de sodium 50 mM et 100 U /ml d'aprotinine). Au bout de 30 min d'incubation sur de la glace, les lysats cellulaires ont été centrifugés pendant 15 min à 4 ° C et la quantité de protéine a été déterminée en utilisant le dosage des protéines à l'acide bicinchoninique. Equal quantité de protéines (40 ug) de chaque échantillon a été chargé dans chaque puits; charge égale a encore été vérifiée par immunoblot avec des anticorps d'actine. Les échantillons ont été chargés dans Novex Tris-glycine 4-20% de gels de gradient et une électrophorèse a été effectuée dans le système d'électrophorèse NuPAGE (Invitrogen, USA). Les protéines ont été transférées à un difluorure de polyvinylidène (PVDF) (Sigma) selon le protocole standard. Les membranes ont été sondées avec une dilution 1: 1000 d'un anticorps monoclonal de souris contre la p53
(PAB 240; ab-26; Abcam, États-Unis), (6A7; ab5714; Abcam, USA) Bax, Securin
(DCS-280; ab3305; Abcam, USA), β-actine
(AC-15; ab6276; Abcam, USA) et le lapin anticorps polyclonaux contre NF-P65 κβ
(ab31481; ACSM, États-Unis). Les empreintes ont été lavées 3 fois pendant 10 minutes à chaque fois dans du TBST tampon à pH 7,6 (1 M de Tris Cl, 5 M de NaCl et 0,05% de Tween 20) et incubés avec un anticorps secondaire (phosphatase alcaline conjuguée à IgG anti-souris ou de la phosphatase alcaline conjuguée anti-lapin IgG 1: 2000; Abcam, USA) pendant 1 h à température ambiante. Après lavage intensif, la tache a été immergée dans une solution de substrat de 4 ml de BCIP /NBT (Bangalore Genei, Inde). coloration suffisante a été obtenue dans les 15 min. Chaque immunoblot a été réalisée en trois souris par point. Évaluation
histopathologique
tissus de l'estomac a été recueilli à partir témoin non traité et de deux souris RAN + chaux traitée avec une tumeur. Dans une autre série, les tissus de l'estomac ont également été recueillies à partir non traité, ainsi que des groupes qui ont traité pendant 300 jours avec RAN-extrait avec et sans chaux. Trois souris ont été choisis au hasard dans chaque groupe. Ces souris ne sont pas une indication de tumeur externe. Des sections de tissu (5-7 um) ont été traités pour la coupe histologique selon le protocole standard [19] et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine [20]. Les sections ont été ensuite observées au microscope optique et photographiés (Carl Zeiss, Allemagne).
Extraction de l'ARN et les cellules d'analyse RT-PCR conventionnelle ont été recueillis par le grattage de la couche interne de l'oesophage et de l'estomac du témoin non traité, RAN et RAN + chaux souris traitée (trois souris par point). Des cellules de moelle osseuse ont été prélevés dans l'os du fémur de la souris. L'ARN total a été isolé avec du Trizol et ensuite purifié en utilisant le kit RNeasy Mini (Qiagen) selon le protocole du fabricant. Une transcription inverse a été réalisée avec 1 ug d'ARN total provenant de chaque échantillon en utilisant la transcriptase inverse Quantiscript, Quantiscript RT-tampon et d'amorce de RT-mix kit de transcription inverse QuantiTect (Qiagen GmbH, Hilden, Allemagne) selon le protocole du fabricant. Amplification de l'ADNc a été réalisée en 20 solution ul contenant 2 ul d'ADNc, 10 pmol paires d'amorces pour aurora A, aurora B, Mad2, Bub1 et GAPDH (pour les séquences d'amorces, voir fichier supplémentaire 1: Information supplémentaire) respectivement, et 10 pi de RT qPCR master mix (Qiagen GmbH, Hilden, Allemagne). La PCR consistait en une dénaturation initiale à 94 ° C pendant 5 minutes, puis les cycles 30 de réaction (30 secondes à 94 ° C, 30 secondes à 60 ° C et 30 secondes à 72 ° C) et un cycle final à 72 ° C pendant 10 min. GAPDH a été utilisé comme contrôle interne. Tous les produits de PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose éthidium bromure taché et visualisées avec une lumière UV. Flow analyse cytométrique des cellules
cellules de moelle osseuse de souris et les cellules recueillies par grattage de la couche interne de l'œsophage et de l'estomac à la fois non traité et traité pendant 260 jours avec un réseau RAN avec ou sans chaux ont été fixées avec 70% d'éthanol. cellules Estomac tumorales ont également été recueillies et fixées. Les cellules fixées ont été lavées dans du PBS et remises en suspension dans 500 pi de solution d'iodure de propidium (50 ug /ml d'iodure de propidium, 0,2 mg /ml de RNase) pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité. 10.000 cellules ont été acquis pour chaque échantillon et analysées avec un FACS Calibur (Becton-Dickinson). le logiciel CELLQuest Pro a été utilisé pour quantifier les compartiments du cycle cellulaire afin d'estimer le pourcentage de cellules réparties dans les différentes phases du cycle cellulaire. Des études de marquage
Annexine V
La mort cellulaire apoptotique a été évaluée en utilisant la méthode de l'isothiocyanate AnnexinV fluorescéine dans les cellules tumorales de l'estomac et aussi dans la couche interne de cellules de l'estomac et de l'oesophage non traité et RAN avec et sans chaux souris traitée après 260 jours de administeration continue. Le culot cellulaire a été remis en suspension dans du PBS. Les cellules ont été colorées avec de l'iodure de propidium et Annexine-V-FITC en utilisant l'annexine V BD PharmingenTM: Kit FITC Apoptosis Detection (BD-Pharmingen Biosciences, San Diego, CA) selon les instructions du fabricant. En bref, après avoir recueilli et deux lavages avec du PBS, les cellules ont été remises en suspension dans le tampon de liaison (500 ul). FITC-annexine-V (5 pi) a été ajouté aux cellules, suivi par l'addition de 5 ul PI selon le protocole. Les échantillons ont été ensuite mis en incubation pendant 15 minutes dans l'obscurité à température ambiante et soumis à une évaluation par cytométrie de flux. Analyse statistique
Valeurs de sont exprimées en moyenne ± écart-type ou de moyenne ± SEM pour le contrôle et les échantillons expérimentaux et les analyses statistiques ont été effectuées par le test t de Student avec le logiciel GraphPad Prism 5.1. Les résultats des valeurs ont été considérées comme statistiquement significative, si la valeur de p était de 0,05 ou moins.
observations générales
Out de quinze souris, deux souris ont développé un cancer de l'estomac après 220 et 256 jours d'alimentation de RAN extrait avec de la chaux (figure 2A a et b). Aucune tumeur a été développé chez la souris non traitées ou administré avec RAN seulement. La section histologique clairement différenciée entre normale (Figure 2A c) et de l'estomac tumoraux (figure 2A d-f). Cependant, la préparation histologique des tissus de l'estomac a également été faite à partir de trois souris à la recherche d'apparence normale choisis au hasard dans ce groupe après 300 jours d'alimentation avec RAN-extrait avec et sans chaux. Les deux RAN avec et sans chaux a montré sa capacité à induire le cancer dans l'estomac. Deux des trois souris traitées avec seulement RAN montré phase de pré-cancéreuses (dysplasie), alors que tous les trois souris traitées avec RAN + chaux ont montré un carcinome (figure 2B). Figure 2 Dissected souris et histopathologie des deux tissus normaux et tumoraux de l'estomac après un traitement avec RAN avec et sans chaux. souris A. Dissected avec (a) l'estomac normal et (b) l'estomac tumoraux indiqué par une flèche. Histopathologie de la normale (c) et de l'estomac de la tumeur (d, e et f) induite par l'extrait de RAN à la chaux. Les flèches indiquent ulcérées néoplasme dans les cellules (d) et géants de la tumeur dans (e et f). Le grossissement est indiqué soit 10X ou 40X. B. histopathologie de l'estomac normal et tumoraux de souris après RAN et RAN + traitement à la chaux pendant 300 jours. Dans tous les panneaux, "Normal" indique les souris sans tumeur »Dysplasia" indique les souris avec le tissu gastrique précancéreuse. «Carcinome" indique les souris avec l'estomac tumorale. Dysplasie montre anisocaryose (variation de la taille des noyaux) et anisocytose (variation de la taille des cellules). Le grossissement est indiqué soit 10X, 40X et 100X.
Étudié sur métaphase spreads
Pour déterminer si administeration continue d'extrait de RAN (de 15 à 180 jours) avec ou sans chaux a un effet sur les chromosomes, nous avons étudié les écarts de métaphase après 2 h de traitement par la colchicine, dans des échantillons de moelle osseuse. Les données ont révélé une augmentation progressive des figures de mitose avec chromatides sœurs prématurément séparés (figure 3A et C) à la fois dans RAN et RAN + chaux administré souris, contre aucun chez les souris non traitées. Il ressort également de l'étude que RAN + chaux administrée moelle osseuse de souris ont montré la fréquence significativement plus élevée de cette anaphase précoce que ne RAN administré (figure 3A). Après 180 jours de administeration continu de RAN + chaux, 34,4% anaphase précoce par rapport à 18,4% (p = 0,002) chez la souris de RAN-administré BMC ont été observés. Figure 3 Analyse du caryotype de l'instabilité génomique dans les cellules de moelle osseuse de souris après exposition à l'extrait avec RAN (réseau RAN + L) ou sans chaux (RAN). (A) Pourcentage de métaphases avec la séparation des chromatides sœurs prématurée. Deux souris par point pour non traité, 15 et 30 jours groupe traité et trois souris par point pour le reste. Au moins 100 métaphases ont été marqués à chaque souris. (B) normal de la propagation de la métaphase à partir de cellules de moelle osseuse de souris. (C) la séparation des chromatides sœurs prématurée de la souris exposée au RAN. Les crochets montrent chromatides soeurs couché séparés en chiffres mitotiques qui montrent le phénotype. (D et E) Metaphase propagation montré 37 et 38 chromosomes, respectivement. (F, G et H) Metaphase propagation ont montré plus de 60 chromosomes. (I) a montré plus de 80 chromosomes.
Nous avons compté le nombre de chromosomes en métaphase se propage à comprendre la signification de anaphases précoces par rapport à la stabilité des chromosomes. Les souris non traitées ont un stable (2n = 40) caryotype (figure 3B) et ne présentaient pas de cellules aneuploïdes. Nous avons observé faible fréquence des cellules aneuploïdes (Figure 3D-I; Tableau 1) RAN-administré, avec et sans chaux, pendant 120 jours et il a été noté que la fréquence des cellules aneuploïdes a été augmentée progressivement. La fréquence moyenne (13,8%) des cellules aneuploïdes a été marqué chez les souris à la fois la tumeur de l'estomac portant. Dans l'ensemble, la fréquence des cellules aneuploïdes était plus après RAN + chaux administeration que RAN seul (tableau 1) .Table analyse 1 Chromosome des cellules de l'os de moelle de souris après une exposition à RAN extrait avec ou sans chaux
traitement motif


diffusion totale de traitement jours marqué
chromosome pas.
aneuploïdie
soeur prématurée

37
38
39
40
41
42
> 60

% (moyenne)
Chromatid séparation%
0
110 non traitée
110
0
0
104
104
0
0
RAN
120
105 1
1
103
1.9
17.5
120
2
1 2
115
4.1
18,7
105 1
2
102
2,8 (2,9)
18.3 (18.2)
RAN + chaux
100 2
2 1
95
5.0
31,7
105 2
2
3
98
6.6
28,6
110 3
2 1
103 1
6.4 (6.0)
28,3 (29,5)
p = 0.015a
RAN
180
101 1
2 1
97
3.9
18,0
124
2
2 1
119
4.0
17,7
114 3
2 1
108
5,3 (4,4) 19,4
(18.4)
RAN + chaux
112 3
3 3
103
8,0
32,6
105 2
2
1
98 1
1
6.6
34,9
110 4
2
101 2
1
8.2 (7.6)
35,6 (34,4)
p = 0.002a
RAN + chaux
220
232
6
9
12
194
7 2
2
16,4
8.2
(avec tumeur avancée)
256
234
5 4
7
208
5
2 3
11,1 (13,8)
7.1 (7.6)
une augmentation statistiquement significative dans le t-test apparié; deux queues valeur de p a été montré.
aberrations chromosomiques ont été marqués principalement cassures de chromatides. Très faible fréquence des pauses isochromatides a été observé et aucun aberrations de change ont été trouvés. La fréquence des cassures de chromatides et métaphases aberrantes a été augmentée progressivement de 60 à 180 jours de RAN-administeration avec ou sans chaux. La fréquence des aberrations était plus après RAN + chaux administeration que RAN seul. La fréquence des aberrations était plus à la fois la tumeur de l'estomac avancé des souris porteuses. (Pour plus de détails d'aberration, voir fichier supplémentaire 1: Renseignements supplémentaires).
Expression réduite des gènes mitotiques et de la broche de point de contrôle chez les souris RAN-traités
Au vu de ces études, nous avons examiné l'expression de AuroraA, AuroraB, MAD2
et les gènes BUB1 de la moelle osseuse, de l'œsophage et de l'estomac cellules de ces souris qui ont été extraits de RAN non traité ou administré avec et sans chaux pour 120, 180 et 260 jours. Les résultats de RT-PCR conventionnelle (Figure 4) ont montré que les cellules recueillies à partir de l'œsophage et l'estomac ont montré la plupart du temps sous-expression de ces gènes par rapport à un non traité et une telle sous-expression était cohérente et significative RAN + chaux souris administrées. Toutefois, l'expression de tous ces gènes dans BMC n'a pas changé de façon significative, sauf sur-expression de Mad2
et Bub1
a été noté dans le BMC de souris recueillie après 260 jours de administeration. Expression de la figure 4 supérieure de gènes de point de contrôle mitotique dans la moelle osseuse de souris (BM), les cellules de l'œsophage et de l'estomac après l'exposition avec RAN extrait avec ou sans chaux pour 120, 180 et 260 jours. Analyse quantitative Lower panel- densitométrique du profil d'expression des gènes de point de contrôle mitotique niveau ARNm dans les cellules de l'œsophage et de l'estomac après 260 jours d'exposition a été montré. Les valeurs sont la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. Les valeurs sont normalisées en fonction des valeurs respectives de GAPDH. * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001. Significativement différent par rapport au témoin négatif /positif (tel que déterminé par le test t apparié).
Analyse des over-expression des gènes à travers les niveaux de p53, p65 immunoblotting de Bax,
et Securin
dans BMC de souris après administeration de RAN extraire avec ou sans chaux pour 60, 90 et 180 jours, et ceux de l'œsophage et de l'estomac après 180 jours d'alimentation ont été examinés par immunoblotting. Les niveaux de ces protéines ont également été testés à partir des cellules recueillies tissus-sage des souris non traitées. Les résultats indiquent que l'expression de p53, p65, Bax
et Securin
sont significativement élevée dans tous les tissus chez la souris administrés RAN. Cette amélioration était significativement plus élevée chez RAN + chaux que chez les souris administrés uniquement RAN (figure 5). Figure 5 du Haut Représentant de détection western blot de p65, p53, Securin, bax et β-actine dans la moelle osseuse de souris (BM), les cellules de l'œsophage et de l'estomac après l'exposition avec RAN extraient avec ou sans chaux. Pour BM, les cellules ont été recueillies après 60, 120 et 180 jours, alors que pour l'œsophage et de l'estomac, les cellules ont été recueillies seulement après 180 jours d'exposition. la ß-actine a été utilisée comme témoin de chargement. analyse quantitative panel- densitométrique inférieure du taux de protéines des gènes mentionnés ci-dessus dans la moelle osseuse, de l'œsophage et de l'estomac cellules après 180 jours d'exposition a été montrée. Les valeurs sont la moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes. Les valeurs sont normalisées en fonction des valeurs de ß-actine respectifs. * P < 0,05; ** P < 0,01 significativement différente par rapport au témoin négatif /positif (tel que déterminé par le test t apparié).
Flux des études de cytométrie sur le cycle cellulaire et la détection des cellules apoptotiques par une double coloration et immunoblotting
flux analyse cytométrique de la teneur en ADN dans la moelle osseuse , de l'œsophage et de l'estomac cellules de souris recueillies après 260 jours de RAN + administration de la chaux (figure 6A), ont montré qu'il y avait une augmentation des cellules en phase G1 à la fois dans la moelle osseuse et de l'œsophage par rapport au témoin non traité. Cependant, dans l'estomac, le pourcentage de cellules en phase de sous-G1 a été augmentée, ce qui pourrait être attribué en raison de la mort cellulaire apoptotique. Pour confirmer cela, double coloration avec AnnexinV et PI a été réalisée. Les données dans la figure 5B indiquent une augmentation de la coloration positive avec l'annexine-V dans le quadrant 2 et 3 dans les cellules de l'estomac, mais pas dans les cellules de l'œsophage RAN + chaux souris ayant reçu. Figure 6: Analyse du cycle cellulaire et de l'apoptose chez les souris traitées avec RAN avec de la chaux (A) Analyse du cycle cellulaire après 260 jours d'exposition à RAN extrait avec de la chaux dans la moelle osseuse, de l'œsophage et de l'estomac cellules de souris et également à partir de cellules tumorales de l'estomac. (B) cytogrammes représentatifs de l'Annexine V par rapport à PI des intensités de fluorescence telle que déterminée par analyse par cytométrie de flux dans des cellules d'oesophage et l'estomac de souris après 260 jours d'exposition avec RAN à la chaux et à partir de cellules tumorales de l'estomac. Au sein d'un cytogramme quadrant 1 et 2 représentent les cellules apoptotiques précoces et tardifs, respectivement; quadrant 3, les cellules viables; quadrant 4, les cellules mortes. (C) Western Blot des marqueurs apoptotiques dans les cellules (non traitées) et des tumeurs gastriques normales. β-actine a été utilisée comme témoin de chargement.
Il est intéressant de cytométrie en flux des cellules tumorales recueillies à partir des souris qui a développé une tumeur dans l'estomac après 220 et 256 jours de administeration continu de RAN et de la chaux, a révélé une réduction significative dans les cellules G1 avec augmentation concomitante dans les cellules de la sous-G1 (figure 6A). Double coloration indique que les cellules sub-G1 sont des cellules nécrotiques la plupart du temps mort (quadrant 4) (figure 6B). niveau significativement plus élevé de p53
et les protéines Bax de ont été observées dans la tumeur que les cellules de l'estomac normales (Figure 6C). Cependant, PARP
a été jugée absente dans les cellules tumorales de l'estomac, bien que PARP
et ses 29 kD clivés produit étaient présents dans des échantillons d'estomac normaux (Figure 6C). Discussion de la
Le présent étude a été entreprise pour voir si ad libitum
administeration de RAN extrait avec ou sans chaux dans l'eau peut induire l'œsophage ou de l'estomac cancer chez la souris potable et si elle le fait, ce processus initial sont impliqués. Dans cette étude, les souris ont reçu l'ensemble RAN-extrait avec et sans chaux afin d'imiter le style de RAN de la consommation humaine. En outre, la dose a également été augmentée périodiquement comme cela se produit à l'homme. Nos résultats ont montré que les deux RAN avec ou sans chaux induire un cancer de l'estomac, bien que, on constate que la présence de la chaux avec RAN favorisé la transformation cellulaire plus élevée et donc développé un cancer de l'estomac avant RAN seul. Il apparaît que le cancer a été induite dans l'estomac en raison de la plus grande exposition de son revêtement devait RAN tandis que la paroi de l'œsophage a été exposé brièvement en buvant le RAN de l'eau mitigée.
Il a été démontré précédemment qu'un pH alcalin optimal pour générer ROS par autoxydation de polyphénols noix d'arec [6, 7]. On a également montré que la fraction d'extrait catéchine noix d'arec génère activement des ROS à pH alcalin, ce qui induit des lésions de l'ADN in vitro
[21, 22]. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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