Индукция нестабильности хромосом и рака желудка путем изменения характера экспрессии генов митотических контрольной точки у мышей, подверженных ареки ореха

Индукционная нестабильности хромосом и рака желудка путем изменения характера экспрессии генов митотических контрольной точки у мышей, подвергшихся воздействию ареки ореха
Аннотация
Справочная информация
Существуют убедительные свидетельства для причинно-следственной связи между потреблением ареки ореха и раковых заболеваний. В Мегхалая, Индия, разнообразие ареки ореха используется в качестве сырья и необработанном виде, химический состав и фармакологические действия были зарегистрированы. Тем не менее, мы знаем мало на начальном пути, участвующих в ареки-ореховой связанной канцерогенеза, так как трудно оценить его влияние на генетических изменений без вмешательства других факторов компаундирования. Таким образом, настоящее исследование было проведено на мышах, чтобы проверить способность сырого ареки ореха (RAN), чтобы вызвать рак и контролировать экспрессию определенных генов, вовлеченных в канцерогенез. Это исследование не было предназначено для выделения каких-либо активных ингредиентов из СРД и посмотреть его действие.
Методы
были приняты и использованы в различных временных точках для различных экспериментального анализа трех групп мышей (n = 25 в каждой) , Были рассмотрены другие три группы мышей (n = 15 в каждой) для индукции опухоли исследований. В каждом наборе две группы вводили RAN-экстракт вволю
в питьевой воде с добавлением или без извести. Экспрессия некоторых генов оценивали с помощью обычной ОТ-ПЦР и иммуноблоттинга. Мыши получали всю RAN-экстракта и без извести для того, чтобы имитировать человеческий стиль потребления RAN.

Результаты гистологического подготовки ткани желудка показало, что RAN индуцированного рака желудка. Постепенное увеличение частоты скороспелых анафазных и анеуплоидных клеток наблюдали в клетках костного мозга с большим приростом следующих RAN + лайма administeration. Уровни р53, Bax, Securin
и p65
в пищеводе и желудке клетки были повышены в течение первых дней воздействия RAN в то время как те из различных белков митотического контрольных точек были подавляются. смерть клеток путем апоптоза была обнаружена в нераковых клетках желудка, но не в опухолевых клетках, которые показали избыточную экспрессию Вах
и отсутствии PARP
.
Заключение
Настоящее исследование показало (а) СРД вызывает рак желудка, Тем не менее, наличие извести способствует более высокой трансформации клеток и тем самым развился рак ранее, (б) возмущения в компонентах сегрегации хромосом машин могут быть вовлечены в начальный процесс канцерогенности и (с) важность преждевременным анафазе в качестве скринингового маркера для идентификации митоза дефектов контрольной точки в течение первых дней.
Ключевые слова
хромосомной нестабильности митотические генов контрольной точки Securin
Апоптоз Фоновые
пищеводного плоскоклеточный рак (ККЭС) и рака желудка являются наиболее распространенных видов рака в Индии, с самым высоким заболеваемость ESCC находясь в северо-восточных штатах Индии [1]. Есть веские показания к причинно-следственной связи между ареки гайкой или Quid жевательных привычек и этих видов рака. Несколько исследований у разных видов животных показали положительную индукцию опухолей в обоих мишени (щека-мешок, пищевода и желудка) и нецелевой (легких и печени) тканей при ареколин (ARC) или ареки-ореховый экстракт вводят различными способами, такими как пероральная интубации [2], смешанной с диетой [3], а также применение щека-сумка [4]. Таким образом, представляется, что метаболическая активация алкалоидов необходима для окончательного преобразования данных в конечных канцерогенов, который сильно зависит от физиологических условий и наличия определенных факторов [5]. Отчеты показали генерацию активных форм кислорода (ROS) от ареки-ореховых ингредиентов в щелочных условиях [6, 7]. Благодаря наличию извести в бетеля Квид препарата, слюна ареки-гайка "жвачные животные, как правило, изменяется от нейтральной до щелочной состояния, которое может быть идеальным для генерации ROS [7]. Nair и др. [6] также отметил, что помимо АРК, авто- окисление ареки-ореховых полифенолов может генерировать H <суб> 2О <суб> 2 и супероксид радикалов при щелочном рН.
В штате Мегхалая, Индия, разнообразие Areca гайка, локально называется "Квай", используется в качестве незрелой и необработанной сырой форме, которая имеет более высокое содержание алкалоидов, полифенолы и танины, по сравнению с высушенной форме [8]. Бетель-Quid используется в Мегхалая содержит сырой ареки орех (RAN), известковое тесто и небольшую часть бетеля-листа без табака и других компонентов. Здесь люди глотают всю фунтов после того, как жевательная вместо того, чтобы плевок его, который может стать важным фактором для ККЭС и рака желудка. В последнее время 40% образцов рака пищевода, полученные от больных Meghalaya состояния, имеющих только RAN-жевательную привычка показала исключить D9S1748 микросателлитных маркеров и D9S1749, расположенный рядом с экзоном 1 &beta от CDKN2A /АРФ
гена на 9p21. Промотор гиперметилирование CDKN2A
гена была значительно выше в образцах с привычкой RAN-жевания только, чем те, которые имеют привычку использования как RAN и табака [9]. До сих пор мы не знаем, сколько на начальный путь включает в Бетель-ореховой связанного канцерогенеза в пищевода и желудка. Кроме того, трудно оценить влияние чисто и преимущественно ареки-ореховые индуцированных генетические изменения в человека без вмешательства со стороны других факторов компаундирования, как жевание табака или курение, употребление алкоголя, различные виды не-вегетарианское продуктов питания и т.д. Кроме того, наличие известь делает щелочную состояние, которое не является идеальным для экстракорпорального
культуре клеток и поэтому эффект ареки-гайки не могут быть протестированы в системах клеточных культур. С учетом этих, настоящее исследование было проведено на мышах с целью проверки способности RAN-экстракта с добавлением или без извести, чтобы вызвать рак и одновременно оценить характер экспрессии определенных генов, играющих важную роль в начальном процессе канцерогенеза.
химический состав и фармакологические действия ареки-гайки были зарегистрированы и рассмотрены несколько работников [10, 11]. Несколько исследований на животных, подтвердили, что ареки-продукты из орехов и бетеля специфичных нитрозаминов, обладают способностью индуцировать неопластических изменений у экспериментальных животных [11]. Значительные данные свидетельствуют о том, что ареки орех алкалоиды, преимущественно ареколин (ARC) являются основными факторами в БН-токсичности [11]. Было показано, что ARC может вызывать повреждения ДНК в клетках костного мозга мышей [12] и таких повреждений ДНК может быть уменьшено, если ARC вводят с N-ацетил-L-цистеина [13]. Таким образом, следует отметить, что данное исследование не было предназначено для выделения каких-либо активных ингредиентов из СРД и посмотреть его действие. Цель исследования состояла в том, чтобы определить начальный путь, участвующих в RAN, связанный канцерогенеза у мышей и, следовательно, мышей вводили весь RAN-экстракта и без извести для того, чтобы имитировать потребления привычки человека.
Нескольких генов, как р53 , p65, Securin
и многие другие, как известно, обычно избыточно экспрессируется во время канцерогенеза [14-16]. Кроме того, генетическая нестабильность также связано с хромосомной нестабильностью (CIN), что приводит к анеуплоидии, отличительной чертой рака. Такая анеуплоидии может облегчить туморогенез через потерю функции гена супрессора опухоли. Было замечено, что частичная утрата митотической управления контрольной точки приводит к CIN в раковых клетках человека [17, 18]. Таким образом, в настоящем исследовании мы оценивали характер экспрессии p53, p65, Securin
и нескольких генов контрольной точки митоза и сборки шпинделя в различных временных точках. Мы наблюдали, что RAN может вызвать рак желудка возмущением компоненты сегрегации хромосом машин.
Методов
Получение экстрактов
После того, как обстреливают волокнистых слоев из необработанной сырой и незрелый ареки ореха (RAN), 100 г Ран измельчали ​​и суспендировали в 125 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают, чтобы получить однородную пасту для приготовления водного экстракта RAN. Через 24 ч пасту перемешивают в течение 3 ч при 37 ° С, и водный экстракт собирали центрифугированием. Эта процедура экстракции повторяют еще раз, добавив 125 мл воды к остатку. Оба экстракты объединяли, что составляет 100 г RAN в 250 мл дистиллированной воды, фильтруют и замораживают при - 80 ° С. Фильтрат лиофилизируют в Secfroid Lyolab BII Lyophilizer (Дания). Лиофилизированный массу выдерживали при 4 ° С до использования. Экстракт содержал 0,9 г /100 г воды экстрагируемого материала.
Животные и лечение
швейцарский белых мышей (25-30 гм), 2-3 месяца старые были сохранены в лаборатории в общественных клетках в комнате с контролируемой температуре (20 ± 2 ° С) и контролируемое освещение (12 ч света, 12 ч темно). Стандартная диета мышь (NMC Oil Mills Ltd., Пуна, Индия) и воды вволю
были использованы во всех экспериментах. Эксперименты проводились в соответствии с ведомственным руководящим принципам и одобрены нашими «Институциональные стандарты по уходу и использованию животных" совета.
В Set-1, три группы мышей (n = 25 в каждой) были приняты, которые использовались при различных временные точки для различных экспериментального анализа. В Set-2, три группы мышей (n = 15 в каждой) были рассмотрены для индукции опухолевого исследований. На рисунке 1 приведен схематический обзор об общем протоколе, который рассматривался в данном исследовании. В каждом наборе, одна группа обрабатывали простой питьевой водой считается необработанной в то время как две группы вводили RAN экстракт вволю
в питьевой воде с добавлением или без извести (рН 9,8). Было подсчитано, что каждая мышь потребляется 1 мг экстракта в день. Такой оральный administeration продолжали в течение 60 дней, после чего доза была увеличена от 1 мг до 2 мг в день до 120 дней. Кроме того, через каждые 60 дней спустя доза была увеличена на 1 мг в день потребления. Рисунок 1 Технологическая схема эксперимента для анализа сырого ареки ореха, опосредованного канцерогенеза у мышей. Хаотичности сырой ареки-гайка; d- дней.
Приготовление метафазах и озвучивание хромосомных аберраций
Для приготовления метафазы, клетки костного мозга (BMC) были получены от двух мышей на каждую точку из необработанных, 15 и 30 дней обработанной группы и трех мышей на каждую точку для остальных. В обработанных группах, ВМС были собраны после того, как 15, 30, 60, 120 и 180 дней лечения. ВМС также были собраны из двух мышей, имеющих опухоль желудка. ВМС собирали после 2 ч обработки колхицином (15 мг /кг). Животные были убиты шейным смещением. Бедренные кости иссекали и КУМП были выдуваются введении 2 мл 0,075 М КСl, предварительно нагретую до 37 ° С. Клетки обрабатывали в гипотонический раствор в течение 15 мин и фиксировали в уксусной кислоте и метанола (1: 3). Слайды были получены способом пламени сушки, окрашенных в 5% Гимзе в течение 5 мин и смонтированный в синтетической среде. были взяты образы метафазных под Цейсс Axioskop микроскопом (Германия).
хромосомных исследования, слайды были закодированы в случайном порядке, и, по меньшей мере 100 хорошо разнесены метафазных пластинок Для исследования были выбраны из каждой мыши. Мы провели подсчет хромосом на метафазы распространения. Хромосомных аберраций оценивали как isochromatid перерывов и хроматидных перерывов. См расширенных экспериментальных процедур для деталей в дополнительном файле 1:. Справочная информация
иммуноблотинга
клетки из костного мозга, пищевод (царапанием внутренний слой) и желудок (царапанием внутреннюю часть) дважды промывали PBS (фосфатный буферный солевой раствор) и лизируют в radioimmuno-преципитации буфере (0,1% SDS, 2 мМ ЭДТА, 1% NP-40, 1% дезоксихолате натрия, 50 мМ фторида натрия и 100 ед /мл апротинина). После 30-минутной инкубации на льду, клеточные лизаты центрифугировали в течение 15 мин при 4 ° С, а количество белка определяли с помощью анализа с применением бицинхониновой белка кислоты. Равное количество белка (40 мкг) из загруженного каждый образец в каждую лунку; равно нагрузка была дополнительно подтверждена с помощью иммуноблоттинга с антителами актина. Образцы были загружены в Novex Трис-глицин 4-20% градиентном геле и электрофорез проводили в электрофоретической системе NuPAGE (Invitrogen, США). Белки переносили на поливинилидендифторидную (PVDF) мембрану (Sigma), следуя стандартному протоколу. Мембраны зондируют разведении 1: 1000 мышиных моноклональных антител против р53
(PAB 240; AB-26; Abcam, США), Вах
(6A7; ab5714; Abcam, США), Securin <бр> (DCS-280; ab3305; Abcam, США), β-актина
(AC-15; ab6276; Abcam, США) и кроличьи поликлональные антитела против NF-P65 ЛГр
(ab31481; BCAM, США). Пятна промывали 3 раза в течение 10 мин каждый в TBST буфере с рН 7,6 (1 М Трис Cl, 5 М NaCl и 0,05% твин-20) и инкубировали со вторичным антителом (щелочной фосфатазы, конъюгированного антитела против мышиного IgG, или щелочно-фосфатазу, конъюгированную antirabbit IgG 1: 2000; Abcam, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. После тщательной промывки блот погружали в субстратный раствор 4 мл BCIP /NBT (Бангалор Genei, Индия). Достаточное окрашивание было получено в течение 15 мин. Каждый иммуноблоттинг проводили в трех мышей в каждой точке.
Гистопатологическая оценка
Желудок ткани была собрана из необработанного контроля и от двух мышей RAN + известковых обрабатывали опухоли. В другом наборе, ткани желудка также собирали из необработанной, а также из групп, которые лечили в течение 300 дней с RAN-экстракта с и без извести. У трех мышей были выбраны случайным образом из каждой группы. У этих мышей не было никаких признаков опухоли внешне. Тканевые срезы (5-7 мкм) были обработаны для гистологического секционирования в соответствии со стандартным протоколом [19] и окрашивали гематоксилином и эозином [20]. Затем срезы наблюдали под световым микроскопом и фотографировали (Carl Zeiss, Германия).
Экстракции РНК и традиционный анализ RT-PCR
Клетки собирали царапать внутренний слой пищевода и желудка с необработанным контролем, RAN и RAN + известь обрабатывают мышь (три мыши на одну точку). Клетки костного мозга, были собраны из бедренной кости мыши. Общую РНК выделяли с тризол и затем очищали с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Обратную транскрипцию проводили с 1 мкг тотальной РНК из каждого образца с использованием Quantiscript обратной транскриптазы Quantiscript RT-буфера и RT Primer-смесь QuantiTect с обратной транскрипцией (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) в соответствии с протоколом производителя. Амплификацию кДНК проводили в 20 мкл раствора, содержащего 2 мкл кДНК, 10 пар праймеров пмоль для Aurora A, Aurora B, Mad2, bub1 и GAPDH (для последовательностей праймеров, см дополнительный файл 1: Справочная информация), соответственно, и 10 мкл РТ КПЦР Master Mix (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). ПЦР состояла из первоначальной денатурации при 94 ° С в течение 5 мин, а затем циклам 30 реакции (30 секунд при 94 ° С, 30 секунд при 60 ° C и 30 секунд при 72 ° C) и заключительный цикл при 72 ° C в течение 10 мин. GAPDH, использовали в качестве внутреннего контроля. Все продукты ПЦР электрофоретически разделяли на Окрашенный бромистым этидием агарозный гель и визуализировали с помощью УФ-излучения.
Проточной цитометрии анализ клеток
Мышиные клетки костного мозга, и клетки собирали путем расчесывания внутренний слой пищевода и желудка и другого необработанных и обработанных в течение 260 дней с заливались известью или без них фиксировали 70% -ным этанолом. Опухолевые клетки желудка также были собраны и зафиксированы. Фиксированные клетки промывали в PBS и ресуспендировали в 500 мкл раствора пропидийиодидом (йодида 50 мкг /мл пропидия, 0,2 мг /мл РНКазы) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. 10000 клеток были получены для каждого образца и анализировали с помощью FACS Calibur (Becton-Dickinson). CellQuest Pro программное обеспечение было использовано для количественного определения клеточного цикла отсеков для оценки процент клеток, распределенных в разных фазах клеточного цикла. Исследования маркировки
аннексина V
смерть клеток путем апоптоза оценивали с использованием annexinV-флуоресцеинизотиоцианатом метод в опухолевых клетках желудка а также во внутреннем слое клеток желудка и пищевода необработанной и RAN с использованием и без извести, обработанной мыши после 260 дней непрерывного administeration. Клеточный осадок ресуспендировали в PBS. Клетки окрашивали пропидийиодидом и аннексина-V-FITC с использованием BD PharmingenTM аннексина V: FITC Апоптоз Detection Kit (BD-Pharmingen Biosciences, San Diego, CA) в соответствии с инструкцией изготовителя. Если коротко, то после того, как сбор и дважды промывают смесью ФБР, клетки ресуспендировали в буфере для связывания (500 мкл). ФИТЦ-аннексина-V (5 мкл) добавляли к клеткам с последующим добавлением 5 мкл PI в соответствии с протоколом. Затем образцы инкубировали в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре и подвергали проточной цитометрии оценки.
статистический анализ
Значения выражены в виде среднего значения ± SEM или среднее значение ± SEM для контрольных и опытных образцов и статистического анализа были выполнены от критерия Стьюдента с программным обеспечением GraphPad Prism 5.1. Значения считались статистически значимыми, если значение р было 0,05 или меньше.
Результаты
Общие наблюдения
из пятнадцати мышей, две мыши заболели раком желудка после того, как 220 и 256 дней кормления RAN экстракта с известью (Рисунок 2А а и б). Опухоль не была разработана в мышином неочищенными или вводили только RAN. Гистологический срез четко разграничены между нормальным (рис 2А с) и опухолевой желудка (рис 2A d-F). Тем не менее, гистологическое подготовка ткани желудка был также сделан из трех, по-видимому нормальных мышей ищет случайно выбранных из этой группы после 300 дней кормления с RAN-экстракта и без извести. Оба RAN с и без извести показала свою способность вызывать рак желудка. Два из трех мышей, получавших только RAN показали предраковых стадии (дисплазия), в то время как все три мыши, обработанные RAN + известью показала рак (рис 2В). Рисунок 2 Вскрытый мыши и гистопатологии как нормального, так и опухолевой ткани желудка после обработки RAN с использованием и без извести. А. Вскрытый мышь с (а) нормального желудка и (б) опухолевого желудка указано стрелкой. Гистологическое нормального (с) и желудок опухоль (д, е и е), что индуцированное RAN экстракта с известью. Стрелки указывают сгнила новообразование в (d) и опухоли гигантских клеток (E и F). Увеличение указывается либо 10X или 40X. B. гистопатология нормальной и опухолевой желудка мышей после RAN и RAN + известкования в течение 300 дней. Во всех панелях, "Normal" указывает на то мышей не опухоль, "дисплазия" указывает на мышей с предраковыми ткани желудка. "Карцинома" указывает на мышей с опухолевой желудка. Дисплазия показывает anisokaryosis (изменение размера ядер) и анизоцитоз (изменение размера ячеек). Увеличение указывается либо 10X, 40X и 100X.
Училась на метафазных
Чтобы определить, имеет ли непрерывное administeration экстракта RAN (от 15 до 180 дней) с или без извести какого-либо влияния на хромосомах, мы изучали метафазных , после 2 ч обработки колхицином, в образцах костного мозга. Данные показали постепенное увеличение числа митозов с преждевременно отделенных сестринских хроматид (рис 3А и С), как в РАН и RAN + лайма вводили мыши, по сравнению с отсутствием в необработанных мышей. Также очевидно из исследования, что СРД + известь вводят костного мозга мышей показали значительно более высокую частоту такого скороспелого анафазе, чем только RAN управляемых (фиг.3А). Через 180 дней непрерывного administeration РАН + извести, 34,4% преждевременным анафазе по сравнению с 18,4% (р = 0,002) в RAN вводили мыши БМК были замечены. Рисунок 3 Анализ кариотипов геномной нестабильности в клетках костного мозга мышей после воздействия экстракта заливались (RAN + L) или без извести (RAN). (A) Процент метафазах с преждевременной сестрой-хроматидный разделения. Две мыши на точку для необработанной, 15 и 30 дней обработанной группы и трех мышей на точку для остальных. По крайней мере, 100 метафаз оценивали по каждой мыши. (B) Нормальная метафазы распространение из клеток костного мозга мышей. (C) Преждевременное сестра хроматид отделение от мыши подвергаются воздействию RAN. Скобки показывают, сестра-хроматиды лежа разделены фигурами митоза, которые показывают фенотип. (D и E) Метафаза спрэд показал 37 и 38 хромосом, соответственно. (F, G и H) Метафаза спрэд показал более 60 хромосом. (I) показали более 80 хромосомами.
Мы подсчитывали число хромосом в метафазных понимать значение скороспелой анафаз по отношению к стабильности хромосом. Необработанные мыши имеют устойчивую (2n = 40) кариотип (рис 3B) и не показали никаких анеуплоидных клеток. Мы не наблюдаем низкую частоту анеуплоидных клеток (рис 3D-I, таблица 1) в СРД вводили, с и без извести, в течение 120 дней, и было отмечено, что частота анеуплоидных клеток была увеличена постепенно. Средняя частота (13,8%) анеуплоидных клеток оценивали в обоих желудка с опухолью мышей. В целом, частота анеуплоидных клеток была более следующих RAN + лайма administeration чем только RAN (таблица 1) .table 1 Хромосома анализ клеток костного мозга мышей после воздействия RAN экстракта с добавлением или без извести
Лечение рисунок

Лечение дней

Общий спрэд набрал

хромосоме нет.

Анеуплоидия

Преждевременное сестра:

<бр> 37

38

39

40

41

42

> 60

% (среднее значение)

хроматид%

Необработанные
0
110
110
0 0

104
104
0
0
RAN
120
105
1
1
103
1,9
17,5
120
2 <бр> 1 страница 2 из 115
4.1
18,7
105
1 страница 2 из 102
2.8 (2.9)
18,3 (18,2) <бр> RAN + известь
100
2 страница 2 из 1
95
5,0
31,7
105
2 страница 2 из 3 <бр> 98
6.6
28,6
110
3 страница 2 1 103

1
6,4 (6,0)
28,3 (29,5) <бр> р = 0.015a
RAN
180
101
1 страница 2 из 1
97
3.9
18,0
124 страница 2
2

1 119
4.0
17,7
114
3 страница 2 1
108
5.3 (4.4)
19,4 (18,4)
RAN + известь
112 страница 3 из 3 страница 3 из 103
8,0
32,6
105 страница 2 из 2
1
98
1
1
6.6
34,9
110 4
2
101 страница 2 1
8,2 (7,6) 35,6 (
34,4)
р = 0.002a
RAN + известь
220
232
6
9
12
194 <бр> 7
2 страница 2 16.4
8,2
(с углубленным опухолью)
256
234
5 4
7
208 страница 5 из 2 страница 3 11,1 (13,8) 7,1
(7,6)
статистически значимое в парных т-тест; было показано двухвостый значение р.
хромосомных аберраций были забиты в основном как хроматидных перерывов. наблюдалась очень низкая частота isochromatid перерывов и не было найдено никаких обменных аберраций. Частота хроматидных разрывов и аберрантных метафазах постепенно увеличивали от 60 до 180 дней RAN-administeration с или без извести. Частота аберраций была более следующая RAN + лайма administeration чем только RAN. Частота аберраций было больше как в продвинутом желудка опухоли мышам. (Для получения дополнительной информации аберраций см Дополнительный файл 1: дополнительная информация).
Пониженную экспрессию митоза и контрольных точек шпинделя генов в RAN обработанных мышей
Ввиду вышеуказанных исследований, мы исследовали экспрессию AuroraA, AuroraB, MAD2
и bub1
гены в костном мозге, пищевода и желудка клетки тех мышей, которые были неочищенных или вводили экстракт RAN и без извести для 120, 180 и 260 дней. Обычные результаты RT-PCR (рисунок 4) показали, что клетки, собранные из пищевода и желудка показали в основном под экспрессии этих генов по отношению к необработанным одному и тому подобное под выражением был последовательным и значимым в RAN + известью, вводимые мышам. Тем не менее, выражение всех этих генов в BMC не изменилась каким-либо существенным образом, за исключением чрезмерной экспрессии MAD2
и bub1
был отмечен в БМК мыши, собранной после 260 дней administeration. Рисунок 4 верхних Panel- экспрессии митотических генов контрольной точки в костном мозге мышей (БМ), пищевода и желудка клетки после воздействия с RAN экстракта с или без извести для 120, 180 и 260 дней. Нижняя панель- Количественный денситометрическое анализ профиля экспрессии митотических генов контрольной точки уровня мРНК в пищевод и желудок клеток после 260 дней экспозиции было показано. Значения представляют собой среднее ± SEM трех независимых экспериментов. Значения нормированы на соответствующие значения GAPDH. * Р &л; 0,05; ** Р &л; 0,01; *** Р &л; 0,001. Значительно отличается по сравнению с отрицательным /положительным контролем (как определено парного Т-тест).
Анализ чрезмерной экспрессии генов посредством иммуноблоттинга
уровней p53, p65, Bax
и Securin
в БМК от мышей после administeration из RAN экстракта с или без извести в течение 60, 90 и 180 дней, а также те пищевода и желудка после 180 дней кормления были обследованы с помощью иммуноблоттинга. Уровни этих белков были также испытаны из клеток, собранных ткани-накрест от необработанных мышей. Результаты показывают, что экспрессия р53, р65, Bax
и Securin
значительно повышены во всех тканях в RAN, вводимых мышам. Такое усиление значительно был в RAN + известью выше, чем в только RAN, управляемых мышей (рисунок 5). Рисунок 5 верхней Panel- Представитель Вестерн-блоттинга обнаружение p65, p53, securin, Вах и бета-актина в костном мозге мышей (БМ), пищевода и желудка клетки после воздействия с RAN экстракта с или без извести. Для БМ, клетки собирали через 60, 120 и 180 дней, тогда как для пищевода и желудка, клетки собирали только после 180 дней экспозиции. b-актин использовали в качестве контроля нагрузки. Нижняя панель- Количественный денситометрическое анализ уровня белков вышеуказанных генов в костном мозге, пищевод и желудок клетки через 180 дней экспозиции было показано. Значения представляют собой среднее ± SD трех независимых экспериментов. Значения нормированы на соответствующие бета-актина значений. * Р &л; 0,05; ** Р &л; 0,01 Значительно отличается по сравнению с отрицательным /положительным контролем (как определено парного Т-тест).
Flow исследования Cytometric на клеточного цикла и обнаружения апоптотических клеток путем двойного окрашивания и иммуноблоттинга
потока цитометрии анализа содержания ДНК в костном мозге , пищевода и желудка клетки мыши, собранных после 260 дней RAN + введения извести (рис 6A), показал, что произошло увеличение в фазе G1 клеток как в костном мозге и пищевода по отношению к необработанным контролем. Тем не менее, в желудке, процент клеток в фазе суб-G1 была увеличена, что может быть отнесено за счет апоптотической гибели клеток. Для подтверждения этого, было проведено двойное окрашивание с annexinV и PI. Данные на рисунке 5В указывает на повышение положительное окрашивание с аннексина-V в квадранте 2 и 3 в клетках желудка, но не в клетках пищеводных RAN + известью, вводимые мышам. Рисунок 6 Анализ клеточного цикла и апоптоза у мышей, обработанных RAN с известью (А) Анализ клеточного цикла после 260 дней экспозиции с RAN экстракта с известью в костном мозге, пищевода и желудка клетки мыши, а также от опухолевых клеток желудка. (Б) Представительные цитограммах аннексина V в сравнении интенсивностей флуоресценции PI, как определено с помощью анализа методом проточной цитометрии в мышиных пищевода и желудка клетки после того, как 260 дней экспозиции с RAN с известью и с опухолевыми клетками желудка. В пределах цитограмме, квадрант 1 и 2 представляют собой ранние и поздние апоптотических клеток соответственно; квадрант 3, жизнеспособных клеток; квадрант 4, мертвые клетки. (C), вестерн-блоттинга для апоптотических маркеров в нормальных клетках (необработанный) и желудка опухоль. β-актина использовали в качестве контроля нагрузки.
Интересно, что Цитометрический анализ опухолевых клеток, собранных от мышей, разработанной опухоли в желудке после того, как 220 и 256 дней непрерывного administeration из RAN и извести, показали значительное снижение G1 клеток с сопутствующий рост в суб-G1 клеток (6А). Двойное окрашивание указывает на то, что суб-G1 клетки в основном некротических мертвые клетки (квадрант 4) (Рисунок 6B). Значительно более высокий уровень р53
и Bax
белков наблюдали в опухоли, чем нормальные клетки желудка (рис 6в). Тем не менее, было установлено, что отсутствует в обеих клетках опухоли желудка ППА
хотя ППА
и его 29 кД расщепляется продукт присутствовали в нормальных образцах желудка (фиг.6С).
Обсуждение
настоящего времени было проведено исследование, чтобы увидеть, если вволю
administeration из RAN экстракта с или без извести в питьевой воде может вызвать пищевода или желудка рак у мышей и если он делает то, что начальные процессы вовлечены. В этом исследовании мыши получали всю RAN-экстракта и без извести для того, чтобы имитировать человеческий стиль потребления RAN. Кроме того, доза была также периодически увеличена, как это происходит с человеком. Наши результаты показали, что оба заливались и без извести вызывают рак желудка, хотя, следует отметить, что наличие извести с RAN способствует более высокой трансформации клеток и, таким образом, развился рак желудка раньше, чем RAN в одиночку. Оказывается, что рак был вызван в желудке из-за большего воздействия его подкладка должна была RAN в то время как пищевод подкладка была разоблачена лишь на короткое время пить RAN смешанной воды.
Было показано ранее, что щелочной рН идеально подходит для генерации ROS автоокислительной из ареки-ореховых полифенолов [6, 7]. Было также показано, что катехин фракция экстракта ареки ореха активно генерирует ROS при щелочном значении рН, которое индуцирует повреждение ДНК в пробирке
[21, 22]. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Экспрессия эндонуклеазы варианта LINE-1 при раке желудка: его связь с клинико-патологическими parameters
• Гастропротекторного механизм Paederia Foetida Линна. (Мареновые) - популярный съедобных растений используется племе…