Dušikov oksid-endogeni inhibitor lučenja želučane kiseline u izoliranim humanim želučanim žlijezdama

Dušikov oksid-inhibitor endogenog izlučivanja želučane kiseline u izoliranim humanim želučanim žlijezdama pregled apstraktna pregled Pozadina pregled endotelne sintaze dušikovog oksida (eNOS) je ranije nađena u žljezdanog dio ljudskog želučane sluznice. Nadalje, dušikov oksid (NO) je pokazano da utječe na sekreciju želuca na različitim modelima životinja. Ova studija je provedena kako bi se istražiti utjecaj egzogeno i endogeno izvedeni NO na histamine- i kamp-stimulirane sekrecije želučane kiseline u izoliranim ljudskim oxyntic žlijezde.
Metode
Oxyntic žlijezde su izolirani iz ljudskog želučanog biopsijama i naknadno su pre tretiranih s donora NO i dušične inhibitora oksid sintaze, a zatim izložene na histamin ili dibutyryl-cAMP (db-cAMP). Izlučivanje odgovor žlijezde je određena kao nakupljanje [ 14C] aminopyrine. Pregled rezultata
izlučivanja histamine- ili db-cAMP inducirani kiseline je prigušen pomoću L-arginin, poznatog izvora endogene NO , a također i NO-donatori natrij nitroprusid (SNP) i s-nitrozo-N-acetil-penicilamin (SNAP). Prethodna obrada s bilo kojim od inhibitora NOS N G-nitro-L-arginin, metil ester (L-NAME) ili N G-nitro-L-arginina (L-nna) poboljšana sekretorni odgovor.
Zaključak
Naši rezultati pokazuju da NE inhibira izlučivanje želučane kiseline u izoliranim ljudskim želučanih žlijezda, te da postoji endogeni formiranje NO unutar žljezdanog epitela u blizini parijetalni stanice.
Pozadina
dušikovog oksida (NO) je proizveden iz L-arginina u reakciji koja je katalizirana enzimom sintetaze dušičnog oksida (NOS) [1, 2]. NO je važna biološka signalna molekula koja utječe na protok regulira vaskularnu tonusa glatke muskulature i moduliranje sistemskog krvnog tlaka. Nadalje, NO je uključen u transmisije; to je ključni faktor u upalnom odgovoru i imunitet [3-5]; te je pokazano da pokazuju pozitivan učinak na sluznice, dodavanje u gastrointestinalnom sustavu. U nekoliko studija (za pregled, vidi [6]), kemijski izazvanog oštećenja za sluznicu kao da se smanjiti istovremenim dodavanjem NO i smanjene uklanjanjem NO iz želučane sluznice. Objašnjenje za tim nalazima može biti da NO povećava protok krvi za sluznicu [7], te je sugerirano da je NO povećava oslobađanje sluzi [8]. Vjerojatno je da NO je uključen u regulaciju drugih sekretornih procesa u gastrointestinalnom sustavu. Takeuchi i suradnici [9] su izvijestili da NE inhibira izlučivanje dvanaesnika bikarbonata, dok su drugi istraživači predložila da bikarbonat izlučivanje stimulira NO [10, 11]. Osim toga, nekoliko studija ukazuje da NO utječe na sekreciju želučane kiseline [12-16].
Životinjama dali oprečne informacije o interakciji NO i izlučivanja želučane kiseline. Na primjer, in vitro studije su pokazale da NO stimulira lučenje želučane kiseline kod miša [17, 18] i Bullfrog [19]. Osim toga, slični rezultati su dobiveni u pasa [12]. Međutim, druga istraživanja su pokazala da NO inhibira izlučivanje želučane kiseline u štakora [13, 14], u želučanim žlijezdama izoliranim iz kunića [15] i u sluznicu sa žaba [16]. Studije ljudi su dali podatke koji ukazuju da NO može i spriječiti i povećati intragastričnu pH [20, 21], ali to još nije poznato kako je ovaj spoj sudjeluje u lučenju želučane kiseline kod ljudi.
U ranijem istraživanju pronašli smo morfološka podrška koja endogenog NO igra važnu ulogu u regulaciji funkcije parijetalni stanica [22]. Također, imunohistokemijski podaci iz tog istraživanja ukazuju na prisutnost endogenih NOS u epitelnim stanicama normalnog ljudskog oxyntic sluznice, točnije, u oba površinu sluznice stanice i endokrine stanice. Osim toga, mi smo opazili da su bliski kontakt između eNOS-pozitivnih stanica i parietalnim stanicama, bilo zbog toga što eNOS-pozitivne stanice u kontakt parietalnim stanicama preko citoplazmatske postupcima ili su invaginated pomoću parijetalne stanice. Na temelju tih nalaza, zajedno sa kemijskim svojstvima NO, zaključili smo da NO izveden iz endokrinih stanice nalik može biti parakrina regulator izlučivanja želučane kiseline. U ovom istraživanju, naš cilj je bio provjeriti učinak egzogenog NO na histamine- i kamp-pojačanog izlučivanja želučane kiseline kod ljudi, ali i kako bi se utvrdilo da li endogeno izvedeni NO je funkcionalni učinak na ljudski parijetalni stanice.
Metode
Subjekti i etički odobrenje pregled dvadeset i četiri zdravih muškaraca starosti od 22 do 31 godina su regrutirani kao plaćeni volonteri. Kriteriji za odabir propisano je da su ispitanici morali biti slobodan od bolesti i ne bi trebao uzeti neke lijekove ili piti alkohol najmanje jednog tjedna prije ispita. Muškarci postili najmanje šest sati prije pregleda. Pregled ždrijela anestezija je izazvana lidokaina sprej (Xylocain ®, AstraZeneca, Södertälje, Švedska), nakon čega je rutinski gastroskopija je izvedena korištenjem Olympus GIF-100 endoskop. Patiti biopsija kliješta (Olympus FB 24K-1) se koristi da se uzorke tkiva iz jačeg zakrivljenja, neposredno na distalni fundusa. U svim predmetima, želučane sluznice čini se da je normalno, i makroskopski i histološki. Svi subjekti koji su negativni na Helicobacter pylori pregled infekcije u testu ureaza dah (Diabact ® UBT 50 mg 13C-urea, Diabact AB, Uppsala, Švedska).
Eksperimentalni postupci su odobreni od strane Regionalni Etičko povjerenstvo za ljudska Research na University Hospital, Linköping, Švedska (File br. 02-039), te su svi sudionici dali pristanak. pregled Sekretorni studija pregled Izolacija i inkubaciju želučanih žlijezda
aktualni eksperimenti bili temelju tehnike koja je prvi put opisan 1976. godine za primjenu u kunića in vitro [23] i sada je dobro poznato za neizravno određivanje lučenja želučane kiseline inducirane različitim stimulansima. U postupku izolacije želučanih žlijezda je prvobitno razvijen za životinjskog tkiva, ali je poslije rafinirana tako da se također može primijeniti na male količine ljudskog tkiva [24].
Ljudska oxyntic mukozne biopsije koji se koriste u našem istraživanju su oprane i pohranjuju ne više od 15 minuta u ledeno hladnu kisikom fiziološkoj otopini puferiranoj fosfatom (PBS). Uzorci tkiva su izrezati na manje komade s parom nožica i prenese kisikom (100% O 2) kolagenaze enzimske otopine (130.0 mM NaCl, 12,0 mM NaHCOj 3, 3,0 mM Na 2HPO 4, 3,0 mM K 2HPO 4, 2,0 mM MgSO 4, 1,0 mM CaClz 2, 0,1 mM N (alfa) -tosyl-L-lizin klormetil keton [ ,,,0],TLCK], 10 uM indometacina, 10 mM glukoze, 2 mg /ml humanog serumskog albumina [HSA; Sigma] i 1 mg /ml kolagenaze tipa IA [Sigma]). Smjesa se stavi u vodenu kupelj C 37 ° te je nježno miješa 120 minuta, nakon čega je većina tretiranih uzorka se razgrađuje, ostavljajući uglavnom izolirani želučanih žlijezda. Smjesa se nakon toga filtrira kroz 200 um meša. Izolirane žlijezde se isperu i ponovno suspendiraju u prethodno zagrijanog (37 ° C) respiratornog mediju (132,4 mM NaCl, 1,0 mM NaH 2PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 5,4 mM KCl, 5,0 mM Na 2HPO 4, 1,0 mM CaClz 2, 10 uM indometacina, 10 mM glukoze, i 2 mg /ml HSA). Žlijezde se zatim prebaci u bočice koje sadržavaju svježu respiratorne medij u koji se doda jedan od sljedeće: inhibitori NOS N G-nitro-L-arginin, metil ester (L-NAME, 1 mmol /L) ili ekvivalentne količine njegov biološki inaktivan enantiomera N G-nitro-D-arginin metil estera (D-ime); je inhibitor NOS N G-nitro-L-arginina (L-nna ​​0,1 mmol /L); bilo koji od dva donora NO natrijev nitroprusid (SNP, 1 mmol /l), a S-nitrozo-N-acetil-penicilamin (SNAP; 0,1 mmol /L); supstrat za proizvodnju endogenog NO, L-arginin (0,1 mmol /L) [15]. Sve suspenzije žlijezda, uključujući i one koje nisu stimulirane, inkubirani su u vibracijskoj vodenoj kupelji na 37 ° C tijekom 30 minuta, nakon čega smo dodali histamin do konačne koncentracije od 50 umol /L ili dibutyryl-cAMP (db-cAMP) kako konačne koncentracije 1 mmol /L. Kako bi se spriječilo propadanje cikličkih nukleotida, dodali smo 0,1 mmol /L 3-izobutil-1-methylxantine (IBMX) svim poticajima. Pregled Određivanje [14C] akumulacije aminopyrine omjer
uhodani način kojim se posredno mjerenje izlučivanja kiseline izolirane želučanih žlijezda je odrediti nakupljanje 14C-označenog aminopyrine (AP) u žlijezdama sebe iu supernatantu nakon centrifugiranja a zatim izračunati omjer između tih dviju vrijednosti (naziva se omjer AP) [23] , Ukratko, izlučivanje kiseline je stimulirano na 37 ° C tijekom 40 minuta, a nakon toga 0,5 uCi [ 14C] označen aminopyrine doda se u bočice, koje su dalje inkubirane na 37 ° C tijekom 90 minuta. Nakon toga, suspenzija žlijezda se prenese u prethodno osušenu i izvagani cijevi, koje su centrifugirane pri 4.000 okretaja u minuti tijekom dvije minute. Supernatant je uklonjen i prenese scintilacione bočice. Pelete (žlijezde) se suši na 100 ° C, a suha masa je određeno, i žlijezde su potom ponovno suspendirane u 0,5 mol /L NaOH na 60 ° C i prebaci u scintilacijske bočice. Radioaktivnost žlijezde i supernatant je određena u tekućem scintilacijskom brojaču (1214 Rackbeta, LKB), a omjer AP je izračunata pomoću slijedeće formule [24]: pregled gdje IGW je intraglandularne volumen vode (= 2 × suha masa žlijezde u mg). pregled Pozadina akumulacija AP uključena u vrijednostima koje predstavljaju sekretorni odgovor. AP omjeri za pozadinu i histamin-a db-cAMP-stimuliranih uvjetima razlikovala između pojedinaca. Dakle, za svaki predmet, utvrdili smo omjer AP za stimulaciju žlijezda i smatra se da je vrijednost biti 100% i koristi ga kao pojedinačni referentne vrijednosti. Sve vrijednosti su na temelju pojedinačnih analiza.
Statistikama
Podaci su analizirani znak testovima jedan uzorak usporedbom srednje vrijednosti pomoću Minitab ™ statističkog softvera. P vrijednosti manje od 0,05 smatra se značajnom. Pregled Imunohistokemija pregled Izolirani želučanih žlijezda od pet ispitanika su stavljene na napunjena Super Frost * /Plus predmetna stakalca (Menzel-Glaser, Njemačka), a zatim ispere s PBS i permeabiliziraju s 100 % etanola na -70 ° C tijekom 5 minuta. Nakon toga, stakalca su inkubirana na sobnoj temperaturi sa zečjim anti-NOS3 protutijelom (1: 1000, Santa Cruz Biochemicals) i zatim se temeljito ispere u PBS i inkubirani 1 sat sa biotiniliranim kozjim antizečjim sekundarnim antitijelom. Slajdovi gdje primarna protutijela su izostavljeni poslužio kao negativna kontrola. Rezovi su zatim ponovno ispere, te biotinilirano protutijelo detektirano izlaganjem 20 ug /ml Texas Red ® avidin (Vector Laboratories) tijekom 1 sata. Nakon tog tretmana, slajdovi su oprane i pokriju koristeći Vectashield medij ® montiranje. Nikon Eclipse ® E800 fluorescentni mikroskop s VFM EPI-fluorescentnom prilogu je korištena za ispitivanje i ocjenu slajdove. Bend-pass filter s rasponom valnih duljina od 520-560 nm, te dugogodišnji filtar sa cut-o valnoj duljini na 590 nm (za emitirane svjetlosti) korištene su za vizualizaciju Texas Red ® molekula.
Hematoksilinom i eozinskom bojenju pregled za morfološke procjenu, žlijezde su fiksirane na stakalca i obojeni s hematoksilinom Harris pet minuta i 0.5% eozinska Y za dvije minute. Svaki korak nakon čega slijedi ispiranje u vodi iz slavine.

• Nepotpune želuca metaplazija u djece s inzulin-ovisnog dijabetes melitusa i celijakije. Ultrastrukturalne study
• Izražavanje serumu Mir-20a-5p, neka-7a i Mir-320a i njihove povezanosti s pepsinogen u atrofični gastritis i karcinoma želuca: case-control study