Helicobacter pylori lipopolysaccharide Modifikatioun, Lewis antigen Ausdrock, an gastric Kolonisatioun sinn Cholesterol-ofhängeg

Helicobacter pylori VerfÜgung lipopolysaccharide Modifikatioun, Lewis antigen Ausdrock, an gastric Kolonisatioun sinn Cholesterol-ofhängeg VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Helicobacter pylori VerfÜgung hëlt speziell an Cholesterol a repräsentéiert et an der bakteriell Membran, nach wéineg ass iwwer Cholesterol d'Fro gestallt Rollen Ament bekannt. Mir Verglach phenotypes an VIVO VerfÜgung Kolonisatioun Fähegkeet vum H. pylori VerfÜgung ugebaut an enger definéiert, serum-gratis Wuesstem mëttelfristeg, F12 mat 1 mg /ml albumin 0 bis 50 μg /ml Cholesterol wouvun. VerfÜgung Resultater
Iwwerdeems Verdueblung Zäite vun Cholesterol, aner Verkaf phenotypic Ännerungen gréisstendeels bäim huet sech observéiert. H. pylori VerfÜgung Deformatioun SS1 zu definéiert mëttelfristeg ugebaut mat Cholesterol koloniséiert erfollegräich de Mo vun gerbils hierkommen SS1 ugebaut ouni Cholesterol ze colonize gescheitert. H. pylori VerfÜgung lipopolysaccharide weist oft Lewis X an /oder Y antigens. Ausdrock vun deenen déi ganz-Zell Elisa gemooss antigens war an Äntwert ze Wuesstem vun Deformatioun SS1, 26695, oder G27 zu Cholesterol Ofstand gestäerkt. Zousätzlech, electrophoretic Analyse vun lipopolysaccharide zu wëll Typ G27 an mutants den O-Ketten subtil réischt strukturell Changementer bannent der oligosaccharide Kär /Lipid A moieties. Dës Äntwerte vun Lewis antigen Niveauen an an lipopolysaccharide Profiler ze Cholesterol Disponibilitéit sech duerchaus spezifesch, well keng Ännerunge Plaz huet den Cholesterol duerch β-sitosterol oder Bile Salzer agesprong war. Stéierungen vun de Genen A phosphoethanolamine transferase α-glucosyltransferase oder Lipid Zeechesaatz Cholesterol hu keen Effekt op Lewis Ausdrock, nach op lipopolysaccharide Profiler, nach op der Cholesterol Réceptivitéit vun deene Wunnengen. Stéierungen vun der Lipid A 1-phosphatase Gentherapie den Effet vun Cholesterol op lipopolysaccharide Profiler Danton awer net seng Wierkung op Lewis Ausdrock. VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung Zesumme dës Resultater hindeit, datt Cholesterol Ausschöpfung zu aberrant Formen vun LPe féiert dat op dephosphorylation ofhängeg sinn vun Lipid A bei der 1-Positioun. A Meeschter um Modell fir d'observéiert Auswierkunge vun Cholesterol ass an déi mi Schrëtt vun lipopolysaccharide biogenesis an, onofhängeg diskutéiert, Presentatioun vun Lewis antigen op der Zell Uewerfläch, hänkt op Membran Zesummesetzung. Dës nei Experienz hindeiten, datt Cholesterol Disponibilitéit Genehmegungen H. pylori VerfÜgung fir seng Zell Enveloppe an Manéieren änneren datt Kolonisatioun vum Provider Otemschwieregkeeten zu VIVO VerfÜgung Impakt kann. VerfÜgung Background VerfÜgung Helicobacter pylori VerfÜgung ass eng absolut gratis Sproochenunterricht -adapted pathogen datt de Mënsch Mo. inhabits, ass virun allem am Famillen iwwerdroen, an huet kee Ëmwelt- pompelt bekannt. Chronescher Aids kann asymptomatic ginn oder féieren gastritis, oppent, oder gastric Kriibs. Ze etabléieren Wonn, muss d'Bakterie oennert duerch d'dono gastric unzekräizen iwwerlieft [1]. Et penetrates a riicht Residenz an d'Schutzpatrounin mucus futti, engem lipid- an Cholesterol-räiche Ëmwelt [2, 3]. Bannend dësen gratis Sproochenunterricht beschäftegt d'Bakterie enger Rei vu Mechanisme Provider immun Äntwert ze flüchten. VerfÜgung Lipopolysaccharides (LPe) op der Uewerfläch vun H. pylori VerfÜgung geännert ginn bestëmmte Mënsch Blutt Grupp antigens ze weisen, virun allem antigens Lewis X an Y [ ,,,0],4-7], a manner dacks H Typ 1, i-antigen, Blutt Grupp E, oder Lewis antigens a oder B [8-10]. Dës Fläch LPe antigens sinn néideg fir d'Opstelle vun Krankheet, well Mann- analyséieren defekt fir LPe O-antigen Synthes oder fir Lewis X /Y Ausdrock suergt Mais bis colonize [11-13]. Et ass evident, datt Lewis op der bakteriell Uewerfläch ausgedréckt antigens bäidroen onvergläichleche vun H. pylori VerfÜgung zu gastric epithelial Zellen [10, 14], an eng wichteg Roll an Otemschwieregkeeten tropism Leeschtung [15-17]. Gastric epithelial Zellen ausdrécklech och Lewis antigens [18, 19], proposéiert, datt den Affichage vun Lewis op der bakteriell Uewerfläch antigens als mimicry Strategie déngen kann. Ënnersichunge vun de Medeziner isolates [18, 20] an experimentell Aids an Déieren [21] ënnerstëtzen dës Roll fir bakteriell Lewis zu immun virleien antigens. Am Mënsch Wonn, hunn H. pylori VerfÜgung Lewis antigens un d'Gravitéit vun peptic oppent an duodenitis verbonne ginn [16, 22]. Aner wichteg Fonctioun vum H. pylori VerfÜgung LPe ass seng geännert Lipid enger Struktur, mat reduzéierter acylation a manner gelueden Gruppen wéi vun enterobacteria typesch ass [23]. Dës Lipid A Modifikatioune endotoxic an demagogesch Eegeschafte vum H. pylori VerfÜgung LPe (iwwer- [24]) minimiséieren. VerfÜgung während dësem Weekend ass en nonessential Nährwert fir H pylori VerfÜgung, wann et de Wuesstem an serum-fräi Medien ënnerstëtzt [ ,,,0],25, 26]. H. pylori VerfÜgung speziell Cholesterol an der bakteriell Membran verschaffe [27], well do eng limitéiert Zuel vun pathogenic an commensal Bakterien dorënner Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus VerfÜgung, Borrelia sp VerfÜgung., An Mycoplasma VerfÜgung [ ,,,0],28-30]. Cholesterol kann d'Membran vun dësen Organismen stäerken [30-32]. H. pylori VerfÜgung och Cholesterol α-glycoside eendeiteg Form [33, 34], an dat metabolite ka weider duerch acylation oder phosphatidylation geännert ginn [34]. Alpha-glucosylated Cholesterol subverts fir d'Bakterie zu enger Maus Modell immun Äntwert Provider, duerch Ennerdréckung vun phagocytosis a vun T Zell Aktivéierung [35]. Aner Chargen fir Cholesterol an Cholesterol metabolites an der bakteriell Membran nach lant gin. An dësem Rapport, weisen mir dat den biosynthesis vun lipopolysaccharide, dorënner Lewis antigen Ausdrock an LPe Kär /Lipid Eng Modifikatioun, déi vun der Disponibilitéit vun Cholesterol an de Wuesstem mëttelfristeg verännert ginn. Mir presentéieren Donnéeën ugëtt datt dësen Ännerungen an der Zell Enveloppe bedeitend der pathogen /Provider kann dÉxistenz vun engem Déier Modell vun Wonn Afloss kann. VerfÜgung Method bakteriell analyséieren a Wuesstem Konditiounen VerfÜgung analyséieren vun H pylori
abegraff d' Labo Deformatioun ATCC43504 (Quell: Australien), 26695 (UK), Medeziner isoléieren G27 (Italien [36], gëtt vum N. Salama), an d'Maus ugepasst Deformatioun SS1 (Australien; gëtt duerch Adrian Lee [37]). Bakterien sech op 37 ° C an enger microaerobic Atmosphär vu 5% O 2/10% CO 2 op Campylobacter Blutt Agar (CBA) haten. Bakterien sech all 2 bis 3 Deeg passaged, a fir net méi wéi 25 Deeg, genetesch sech ze minimiséieren. Fir Wuesstem an chemesch definéiert mëttelfristeg [26], huet Bakterien aus CBA an Otemschwieregkeeten Kultur Kréi inoculated mat Ham d'F12 (Gibco) mat 1 mg /ml Bovine serum albumin (fatty Seier-gratis, Fläch A7906), bezeechent uechter wéi definéiert mëttelfristeg. Liquid Kulturen goufen Dag vun dilution nees frësch mëttel- um initial Inhaltsverzeechnes vun 1-2 passaged × 10 6 /ml, an um Passage 3 bis 5 Zell Kultur Schouljoer Cholesterol benotzt (> 99%, Fläch) war bis F12 dobäi wéi eng stabil 10 × Salmiakgeescht 500 μg /ml Cholesterol an 10 mg /ml albumin verspreet wouvun, déi laut [38] preparéiert war. β-sitosterol (syntheteschen, 95%), Natrium taurocholate, Natrium glycocholate, β-estradiol, progesterone (all aus Fläch), dehydroepiandrosterone (Calbiochem), an β-coprostanol (Matreya): Déi folgend Medien Bausténg waren an wéi Manéier duerchgefouert . VerfÜgung Verdueblung mol goufen duerch liewensfäeg Zellen mat der Zell Titer Glo reagent (Promega) als validéiert an beschriwwen [39] quantitating während Logbuch Phase Wuesstem alles. Moosse vun Biomass als CFU, wéi bewosst FAQ, oder wéi ATP hunn all konsequent Resultater produzéiert. A Wäert vun 1 attomol ATP pro Zell [40] war fir Iddi Trip ugeholl. Méiglech inaccuracy vun dësem Wäert grondsätzlech net Interpretatioun vun Donnéeën Afloss. VerfÜgung Isogenic Gentherapie Pann vun Enregistréiere vun engem Campylobacter belaascht VerfÜgung Resistenz chloramphenicol erreecht goufen Element (cat VerfÜgung) laut der Strategie beschriwwen Chalker et al
[41]. Primers sech opmierksam gemeet sou wéi Haaptrei bannent oppen liesen Rummen ze viséieren, a sinn am Table 1. Fusion Hinnen alleguer Reaktioune mat der Hinnen alleguer Extender System (5Prime) enthale 2,3 nm all gelies-stilvoller Skelett, 50 μM primer, 1 × tuning gefiermt opgezielt, 1,25 mm zousätzlech MG ++, 0,2 mm all dNTP, a .01 U /μl polymerase. Fusion Zyklus ware wéi follegt: 94 ° C 2,5 min, 10 Zykle [94 ° C 15 sec, 45 ° C 60 sec, 68 ° C 60 sec pro KB], 25 Zykle [94 ° C 15 sec, primer-spezifesch TM 30 sec, 68 ° C 60 sec pro kB], final Extensioun 68 ° C 6-8 min. Fusion Produiten sech mat Pfx50 (Invitrogen) reamplified Quantitéit ze klammen, dann benotzt Dir sidd der Qiaquick Hinnen alleguer Offäll Kit (QIAGEN). Dru analyséieren sech fir 15 μg /ml mat 500 NG vun der Finale amplicon mat natierleche Wandel [42, 43] gefollegt vun Auswiel transforméiert 1 Dag op CBA ugebaut chloramphenicol mat 7-10 Deeg op CBA. Fir allelic Ersatz garantéieren, waren der entstoent analyséieren vun Hinnen alleguer vun der Frankräich DNA benotzt GoTaq (Promega) mat primers uginn an Table 1. Hinnen alleguer Strategie évaluéiert an Resultater sinn an Dorënner 1.Table 1 Primer Message gewisen. VerfÜgung primers fir allelic Stéierungen VerfÜgung engem
CAT fwd [41] zu GATATAGATTGAAAAGTGGAT VerfÜgung F5b VerfÜgung CAT rev [41] zu TTATCAGTGCGACAAACTGGG VerfÜgung cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga VerfÜgung cgtM3 VerfÜgung ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg VerfÜgung cgtM5 VerfÜgung CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt VerfÜgung cgtrev VerfÜgung ctctgatcgcttcttcataaact VerfÜgung pmifwd VerfÜgung atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg VerfÜgung pmiM3 VerfÜgung ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac VerfÜgung pmiM5 VerfÜgung CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac VerfÜgung pmirev VerfÜgung ttttgtctgttaaaatcatcatcaat VerfÜgung lpxE fwd VerfÜgung atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc VerfÜgung lpxEM3 VerfÜgung ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat VerfÜgung lpxEM5 VerfÜgung CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag VerfÜgung lpxErev VerfÜgung ttaaggctttttggggcttgtaaa VerfÜgung eptAfwd VerfÜgung ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3 VerfÜgung ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata VerfÜgung eptAM5 VerfÜgung CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca VerfÜgung eptArev VerfÜgung ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa VerfÜgung zousätzlech primers fir Confirmatioun vun der Gentherapie Stéierungen
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
aRespective Gentherapie Zuelen am ëffentlechen Datenbanken fir 26695 a G27 sinn wéi follegt zesummen: [cgt: hp0421, G27_952 VerfÜgung], [pmi VerfÜgung (rfbM VerfÜgung): hp0043, G27_38 VerfÜgung], [lpxE: hp0021, G27_20 VerfÜgung], [eptA:. hp0022, G27_21 VerfÜgung] VerfÜgung bRighthand Kolonn d'Stéchwierder primer Bezeechnung vun Dorënner benotzt Lëschte 1. VerfÜgung Dorënner 1 Hinnen alleguer Préifung vun allelic Pann an H. Deformatioun G27 pylori. Frankräich DNA vum Gene-erofgaangen G27 analyséieren bereet war folgenden dräi Passage ënnert chloramphenicol Auswiel, dann Implikatioune Hinnen alleguer wéi an all Schema gewisen. Primers Message sinn an Table 1. A. Stéierungen cgt entscheet. Fënnef Beispiller sinn aus siwen eenzelne clones gewisen, all déi sëlwecht Resultater vun de Bildschierm huet. B. Stéierungen pmi (rfbM). De ganze chloramphenicol-resistent Bevëlkerung war an all Ronn vun Auswiel, ouni clonal Auswiel passaged. C. Stéierungen lpxE an eptA. De ganze chloramphenicol-resistent Bevëlkerung war an all Ronn vun Auswiel, ouni clonal Auswiel passaged. VerfÜgung Gastric Kolonisatioun VerfÜgung Déieren Experiment vun der LSUHSCS Finanzpolitiker Déieren Care an Benotzt Comité ofgeseent goufen. Weiblech Persounen gerbils sech op normal iessen haten ad libitum VerfÜgung. Ze erhaalen motility, H. pylori VerfÜgung Deformatioun SS1 war Iwwernuechtung ënner microaerobic Konditiounen zu T75 Kréi cultured mat 40 wann et deck Frënn vum F12 mëttelfristeg mat 0,4 mg /ml albumin an 0 oder 50 μg /ml Cholesterol. D'motile planktonic Bakterien sech duerch centrifugation an resuspended zu isotonic Salins recoltéiert. Kolonie ze grënnen Eenheeten (CFU) waren an dëse inocula vun Serien dilution an di op CBA gemooss, an dës Mesure bestätegt selwecht Doséierung vun liewensfäeg Bakterien tëschent den zwou Wuesstem Konditiounen. Ongeféier 10 8 CFU pro 30 μl goufen telefonesch an Déieren uginn (n = 6 bis 9 pro Grupp). Déieren sech 11 Deeg méi spéit euthanized, a Mamm goufen ofgegruewen an Leschten. H. pylori VerfÜgung präsent an gastric antrum homogenates sech duerch Serien dilution an di op CBA quantitated mat 5-fluorocytosine (5 μg /ml), vancomycin (10 μg /ml), amphotericin B (5 μg /ml), bacitracin ( 30 μg /ml), polymyxin B (10 U /ml), an trimethoprim (10 μg /ml) [44]. Zweete sech fir Multiple dilutions vun all Otemschwieregkeeten Prouf CFU alles gemaach. VerfÜgung Lait-Zell Elisa VerfÜgung Standard Prozeduren [6, 7, 45], huet sech fir de Gebrauch vun peroxidase conjugated Secondaire antibody ugepasst. All antibodies sech aus Calbiochem kritt. Iwwernuechtung Kulturen vun Bakterien sech fir 10-15 min duerch centrifugation bei 3500 × g VerfÜgung gesammelt, an Dulbecco d'phosphate gefiermt Salins gewäsch, an repelleted bei 10.000 × g VerfÜgung fir 2 min, dann zu 15% resuspended glycerol /0,9% NaCl. D'Zell suspensions sech fir FAQ Inhalt assayed a bei -20 ° C gespäichert. Zell Echantillon bekannt Montanten vun FAQ wou sech an 50 mm Natrium bicarbonate /kënne pH séier verdënntem 9,55 an direkt an Wells vun enger Elisa Plack (ëmsou΅7) Verlobung. Placke waren zouene an Iwwernuechtung Frigoen, blockéiert dann fir 90 min op 3% albumin Bovine serum an der Feierbekämpfung gefiermt opgeléist déi 7,4 /0,1 M NaCl /0,1% w /v Tween-20 vun 0,1 M Natrium phosphate pH ofgeschloss. Primärschoul antibody, monoclonal anti-Lewis X (Signet Klon P12) oder anti-Lewis Y (Signet Klon F3), verdënntem 1: 500 zu wäschen gefiermt /1% BSA, war fir 2 Stonnen derbäi, déi véier Ännerunge vun wäschen gefiermt gefollegt. D'Première antibody, engem 1: 2500 dilution vun horseradish peroxidase-conjugated Geess anti-Maus IgM zu wäschen gefiermt /1% BSA, war déi véier Ännerunge vun wäschen Prellbock fir 90 min, gefollegt notéiert. D'chromogenic Realitéiten war 0,42 mm tetramethylbenzidine an 0,02% H 2O 2 an 50 mm acetate /citrate pH 5.5 [46]. No 15 Minutte bei Raumtemperatur war Reaktioun mat 1 /5. vol 2,5 N H 2SO 4, a Faarf ännert sech an eng Schossel Lieser bei 450 nm gemooss gestoppt. An negativ Kontrollen entweder Primärschoul oder Lycée antibody, oder mat Kolibakterie VerfÜgung Deformatioun HB101 agesprong fir H. pylori VerfÜgung omitting, Faarf änneren war negligible (A &Si besteet; 0,05). Niveau vun Lewis Y huet negligible (A &Si besteet; 0,1) an Deformatioun 26695 oder 43504, wéi Lewis sech X Besatzungszäit SS1 VerfÜgung Electrophoretic Analysë vun lipopolysaccharides VerfÜgung H. pylori VerfÜgung Kulturen gesammelt goufen wéi uewen beschriwwen, an gewäsch. Zell Pellets sech bei -70 ° C gespäichert. Zellen sech fir 10 min an 60 mm Tris HCl pH 6,8 mat 2% SDS bei 95-98 ° C lysed. Protein Inhalt war mat der bicinchoninic Seier assay (Pierce) gemooss. Echantillon vun Zell lysates zu gläiche FAQ Inhalt ugepasst goufen (1 mg /ml), duerno zu Reaktioune wou (final) 60 mm Tris HCl pH 6,8, 0,67% SDS, an 0,67 mg /ml proteinase K bei 60 ° C fir 2 Stonnen proteolyzed [47]. Fir electrophoretic artifacts eliminéiert wéinst der Präsenz vun Lipid /Nodeems investéiert, proteolyzed Echantillon waren mat waarmem phenol ofgebaut [48]. Kontroll Experimenter ubelaangt, datt all LPe Gruppen duerch de folgenden Extraktioun Prozedur wéint waren qualitativ an ouni Schold vu senge Politiker. Proteolyzed Echantillon waren mat 1 Volumen vun 90% meng phenol gemëscht a fir 20 min bei 70 ° C incubated. No hëtzen op 10 ° C fir 1 min, goufen d'Echantillonen fir 20 min bei 10 ° C, an der meng Phase gesammelt op 12.000 × g VerfÜgung centrifuged. D'phenolic Phasen sech mat 1 Volumen vun H 2O bei 70 ° C-du ausgebaut fir 10 min, an der centrifugation widderholl. D'kombinéiert meng dovu goufen zu 0,5 M NaCl ugepasst a mat 10 vol Ethanol an de Frigo Iwwernuechtung Preisen, dann bei 20.000 × centrifuged g VerfÜgung fir 20 min bei 10 ° C a Loft gedréchent. Sidd LPe Echantillon waren am Laemmli Prouf gefiermt [49] bei 95 ° C fir 5 min redissolved. Echantillon waren zu 15% polyacrylamide /0,9% bis minigels urea mat der Laemmli erauskomm gefiermt Formuléierung [49], an engem 5% stacking gelies mat 3,2 M applizéiert. No electrophoresis um 150 V fir 75 min, goufen gels entweder Iwwernuechtung fix fir Sëlwer staining [50] oder Membran Tris /glycine Transfermaart gefiermt benotzt fir polyvinylidenedifluoride transferéiert [51]. Blots sech Iwwernuechtung zu 3% Bovine serum albumin an 0,03% Nan 3 an der Feierbekämpfung gefiermt beschriwwen uewe fir Elisa gespaart. Primärschoul antibody (anti-Lewis X oder anti-Lewis Y, 1: 200) an engem Lycée antibody (peroxidase-conjugated Geess anti-Maus IgM, 1: 1000) huet zu wäschen gefiermt mat 0,5% BSA verdënntem. Colorimetric erkennen benotzt 3,3'-diaminobenzidine mat Gilsbuerg Opléisung [52]. Densitometry war mat de Public Domain Applikatioun Image J gesuergt, sinn op http:.... //Rsb Infoen nih Gov /Luxusartikelen VerfÜgung Resultater VerfÜgung Little ass bekannt iwwert d'physiologic Rollen vun Cholesterol an H VerfÜgung. pylori. Fir Äntwerte vun H. pylori VerfÜgung zu Cholesterol ermëttelen, adoptéiert mir eng definéiert, serum-gratis Kultur mëttelfristeg, F12 mat 1 mg /ml albumin, an deem Bakterie kënnen stably passaged ginn [26]. Dësem modeste Konzentratioun vun albumin boosts Wuesstem [25, 26] an alleviates der knapper onvergläichleche fir Kultur Fläch, déi zu FAQ-fräi Medien iwwerhaapt [53]. An dëser definéiert mëttelfristeg, nieft vun 50 μg /ml Cholesterol ofzeänneren huet net vill vum Taux (Dorënner 2). D'Feele vu Wuesstem Effekter ënner gewielt Kultur Konditiounen war avantagéis Enquête vun der gestallt Wichtegkeet vun Cholesterol an H. pylori VerfÜgung. Sou, konnte mir gastric Kolonisatioun vun gerbils vun Deformatioun SS1 ze vergläichen, datt am definéiert mëttelfristeg wouvun variéiert Montanten vun Cholesterol (Dorënner 3) cultured gouf. Eelef Deeg nom mëndlech inoculation, H. pylori VerfÜgung zu gastric antrum sech selektiv plated an quantitated. Contreras, goufen gerbils koloniséiert nëmmen duerch de Kulturen an Cholesterol-haltege mëttelfristeg ugebaut, awer net vun H. pylori VerfÜgung zu Cholesterol-gratis mëttelfristeg ugebaut (An all Experimenter, P &Si besteet; .0001 fir Verglach vun aloggen (CFU /g) tëschent Gruppe mat Student T-Test)-zwee tailed. Dofir, war Cholesterol e wesentleche Bestanddeel vun de Wuesstem mëttel- an Uerdnung H. pylori VerfÜgung Wonn an dëser Déier Modell ze etabléieren. Figur 2 Zousätzlech vun Cholesterol fir d'definéiert mëttelfristeg Afloss net H. pylori Taux. Parallel Kulturen vun all Efforten goufen Iwwernuechtung zu F12 /albumin (1 mg /ml) an dem Fehlen (oppen Baren) oder Präsenz (Festung Baren) vun 50 μg /ml Cholesterol ugebaut. Déi initial Populatioun Dicht huet 2 × 106 /ml. Verdueblung mol goufen vun de gemoossenen Eropgoe vun Biomass berechent. Wäerter gewisen vertrieden mengen ± Fils vum fënnef oder méi onofhängeg Miessungen. n VerfÜgung. Den VerfÜgung. Student an d'zwou-tailed T-Test fir pairwise Donnéeën awer kee statistesch Bedeitung. VerfÜgung 3 H. ouni Cholesterol ugebaut Dorënner pylori versoen gerbils zu colonize. H. pylori VerfÜgung Deformatioun SS1 war Iwwernuechtung zu definéiert mëttelfristeg ugebaut mat 0 oder 50 μg /ml Cholesterol. Gerbils goufen telefonesch mat 3,5 × 108 CFU (Experimenter A) oder 1 × 108 CFU (Experimenter B) inoculated. H. pylori VerfÜgung zu gastric antrum sech op 11 Deeg quantitated. All vertikal Bar duerstellt der mëttlerer vun zweete alles fir een Déier, an horizontal Linnen ginn d'Steiren fir all Behandlung Grupp. Wou sech keng Kolonien erholl, waren Wäerter wéi 5 × 102 CFU /g Otemschwieregkeeten opgeholl, déi geschate Limite vun erkennen. VerfÜgung Verschidden analyséieren vun H. pylori VerfÜgung Schatzkummer Differenze zu onvergläichleche fir Kultur Offshore folgende Passage zu Cholesterol, proposéiert hire Restaurant an hir Zell Uewerfläch Eegeschaften (Hildebrandt & McGee, Engels Observatioune). Aus deem Grond hu mir beschloss lipopolysaccharides, déi sécherlech de wichtegste Bestanddeel vun der Zell Enveloppe ze ermëttelen, an déngen der biologically wichteg Lewis antigens ze presentéieren. Mir ugestallten e gutt etabléiert ganzt-Zell Elisa Prozedur der predominant Lewis antigens, Lewis X an Y (Dorënner 4) zu quantitate. Am Aklang mat der Literatur [54, 55], Haaptsaach war zu Deformatioun 26695, nogewise Lewis X nëmmen war Lewis Y an SS1 erwëscht, a wesentleche Niveau vun zwee waren am G27 fonnt. An all Fall, sech nonlinear absorbance Moossungen mat Respekt Laaschten op Prouf, en Evenement, dat net ongewéinlech an Elisa assays [56] ass, an dass déi aner Enquêteuren benotzt dëse selwecht monoclonals [7] uginn ass. Sou, an fir antigen Niveauen am Echantillon vun H. pylori ze vergläichen VerfÜgung cultured am Unterrecht oder Präsenz vun Cholesterol, standing mir parallel titrations iwwer eng Rei vu Prouf loadings vun 20 bis 500 NG vun Zell FAQ pro gutt verännerlech. Dës titrations reproducibly engem markéiert Erhéijung vun der Quantitéit vun Lewis X an /oder Lewis Y antigen op der Zell Uewerfläch fonnt zougedréckt wann H. pylori VerfÜgung analyséieren 26695, SS1 oder G27 huet cultured an der Präsenz vun Cholesterol (Dorënner 4). An behaapten onofhängeg Experimenter, goufen d'mengen Cholesterol-ofhängeg Erhéijunge statistesch relevant (Table 2). Vergläichbar Resultater hun och fir Lewis X zu Deformatioun 43504 kritt gouf (Donnéeën net gewisen). Spiking Echantillon mat Cholesterol um Enn vun der Wuesstem Period huet de Montant vun Lewis antigen net ofzeänneren vun Elisa (Dorënner 5A) fonnt. An anere Kontroll Experimenter ubelaangt mir fir all véier vun dësen analyséieren dass de Montant vun Zell FAQ fir d'Wells gebonnen duerch Wuesstem an Cholesterol (Dorënner 5B) onberéiert war. D'Elisa Resultater also etabléiert, datt fräi Surface Ausdrock vun Lewis antigens war eng legitim biologescher Äntwert ze Cholesterol datt getest an all de analyséieren opgetrueden. Dës Äntwert war spezifesch fir Cholesterol, well Wiessel vun Cholesterol an de Wuesstem mëttelfristeg mat strukturellen analogs β-sitosterol oder Natrium taurocholate keen Effekt op Lewis X oder Y Ausdrock vum G27 hat (Dorënner 4, righthand Brieder, an Table 3). De Lewis antigen Äntwert ze Cholesterol blouf nach no Stéierungen vun der Gentherapie fir Cholesterol α-glucosyltransferase (cgt VerfÜgung) zu Deformatioun G27 (Table 2, an ënnert gesinn) an zu 26695 (Donnéeën net gewisen), besteet aus der Participatioun vun α -glycoside metabolites vun cholesterol.Table 2 Opléisung vun Zell Uewerfläch Lewis antigen Ausdrock vun de Wuesstem vun de Kulturen an der Präsenz vun cholesterol.a VerfÜgung
fantastesch Hausse am Verglach zu parallel Cholesterol-gratis Kultur
zu Lewis X
Lewis Y
zu menge ± Sem (n)
P Wäert
mengen ± Sem (n)
P Wäert
26695 VerfÜgung 4,32 ± 0,36 (6) VerfÜgung 0,0002
net gemaach VerfÜgung SS1 VerfÜgung gemaach net VerfÜgung 1,88 ± 0.08 (5) VerfÜgung 0,0004
G27 wëll Typ VerfÜgung 2,85 ± 0.42 (8) VerfÜgung 0,0033
2,22 ± 0.24 (8) VerfÜgung 0,0016
G27 cgt :: cat
3,69 ± 0,34 (5)
0,0013
2,88 ± 0.30 (5) VerfÜgung 0,0034
G27 lpxE :: cat VerfÜgung 2,59 ± 0,50 (6)
0,025 VerfÜgung
2,47 ± 0.43 (7) VerfÜgung 0,014
sech zu hinne ganz-Zell engem Lewis antigens μg quantitated Elisa ugebaut /ml Cholesterol an der Presenz oder Feele vu 50 vun vläit Echantillonen analyséiert. D'antigen Laaschten huet 300 NG bewosst FAQ pro gutt. Nennen fir plus: Minus Cholesterol sech aus zweete Goal absorbance Moossungen zu all assay berechent, an an fënnef bis aacht onofhängeg Elisa leeft alles nennen sech dann averaged. P Wäerter sech zu zwee-tailed Student T-Tester fir d'automatesch Hypothes berechent, datt d'Verhältnis fusionnéiert 1. VerfÜgung Table 3 Geographie Zell Uewerfläch Ausdrock Lewis antigen ass Cholesterol-spezifesch VerfÜgung zu fantastesch Hausse am Verglach zu parallel Cholesterol-gratis Kultur
zu Lewis X
Lewis Y VerfÜgung
zu menge ± Sem (n)
P Wäert
mengen ± Sem (n)
P Wäert
VerfÜgung Cholesterol VerfÜgung 2,96 ± 0.22 (5) VerfÜgung .0008
2.48 ± 0.10 (4) VerfÜgung .0007
β- sitosterol VerfÜgung 1,80 ± 0,47 (4) VerfÜgung 0.19
1.19 ± 0.13 (3) VerfÜgung 0,28
taurocholate VerfÜgung 0,64 ± 0.16 (4) VerfÜgung 0,12
0,84 ± 0.20 (3) VerfÜgung 0,52
Lewis antigens sech zu hinne ganz-Zell Elisa Analysë vun pairwise Kulturen vum H. pylori VerfÜgung G27 ugebaut an der Presenz oder Feele vun 130 μM Cholesterol, oder eng quantitated selwecht Konzentratioun vun β-sitosterol oder Natrium taurocholate. D'antigen Laaschten huet 300 NG bewosst FAQ pro gutt. Nennen fir plus: Minus Cholesterol sech aus zweete Goal absorbance Moossungen zu all assay berechent, an an dräi bis fënnef onofhängeg Elisa leeft alles nennen sech dann averaged. P Wäerter sech zu zwee-tailed Student T-Tester fir d'automatesch Hypothes berechent, datt d'Verhältnis fusionnéiert 1. VerfÜgung Dorënner 4 Wuesstem zu Cholesterol verbessert speziell Zell Uewerfläch Affichage vun Lewis antigens. Ganz Zell Elisa assays op Echantillon vun H. pylori VerfÜgung Deformatioun 26695 (uewen lénks) gesuergt huet, SS1 (ënnen lénks), oder G27 (uewen an riets ënnen). Parallel Kulturen sech Iwwernuechtung zu definéiert mëttelfristeg ugebaut mat 130 μM vun de folgende Bausténg: Kreeser, keng zousätzlech; Felder, Cholesterol; triangles, β-sitosterol; X, taurocholate. Verännerlech Montanten vun Ophiewe Zell ze bekannt Montanten vun bewosst FAQ entspriechend waren applizéiert Wells vun Elisa Telleren ze zweete, an immunoassayed fir d'Präsenz vun Lewis X oder Lewis Y antigen wéi zu menge VerfÜgung beschriwwen. Negativ Kontroll Echantillon vun Kolibakterie VerfÜgung HB101, oder gefiermt-nëmmen Coordonnéeën, Spillzich op der agekreest Linn. Absorbance Moossungen fir eenzel Wells sinn opgezeechent. Widderhuelen Experimenter mat dräi oder méi onofhängeg erwuesse Kulturen hunn geing Resultater Kriseperiod. VerfÜgung 5 Elisa Kontroll Experimenter Dorënner. A. Spiking mat Cholesterol um Enn vun der Wuesstem Period stellt ofzeänneren net Lewis antigen Ausdrock. Kulturen vum H. pylori VerfÜgung sech Iwwernuechtung zu definéiert mëttelfristeg ouni (Kontroll) oder mat 50 μg /ml Cholesterol (Cholesterol ugebaut) ugebaut. Eng drëtt flask (Cholesterol jo) war an der Feele vu Cholesterol, ausklénge op Äis, an enger gläichwäerteger Montant vun Cholesterol derbäi war ugebaut, ier d'Zellen gesammelt goufen. Lewis antigens waren am zweete vum ganze-Zell Elisa, Luede 300 NG bewosst FAQ pro gutt quantitated. Nennen fir plus: Minus Cholesterol sech aus der Moyenne net absorbance Moossungen zu all assay berechent, an der Komplott weist mengen nennen ± Sem fir dräi bis fënnef onofhängeg Elisa leeft. P Wäerter sech zu zwee-tailed Student T-Tester fir d'automatesch Hypothes berechent, datt d'Verhältnis fusionnéiert 1. Fir Vergläicher Fortgeschratten NS, P > .05. B. Domat bindend vun Zellen ze Elisa Placken. Echantillon vun H. pylori VerfÜgung datt an parallel Kulturen an dem Fehlen (wäiss Baren) oder Präsenz vun 50 μg /ml Cholesterol (gro Baren) sech un multiwell Telleren an déi selwecht Aart a Weis applizéiert wéi fir Lewis antigen Elisa assays ugebaut goufen, andeems 500 NG vun bewosst FAQ pro gutt. No Iwwernuechtung ausdrécken, goufen Wells zweemol mat Dulbecco d'phosphate-gefiermt Salins gewäsch, dann FAQ zu Operstéiungszeen Zellen war d'BCA reagent quantitated benotzt. Mengen Wäerter ± Fils vum quadruplicate Wells sinn gewisen. VerfÜgung Detektioun vum Lewis X an Y déi mat der selwechter monoclonal antibodies immunoblotting enger anerer Resultat produzéiert (Dorënner 6). An e puer Versich dëser Technik benotzt, hu mir net all Cholesterol-ofhängeg Ënnerscheeder am Lewis X oder Y Niveauen, ofgesi vun enger klenger Erhéijung vun Lewis X zu 43504 nogewisen, datt nëmme liicht bedeitendst war. D'blotting Prozedur LPe Echantillon vun Zell lysates, an am Prinzip soll de ganze bewosst Lewis antigen Pool entdecken ofgebaut agestallt, Coursë vum ganze-Zell Elisa Method konzipéiert ass nëmmen ze erkennen, dass op der extracellular Uewerfläch presentéiert. D'interessant Differenz zu Resultater tëscht eisen Elisa analyséiert a immunoblots mobiliséiert enger Verännerung bewosst compartmentation vun de Lewis antigen je op d'Disponibilitéit vu Cholesterol an de Wuesstem mëttelfristeg. Figur 6 Lewis X an Y antigen profiling vun immunoblotting. Echantillon vun LPe vom parallel Kulturen an d'Feele ugebaut (-) oder Präsenz (+) vun 50 μg /ml Cholesterol waren op 15% urea gels geléist. Volume pro Geschäftswelt iwwerlaascht, wéi μg vun initial lysate FAQ, sinn um Top vun all Geschäftswelt entscheet. Nom Transfert, goufen antigens mat monoclonal antibodies spezifesch fir Lewis X (ieweschte Rot) oder Lewis Y (ënneschten Rot) immunodetected. E Vertrieder Beispill vun all ass gewisen. Side Richtung enthale prestained FAQ lues (M) oder 400 NG vun Kolibakterie VerfÜgung O111: B4 LPe. Antigenic Signal wossten nëmmen an der O-Ketten Regiounen vun dëse H. pylori VerfÜgung analyséieren; eidel Gebidder goufen no soudatt eraus. D'immunoblots sech onofhängeg mat e puer Prouf baut Rollenger, a war densitometry benotzt fir antigen Signal an all Geschäftswelt quantitate. Nennen fir pairwise plus: Minus Cholesterol Echantillon waren berechent, an déi mengen nennen ± Sem fir (n) blots sinn am bloen kritt. Déi automatesch Hypothes, datt d'Verhältnis fusionnéiert 1 an eng zwee-tailed Student T-Test bewäert huet. VerfÜgung Nieft Lewis antigen Miessung, am Verglach mir direkt d'lipopolysaccharide Profiler tëscht parallel Kulturen a Presenz oder Feele vu Cholesterol ugebaut, gelies benotzt electrophoresis a sëlwer staining. An all de analyséieren VerfÜgung H. pylori mir iwwerpréift hunn, waren LPe Band Profiler identesch tëscht de Kulturen an definéiert mëttelfristeg mat Cholesterol fir dass zu serum-haltege mëttel- oder op Blutt Agar kritt ugebaut (Donnéeën net gewisen), a wéi erwaart [5 , 24, 55, 57] dës Profiler sech duerchaus Deformatioun-spezifesch. Op dës gels, Cholesterol-responsiven LPe Gruppen waren déi kloer fir de Klischee G27 geléist, e Medeziner isoléieren (Sauerdall 7, 8).

• D'Déngscht vun cytokeratins 7 an 20 (CK7 /20) immunohistochemistry an der Ënnerscheedung vu kuerzen-Segment Barrett esophagus aus gastric intestinal metaplasia: Ass et verléisslech
• D'Aféierung vun engem PH-senisitive gelies verbessert Stabilitéit microemulsion fir d'cibléiert Entfernung vun colonic ammonia