Characterization vun der Gentherapie Ausdrock Profiler fir verschidden Zorte vu Mast hinzeginn Zellen aus Maus Mo. subregions duerch eng RNS amplification method

Characterization vun der Gentherapie Ausdrock Profiler fir verschidden Zorte vu Mast Zellen hinzeginn aus Maus Mo. subregions duerch eng RNS amplification Method VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Mast Zellen (MCS) Leeschtung dréien Rollen an Allergie an Leitmotiv excellence an aus heterogenous subclasses. Allerdéngs, d'molekulare Basis déi verschidden Elementer vun dëse multiple MC subclasses Bestëmmung ongeklärten bleift. VerfÜgung Resultater VerfÜgung dëser Fir Approche, entwéckelt mer eng Method vun RNS Extraktioun /amplification fir intakt zu VIVO VerfÜgung MCS aus gefruerenem Otemschwieregkeeten Rubriken hinzeginn , erlaabt eis, déi d'global Gentherapie Ausdrock Muster vun hinzeginn MCS gehéiert zu der selwechter Ënnerklass ze kréien. MCS sech aus der submucosa (sMCs) an mucosa (mMCs) vun Maus Mo. Rubriken isoléiert sinn, goufen 15 Zellen hinzeginn, an hir RNS war ofgebaut, Kick an zu microarray Analyse ënnerworf. Bekannt Bewaacher Genen spezifesch fir mMCs an sMCs zougedréckt Ausdrock Trends erwaart, déi besot Richtegkeet vun der Analyse. VerfÜgung Mir identifizéiert 1.272 Genen vill verschidden Ausdrock Niveau tëscht sMCs an mMCs weist, a kleng hinnen an Stärekéip op der Basis vun Ähnlechkeet vun hiren Ausdrock Profiler Verglach mat Schanken hiirgestallt-ofgeleet MCS, déi de cultured MCS mat sougenannten "Teenie 'Eegeschafte sinn. Ënnert hinnen, hunn mir déi verschidden Schlëssel Genen wéi Notch4 VerfÜgung haten SMC-Buergermeeschter Ausdrock an Ptgr1 VerfÜgung Britney-Buergermeeschter Ausdrock haten. Doriwwer eraus, et ass eng Differenz an der Ausdrock vu verschiddene Genen och extracellular Matrixentgasung FAQ Voleten, Haftung Molekülle, an cytoskeletal Proteinen tëschent den zwou MC subclasses, déi funktionell Adaptatioun vun all MC zu der mucosal oder submucosal Ëmwelt an de Mo. spigelen kann.
Conclusioun andeems se mat der Method vun RNS amplification aus hinzeginn intakt MCS VerfÜgung, zeechne mir déi verschidde Gentherapie Ausdrock Profiler vun sMCs an mMCs an der Maus Moo. Eis Conclusiounen Offer Iwerbléck méiglech onidentifizéierte Eegeschafte spezifesch fir all MC Ënnerklass. VerfÜgung Background VerfÜgung Mast Zellen (MCS) aus hematopoietic Stammzellen ofgeleet ginn a wichteg Roll an allergescher Äntwerte, Leitmotiv excellence an Ofwier géint Luucht Wonn Leeschtung. Anescht wéi aner Blutt Zellen, opgeholl MCS an Randerscheinung Stoffer als Teenie progenitors an differenzéiert an eeler Mast Zellen. Ee vun de wéinegen Charakteristike vun MCS ass, datt se eng Rei vu phenotypes weisen op de verschiddene Otemschwieregkeeten microenvironment vun hire maturation je [1]. An MCS, verschidde sinn MC-spezifesch serine proteases am secretory granules gespäichert, an hir Gene a FAQ Ausdrock sinn dramatesch verännert wann hir Zell Ëmwelt verännert ass. Zum Beispill, Reynolds et al. VerfÜgung hunn, datt a verschiddene Mast Zell Populatiounsschichte [2] zu verschiddene Kombinatioune ausgedréckt sinn op d'mannst sechs verschidde Membere vun Maus MC-spezifesch serine proteases gewisen. Ausserdeem hu rezent Studien gewisen dass eeler MCS variéieren hinsichtlech wat Uewerfläch kenne an Lipid mediators se auszedrécken [3, 4]. Well all Mast Zell Populatioun zu VIVO VerfÜgung eng spezifesch Roll am Kierper Leeschtung muss, ass et wichteg de Charakter vun all Awunner vun MCS ze bestëmmen. Aneneegräifend Gentherapie Ausdrock Analyse VerfÜgung ass e mächtege Approche der characterization vun verschiddenen MC ze verstoen subpopulations. Fir Datum, hunn e puer Studien op microarray Analyse vun MCS gehaal ginn [5-7], mä déi meescht vun hinnen traitéiert MCS cultured kënschtlech VerfÜgung. Geff Gentherapie Ausdrock Profiler vun MCS vom Haut an haett hunn analyséiert ginn [3, 8-10]. Allerdéngs, analyséiert Nummeren vun MCS als ee Beispill relativ héich waren a si waren zu kierperlech Kräften ausgesat, Enzymen an der anti-Kit antibody fir Offäll, während deenen d'Original Eegeschafte vun der MCS betraff gewiescht kann. VerfÜgung An der gastrointestinal TRACT, do sinn MCS datt haaptsächlech séiert an zwee subclasses sinn; mucosal MCS (mMCs) an submucosal MCS (sMCs) op der Basis vun hirer Lag, Wirklechkeet (Gréisst a Form) an granule Inhalter [11, 12]. mMCs sinn haaptsächlech an der mucosa vun der gastrointestinal System, dien chondroitin sulfate-haltege granules fonnt, déi mat toluidine bloe Kierchefënster sinn awer net safranin, an hir Aktivéierung existeiert während Luucht Wonn [13], während sMCs an der submucosa vun der gastrointestinal en der sidd TRACT an hir granules gi räich an heparin an Kierchefënster mat béiden toluidine blo an safranin [1, 11]. Allerdéngs, d'molekulare Basis d'Differenzen an biochemical Eegeschafte vun dësen zwou MC subclasses bleift ongewëss, deelweis wéinst der Schwieregkeet vun hirer Isolatioun bestëmmend. VerfÜgung dës Problemer ze iwwerwannen, hei etabléierten mer eng Method vun RNS amplification aus intakt MCS aus gefruerenem isoléiert Otemschwieregkeeten Rubriken, déi eis et erméiglecht, bis eng Kéier déi global Gentherapie Ausdrock Muster vun MCS zu verschidde Stoffer kréien. Fir dës Method validéieren, alles mir éischt de Minimum Zell Zuel néideg fir reproducible RNS amplification erreechen. Mir vergläichen dann d'Gentherapie Ausdrock Profiler vu kleng Zuel vun mMCs an sMCs an der Maus Mo kritt, an hunn e puer Schlëssel Genen speziell an eng Ënnerklass vun MCS ausgedréckt gin, déi e puer Aspekter vun der z'ënnerscheedde Eegeschafte tëschent den zwou MC subclasses spigelen kann an der gastrointestinal TRACT. VerfÜgung Resultater an Diskussioun VerfÜgung Entwécklung vun engem RNS amplification Protokoll Gentherapie Ausdrock Profiler vun engem klenge Betrag vun RNS ze kréien VerfÜgung mir fir Abléck an der funktionell Differenzen tëscht de verschiddene subclasses vun MCS gewannen, Employé dräi Ronne vun der T7-baséiert RNS amplification Method. Baséiert op der virleefeg Experimenter peritoneal MCS a Blutt hiirgestallt-ofgeleet MCS (BMMCs) benotzt, multiplizéiert mat mir, datt eng eenzeg MC 2 PG vun RNS noginn. Ier mer Komparativ Analyse vun MCS vun verschidden Stoffer gesuergt, évaluéiert mir éischt d'Genauegkeet an reproducibility vun dräi Ronnen vun der T7-baséiert RNS amplification Method, mat der Quantitéit vun RNS ugefaange dat aus engem eenzege MC kritt kann. Fir dës bewäerten, am Verglach mir éischter der microarray Resultater aus 5 μg vun BMMC RNS vun der Norm Protokoll mat deenen aus der selwechter RNS verdënntem 10 kritt virbereet kritt 5- oder 10 6-fantastesch (30 PG, 10 PG an 2 PG) an deen zu dräi Ronnen vun T7-baséiert amplification (Dorënner 1a-c). Teamchef souguer am Fall vun 2 PG RNS, luucht Komplott Analyse datt d'Qualitéiten vun der kritt Resultater tëscht dem Echantillon vun 5 μg ganz anescht waren an 2; Obwuel dräi Ronnen vun amplification genuch Quantitéit vun RNS fir microarray Analyse (20 μg >) Kriseperiod PG RNS. D'Genen als 'Präsenz' an zwou 30 PG Yogy an 5 μg vun RNS waren 8.149 Genen, déi zu 72% vun Genen gehéiert scho als 'Präsenz an der 5 μg vun RNS (11,344 Genen; Dorënner 1a), während nëmmen 4.116 Genen sech als 'Präsenz zu souwuel 2 PG an 5 μg vun RNS Sujet, deen als' Präsenz an de 5 μg RNS (Dorënner 1c) scho mat nëmmen 36% vun Genen gehéiert. De Verloscht vun der Zuel vun Genen als 'Präsenz' am verdënntem Echantillon (30 PG, 10 PG an 2 PG) scho kann während amplification fir de Verloscht vun niddereg Kopie Zuel RNS Arten wéinst ginn. Figur 1 Vergläicher vun dräi Manche-Kick Produite mat ganz klenge Quantitéite vu RNS Start. (E-c) Amplification biases an de Produkter aus enger klenger Quantitéit vun RNS Start. Luucht Diagramm vun Signal Intensitéit aus 5 μg vun BMMC RNS vun der Norm Protokoll an aus 30 PG (e VerfÜgung), 10 PG (b VerfÜgung) an 2 PG (c VerfÜgung) vun BMMC RNS bereet virbereet kritt vun dräi Ronnen vun amplification sinn gewisen. (D, e) Reproducibility vun der dräi-Ronn amplification vun enger klenger Quantitéit vun RNS. Luucht Diagramm vun Signal Intensitéit tëscht zwee onofhängeg Produite vu 30 PG vun BMMC RNS (BMMC 30 PG-1 an BMMC 30 PG-2) (d VerfÜgung) oder aus 2 PG vun BMMC RNS (BMMC 2 PG-1 an BMMC 2 PG-2) (E VerfÜgung), gi gewisen. Red dots weisen Studiebäihëllefe baut als "Präsenz" dorun, an Giel dots vertrieden Studiebäihëllefe baut scho als "Feele" zu souwuel flamenden Ofgrond. Blue dots weisen Studiebäihëllefe baut als "Präsenz" scho nëmmen zu entweder vill. D'Korrelatioun Ech (r) ginn. D'selwecht, véier-fantastesch kopéiert an Ennerdréckung Betrag sinn als diagonaler Linnen uginn. Genen als "Präsenz" scho Faarwe sinn an Gruppen zu pairwise entspriechend Iwwerlappungen am accordéiert Venn Diagrammer gewisen. VerfÜgung Mir iwwerpréift nächst der reproducibility vun der microarray Resultater aus zwee vun 30 PG BMMC RNS Echantillon kritt (30 PG-1 an 30 PG-2) oder zwee vun 2 PG Echantillon (2 PG-1 an 2 PG-2) (Dorënner 1d a 1e). An der 30. PG RNS Echantillonen, 7,537 (30 PG-1) an 8,777 (30 PG-2) Genen sech als 'Präsenz' Sujet. Mä nëmmen 4,324 (2 PG-1) an 4,460 (2 PG-2) Genen sech als 'Präsenz' Sujet an all 2 PG RNS Echantillonen, erëm proposéiert de Verloscht vun niddereg Kopie Zuel RNAs während amplification aus engem klenge Betrag vun RNS. Wéi zu der reproducibility, 86% vun der 'Präsenz' Genen an der 30. PG-1 an 74% vun 'Präsenz' Genen an der 30. PG-2 Prouf sech als 'Präsenz' an zwou 30 PG RNS Echantillon dorun, während nëmmen 57 % vun 'Präsenz' Genen an der 2 PG-1 an 55% vun 'Präsenz' Genen an der 2 PG-2 Prouf sech als 'Präsenz zu souwuel 2 PG RNS Echantillon Sujet. Dës Resultater ugeholl, datt d'Implikatioune Produiten aus der RNS aus enger eenzeger MC (ongeféier 2 PG) vun der aktueller Method kann bedeitend amplification artifacts och Problemer am Genauegkeet an reproducibility dauernd. Op der aner Hand, well vun der héijer reproducibility (> 74%), ofgeschloss mir dass amplification aus 30 PG RNS aus 15 MCS gesammelt fir d'praktesch Analyse vun Otemschwieregkeeten MCS gëeegent wier. Baséierend op déi Resultater, setzen mir eist Zil vun dëser Etude Gentherapie Ausdrock Profiler vun MCS aus verschiddene Regioune hinzeginn ze gewannen. Fir den Afloss vun Zell-ze-Zell Variatiounen an der selwechter Klass a Potential amplification artifacts minimiséieren, mir bereet dräi baut vun 15 MCS fir all Regioun an am Verglach Genen mat vill verschiddene Ausdrock tëscht MCS vun de verschiddene Regiounen (Dorënner 2b). Mir hate Mo wéi d'Quell Uergel, well mer zwou Zorte vun MCS vun der mucosa isoléieren kann (Britney) an der submucosa (SMC) Regioune vun der sëlwecht Rubriken, an mMCs an sMCs verdächtegt goufen an e puer MC Eegeschafte anescht gin wéi protease Ausdrock Profil an Empfindlechkeet op safranin staining [1, 11]. Figur 2 Gene Ausdrock Profiler vun sMCs an mMCs aus Mo. Otemschwieregkeeten. (En) Isolatioun vun toluidine blo-Kierchefënster MCS vun der submucosa (SMC; ieweschte Brieder VerfÜgung) an der mucosa (Britney; ënneschten Brieder VerfÜgung) vun Mo. Sektiounen. A SMC (Pfeil VerfÜgung) an Britney (arrowhead VerfÜgung) dass metachromatically mat toluidine blo virun microdissection (lénks Brieder VerfÜgung) Kierchefënster war verschwonnen no microdissection mat engem Suitte Pipette (riets Brieder VerfÜgung). Erausgoen VerfÜgung, 10 μm. (B) de Profil vun der experimentell Strategie. (C) gekennzeechent an fragmentaresch antisense RNAs vun dräi eenzel SMC Echantillonen, dräi eenzel Britney Echantillonen an de 'kee Zell "Echantillon sech zu engem Murine Singular hybridized. Luucht Diagrammer fir "nee Zell" (x Achs) an sMC1 (y Achs) (uewen lénks VerfÜgung), "kee Zell" (x Achs) an mMC1 (y Achs) (ënnen lénks VerfÜgung), sMC1 (x Achs) an sMC2 (y Achs) (ieweschte Zentrum VerfÜgung), mMC1 (x Achs) an mMC2 (y Achs) (ënnen Zentrum VerfÜgung), sMC1 (x Achs) an mMC1 (y Achs) (uewen riets
) ginn. D'Korrelatioun Ech (r) fir Verglach bannent sMC1-3, bannent mMC1-3 an tëscht sMCs an mMCs ginn als Mëttel ± S.D. Red dots weisen Studiebäihëllefe baut als "Präsenz" dorun, an Giel dots vertrieden Studiebäihëllefe baut scho als "Feele" zu souwuel flamenden Ofgrond. Blue dots weisen Studiebäihëllefe baut als "Präsenz" scho nëmmen zu entweder vill. D'selwecht, zwee-Weeër kopéiert an Ennerdréckung Betrag als diagonaler Linnen ugewise sinn. VerfÜgung Gene Ausdrock Profiler vun submucosal an mucosal MCS aus dem Mo VerfÜgung Fir ouni dauernd RNS ofgeschnidden am Mo. zwou Aarte vun MCS visualiséieren, huet de Sektiounen mat carnoy d'fixative fix a metachromatically mat toluidine blo fir e puer Sekonnen Kierchefënster. sMCs an mMCs sech microdissected engem Suitte Pipette (Dorënner 2a an 2b) benotzt. Mir bereet dräi baut vun 15 MCS fir all Regioun, ofgebaut hir RNS an individuell Implikatioune hinnen (SMC 1, SMC 2, SMC 3, an Britney 1, Britney 2, Britney 3). Fir d'Erhuelung vun der Reduktioun vun den kleng wéi 30 PG vun RNS verbesseren, mir benotzt "puer dovun G" als Numm, deen net mat de folgende RNS amplification oder hybridization vun den Kick Produit der Gamme (Donnéeën net gewisen) heescht Amëschung. Fir d'Auswierkunge vun nonspecifically Implikatioune äerdzougedréiter Säit Produiten iwwerpréifen, standing mir den RNS Extraktioun /amplification Prozedur ouni Schan microdissected Zellen ( "kee Zell") als negativ Kontroll (beschriwwen am "spontan a Methoden VerfÜgung"). Implikatioune RNAs vun sMCs, mMCs an der "nee Zell" Kontroll sech getrennt zu engem murine microarray hybridized. D'Signal Wäerter vun der "nee Zell" Prouf sech am Allgemengen an ähnlech zu Hannergrond Niveauen (Dorënner 2C) héich. D'luucht Diagramm vun der Echantillon onofhängeg am selwechte Grupp bereet (e.g. SMC 1 vs SMC 2) zougedréckt engem ähnleche Ausdrock Muster; der Moyenne Korrelatioun souguer gemaach fir all Studiebäihëllefe-besot huet 0,945 ± 0,004 an 0,893 ± 0,019 an sMCs an mMCs, bzw. (n VerfÜgung = 3). Am Géigesaz, huet den Duerchschnëtt Korrelatioun souguer gemaach tëscht sMCs an mMCs 0,752 ± 0.034 (n VerfÜgung = 3), déi wéi déi vill méi niddreg ass am selwechte Grupp, suggeréiert datt hir Gene Ausdrock Musteren verschidde sinn. VerfÜgung Mir weiderhin der Richtegkeet a reproducibility vun eiser Method déi aner iwwergräifend Analysë (Hierarchie Käre Analyse an Haaptuert Komponent Analyse [PCA]) mat all Studiebäihëllefe baut. Microarray Daten aus sMCs kritt, mMCs, Haut-ofgeleet MCS, peritoneal MCS, BMMCs an Net-MCS (macrophages a Här iwert mech selwer) sech un dësen Analyse applizéiert. Mir als éischt ob der amplification Prozess an eiser Method déi global Ausdrock Profil schellt wéinst Net-linear amplification. D'Resultater vun der BMMC Echantillon RNS vun der Norm Protokoll (BMMC-STD) oder déi amplification Method bereet benotzt (BMMC-amp) sech un dësen Analyse ënnerworf. Béid Hierarchie Käre Analyse an PCA Teamchef microarray Daten aus BMMC-STD an BMMC-verdeelen sech am selwechte Grupp Strooss (Dorënner 3A an 3B) suggeréiert datt de globale Ähnlechkeet an der Gentherapie Ausdrock Profiler während der amplification Prozess haten ass. Mir iwwerpréift nächst d'Ähnlechkeet vun Ausdrock Musteren an dräi onofhängeg SMC oder Britney Echantillon. Beim Käre Analyse an PCA, SMC 1-3 a Britney 1-3 sech am selwechte Grupp Strooss, bzw.. PCA zougedréckt och, datt d'Ausdrock Profiler vun sMCs, mMCs an BMMCs Géigesäitegkeet verschidde sinn (Dorënner 3B). Figur 3 Global Gentherapie Ausdrock Analyse vun SMC 1-3 a Britney 1-3. (En) Hierarchie Käre vun global Gentherapie Ausdrock vu verschiddene Preparatiounen vun MCS an Net-MCS. Dräi-Ronn Implikatioune Produite vun sMC1-3, mMC1-3, Haut MCS an BMMCs, an der Norm Produite vun BMMCs, peritoneal MCS, goufen macrophages a Här iwert mech selwer analyséiert. (B) D'Haapt Komponent Analyse (PCA) verréid verschiddene Gentherapie Ausdrock Profiler vun sMC1-3, mMC1-3, an zwee Préparatiounen vun BMMCs. Déi blo agekreest Feld beweist mMCs, de roude agekreest Feld beweist sMCs, an d'schwaarz agekreest Feld beweist BMMCs. VerfÜgung Mir Verglach dann de Mo-ofgeleet MCS (sMCs an mMCs) mat Haut-ofgeleet MCS, peritoneal MCS, BMMCs an Net -MCs (macrophages a Här iwert mech selwer) vun Analyse Käre. D'Otemschwieregkeeten-ofgeleet MCS (Mo MCS a Haut MCS) sech separat peritoneal MCS an BMMCs Strooss. Dës Resultater kënnen spigelen verschidden Eegeschaften tëscht Otemschwieregkeeten-ofgeleet MCS mat Firma Haftung fir d'Nopeschlänner Zellen an de Wénkel gekäppt MCS ouni engem knappen Kontakt. Wéi bis d'Ähnlechkeet vun MCS mam Här iwert mech selwer an macrophages, ass et räsonnabel datt Här iwert mech selwer aus MCS stäerkste wäit sinn an macrophages méi ze MCS als leukocyte Famill. VerfÜgung Validatioun vun microarray Resultater vun real Zäit RT-Hinnen alleguer Analyse VerfÜgung Mir nächst propagéieren ob der hybridization Signaler vun bekannt Bewaacher Genen spezifesch fir sMCs an mMCs der erwaart Ausdrock Trends zougedréckt [12, 14]. D'Britney-spezifesch Genen, Mast Zell protease 1 (Mcpt1 VerfÜgung) an 2 (Mcpt2 VerfÜgung) zougedréckt héich Wäerter an mMCs, iwwerdeems den SMC-spezifesch Bewaacher Genen, Mast Zell protease 4 (Mcpt4 VerfÜgung) an chymase 2 (Cma2 VerfÜgung), awer méi héich Signal Wäerter an sMCs (Table 1 an Dorënner 4A) [15-29]. Wéinst dem MC-gemeinsam lues wéi Kit oncogene (Kit VerfÜgung) an Fcε receptor (Fcer1a VerfÜgung) huet däitlech Signal Wäerter mat kee Westen tëscht mMCs an sMCs. Fir weider d'Resultater diskutéieren, gemooss mir den Ausdrock Niveau vun deene Bewaacher Genen vun real-Zäit RT-Hinnen alleguer mat RNS aus der onofhängeg isoléiert MCS (Dorënner 4B). Desweideren hu mir dräi Genen weist 'Britney-Buergermeeschter' Ausdrock an aner dräi Genen weist 'SMC-Buergermeeschter' Ausdrock ausgewielt ginn; Ausdrock vun dësen Genen vun MCS huet net virdrun (Dorënner 4A) gemellt ginn. Do ware keng grouss Ënnerscheeder an de Ausdrock Niveau vun Kit VerfÜgung an Fcer1a VerfÜgung tëscht mMCs an sMCs. Am Géigesaz, d'Britney-spezifesch lues Mcpt1 VerfÜgung an Mcpt2 VerfÜgung an der 'Britney-Buergermeeschter' Genen, Anxa10, Ctse VerfÜgung, an Erhëtzung VerfÜgung zougedréckt héich Ausdrock vun mMCs, an den SMC-spezifesch lues Mcpt4 VerfÜgung an Cma2 VerfÜgung an der "SMC-Buergermeeschter 'Genen, Cnn1, Ces3 VerfÜgung, an Cpe VerfÜgung zu sMCs héich Ausdrock gewisen. Dës Resultater weisen, datt d'microarray Resultater sinn verléisslech a spigelen der Gentherapie Ausdrock Profiler vun intakt sMCs an mMCs an de Moo. Figur 4 Validatioun vun de differentially ausgedréckt Genen tëscht sMCs an mMCs. (En) SMC-spezifesch (Cma2 VerfÜgung, Mcpt4 VerfÜgung), Britney-spezifesch (Mcpt1 VerfÜgung, Mcpt2 VerfÜgung) an MC-gemeinsam lues (Fcer1a VerfÜgung an Kit VerfÜgung) (lénks Kompletéiert VerfÜgung) a sechs ausgewielt Genen (Ces3 VerfÜgung, Cnn1 VerfÜgung, Cpe VerfÜgung, Anxa10 VerfÜgung, Ctse VerfÜgung an Erhëtzung VerfÜgung) (riets Rot VerfÜgung) uginn an de Vertrieder luucht Korrelatioun Grafike tëscht sMC1 an mMC1. D'selwecht, zwee-Weeër kopéiert an Ennerdréckung Betrag sinn, wéi eng giel, blo a rout Linn uginn, bzw.. (B) D'Ausdrock Niveau vun de Genen an (e) waren Kontrolle vun real-Zäit RT-Hinnen alleguer. Déi Wäerter vertrieden Verhältnis vu Familljemembere Ausdrock Niveau vun mMCs zu sMCs, a si als mengen ± S.D. dës (N = 3). D'Spezifizitéit vun der Hinnen alleguer Produit gouf vun gelies electrophoresis an Analys vun de Schmelze Temperatur confirméiert. Den Ausdrock Niveau vun all Gentherapie war bis 28s ribosomal RNS normalized. VerfÜgung Table 1. Satz vun Genen vun real-Zäit Hinnen alleguer Analyse iwwerpréift. VerfÜgung Gene Symbol VerfÜgung
Gene Numm
RefSeq ët ID
Referenz
Kit
Kit oncogene VerfÜgung NM_021099 VerfÜgung 15 VerfÜgung Fcer1a VerfÜgung VerfÜgung Fc Brochstéck vun IgE, héich Affinitéit ech, receptor fir α polypeptide VerfÜgung NM_010184 VerfÜgung 16 VerfÜgung Mcpt1
Mast Zell protease 1 VerfÜgung NM_008570 VerfÜgung 17, 18
Mcpt2
Mast Zell protease 2 VerfÜgung NM_008571 VerfÜgung 19 VerfÜgung Mcpt4
Mast Zell protease 4 VerfÜgung NM_010779 VerfÜgung 2, 20 VerfÜgung Cma2
zu chymase 2, Mast Zell (Mast Zell protease 10) VerfÜgung NM_001024714 VerfÜgung 14 * VerfÜgung Anxa10
annexin A10 VerfÜgung NM_011922 VerfÜgung 21 VerfÜgung Ctse
zu cathepsin E VerfÜgung NM_007799 VerfÜgung 22 VerfÜgung Erhëtzung
FBJ Kand besser oncogene VerfÜgung NM_010234 VerfÜgung 23 VerfÜgung Ptgr1
Prostaglandin reductase 1 (leukotriene B4 12-hydroxydehydrogenase) VerfÜgung NM_025968 VerfÜgung 24 (porcine) VerfÜgung Cnn1
calponin 1 VerfÜgung NM_009922 VerfÜgung 25 VerfÜgung Ces3
carboxylesterase 3
NM_053200 VerfÜgung 26 VerfÜgung Cpe
carboxypeptidase E VerfÜgung NM_013494 VerfÜgung 27 (Bovine) VerfÜgung Notch4
top Gentherapie homolog 4 VerfÜgung NM_010929 VerfÜgung 28 VerfÜgung 28s rRNA VerfÜgung 28s ribosomal RNS VerfÜgung NR_003279 VerfÜgung 29 VerfÜgung *, d'Haaptrei coding an dësem Pabeier presentéiert ass d'N-Kappgare gekierzt-Form vun Cma2 VerfÜgung, iwwerdeems de RefSeq " NM_001024714 "ass de komplette Haaptrei vun Cma2 VerfÜgung. VerfÜgung Käre Analyse vun der Gentherapie Ausdrock Profiler a funktionell categorization tëscht sMCs an mMCs VerfÜgung of der ~ 12.000 Genen op d'oligonucleotide vill vertrueden, ausgewielt mir 1.272 Genen deem Ausdrock Niveauen tëschent SMC 1-3 a Britney 1-3 ware vill verschidden (p VerfÜgung &si besteet; 0,05, Limma d't VerfÜgung Test). Den Ausdrock Niveau vun all Gentherapie war vun hiren Niveau zu BMMCs normalized, déi cultured MCS mat sougenannten "Teenie 'Eegeschafte, an der gewielter Genen huet Distriker Stärekéip séiert mat der k VerfÜgung -means Käre sind (CL1-7; Dorënner 5a an Weider Fichier 1). Mir séiert och d'Genen an funktionell Kategorien, an de Vertrieder Genen sinn (Dorënner 5b) opgezielt. Ënnert hinnen, 666 Genen (52.4%) zougedréckt SMC-Buergermeeschter Ausdrock (CL1-3 VerfÜgung); zu 78% (519 Genen) vun SMC-räiche Genen, den Ausdrock Niveauen sech relativ niddreg zu BMMCs an SMC Lamb (CL1 & 2 VerfÜgung). Zum Beispill, war den Ausdrock Niveau vun Mcpt4 VerfÜgung relativ niddreg zu BMMCs, a wann de Ausdrock Profil vun BMMCs den Teenie Eegeschafte vun MC progenitors iwwerleet, Mcpt4 VerfÜgung kann ofgeschloss ginn während der Finale maturation an sMCs entschlof ginn. Spannen, den SMC Bewaacher Genen Mcpt5 VerfÜgung an Mcpt6 VerfÜgung an CL2 /3 VerfÜgung séiert goufen, proposéiert, datt dës Genen gewëssermoossen ausgedréckt waren am "Teenie" BMMCs, mä hiren Ausdrock war während maturation an mMCs opgeléist. Wéinst dem 606 Genen (47.6%) zougedréckt Britney-Buergermeeschter Ausdrock (CL4-7 VerfÜgung); zu 51% (334 Genen) vum Britney-räiche Genen, hiren Ausdrock Niveauen am BMMCs sech niddereg mä sech zu mMCs Lamb (CL4 & 5 zur VerfÜgung). Zum Beispill, Ausdrock vun Mcpt1 VerfÜgung war niddereg am "Teenie" BMMCs awer drastesch während maturation an mMCs entschlof. Figur 5 Käre Analyse vun der Gentherapie Ausdrock Profiler tëscht sMCs an mMCs. (En) Vertriedung vun mRNA Ausdrock Niveau vun sMC1-3 an mMC1-3 Verglach mat BMMCs. D'Faarf vum Baren stellt d'Verhältnis vun Signal Intensitéit tëscht onofhängeg Echantillonen an BMMCs, laut der Skala op widdert Recht VerfÜgung gewisen. Genen mat vill verschiddene Ausdrock tëscht sMCs an mMCs (p VerfÜgung &Si besteet; 0,05, Limma d't VerfÜgung Test) sech ausgewielt (1,272 Genen) a kleng an 7 Stärekéip der k VerfÜgung -means sind (CL1-7 benotzt
). (B) Fonctionnement categorization vun Vertrieder Genen aus (e). VerfÜgung Protein Ausdrock vun Notch4 zu sMCs an Ptgr1 zu mMCs am Mo. Otemschwieregkeeten VerfÜgung Ënnert de Genen weist Ënnerscheed Ausdrock (Dorënner 5b), mir weider do op d'Expressioun vun Notch4 VerfÜgung zu sMCs an Ptgr1 VerfÜgung zu mMCs, souwuel vun deenen hunn ni zu MCS virdrun charakteriséiert ginn. D'Notch4 VerfÜgung Gentherapie Produit ass e Member vun der Famill eng top, aus transmembrane kenne déi Zell Uewerfläch ligands op bascht Zellen ageschalt ginn. Rezent Studien hu proposéiert, datt top sécher an lymphocyte an Mast Zell dat Équipe ass [30, 31]. Mir bestätegt éischt datt Notch4 VerfÜgung Ausdrock vill méi héich an d'getrennt hinzeginn sMCs wéi mMCs vun real-Zäit RT-Hinnen alleguer ass (Donnéeën net gewisen). Mir propagéieren nächst ob der Notch4 FAQ zu sMCs exklusiv präsent ass vun immunostaining vun Mo. Otemschwieregkeeten (Dorënner 6a). Notch4 Signaler waren am helle-wëll Strukture vun sMCs awer net zu deenen, déi vun mMCs fonnt. Ausserdeem, huet Notch4 Signaler och an d'Haut MCS fonnt, déi adjacently mat sMCs (Dorënner 3A) op der Strooss waren. Dës Resultater weisen, datt Notch4 zu sMCs präsent ass awer net am mMCs, a proposéiert dass Notch4 bedeelegt an SMC-spezifesch Transkriptiouns vun top-Zil- Genen, wat fir eng SMC Funktiounen néideg kann. An hematopoietic Zellen, ass et confirméiert, datt constitutively aktiv Notch4 d'Expansioun vun de Grënner Zellen promovéiert a bremst Servicer sinn dat [32]. Zanter top ligands zu connective Stoffer wéi Haut dermis ze existéieren [33] gewise goufen, ass et interessant ze wëssen, ob Notch4 eng Roll an de dat vun sMCs an den Ënnerhalt vun SMC Funktiounen spillt. Figur 6 Immunohistochemical Analyse vun Notch4 an Ptgr1 zu sMCs an mMCs am Mo. Otemschwieregkeeten. (En) Mo submucosa (sMCs; lénks Brieder VerfÜgung), Mo. mucosa (mMCs; Mëtt Brieder VerfÜgung) a Haut (Haut MCS; Recht Brieder VerfÜgung) Sektiounen mat enger Anti-Notch4 antibody Kierchefënster waren (ënneschten Brieder VerfÜgung) a mat toluidine blo (ieweschte Brieder VerfÜgung). sMCs mat der anti-Notch4 antibody an der gastric submucosa a Haut dermis Kierchefënster sinn duerch Feiler uginn. Nee staining war zu mMCs (arrowheads VerfÜgung) observéiert an de gastric mucosa en der. sMCs an mMCs sech metachromatically mat toluidine bloe Kierchefënster. (B) Mo submucosa (sMCs; lénks Brieder VerfÜgung) an Mo. mucosa (mMCs; Recht Brieder VerfÜgung) Sektiounen mat enger Anti-Ptgr1 antibody Kierchefënster waren (ënneschten Brieder VerfÜgung) a mat toluidine blo (ieweschte Brieder
). Nee staining mat der anti-Ptgr1 antibody war an der sMCs (Pfeil VerfÜgung) fonnt. Kleng Signaler waren an der mMCs observéiert (arrowheads VerfÜgung). sMCs an mMCs sech metachromatically mat toluidine bloe Kierchefënster. Erausgoen VerfÜgung, 25 μm (en, b). VerfÜgung D'Ptgr1 VerfÜgung Produit, 15-oxo-prostaglandin 13-reductase /leukotriene (dra) B 4 12-hydroxydehydrogenase ass eng wesentlech Aktivitéit fir inactivation vun eicosanoids wéi prostaglandin E 2 (PGE 2) an LTB 4 [34]. Obwuel et huet gemellt ginn, datt d'Weeër vun eicosanoid Synthes tëscht de verschiddene MC subclasses ënnerscheeden [1, 4], proposéiere eis Resultater datt d'inactivation System vun eicosanoids och ënnert den MC subclasses schwankt. Ptgr1 VerfÜgung Ausdrock fonnt huet bedeitend méi héich an d'getrennt hinzeginn mMCs vun real-Zäit RT-Hinnen alleguer (Donnéeën net gewisen). Mir iwwerpréift och Ptgr1 Ausdrock am Mo. Rubriken vun immunostaining. Signaler fir d'Ptgr1 FAQ sech zu granule-wëll Strukture vun mMCs am Mo. mucosa awer net zu sMCs (Dorënner 6B) suggeréiert datt de Ptgr1 Aktivitéit fonnt aus mMCs op degranulation verëffentlecht ginn. Zanter PGE 2 spillt kritescher Rollen an der Ënnerhalt vun GUT homeostasis duerch mucosal Schutz an inhibition vun Seier secretion, ass et méiglech, dass wann aktivéiert, mMCs negatif der cytoprotective Aktiounen vun PGE regléieren 2 duerch rapid inactivation vun Ptgr1.
Gene Ausdrock Muster vun extracellular Matrixentgasung Voleten, Haftung Molekülle, an cytoskeletal Proteinen am sMCs an mMCs VerfÜgung MC phenotypes op hir Interaktioune mat der Géigend extracellular matrices (ECMs) an Nopeschlänner Zellen gewise goufen ze hänken [1]. Ee vun de stäerkste bemierkenswäert Conclusiounen vun dëser Etude ass den Ënnerscheed an der Gentherapie Ausdrock vun ECM FAQ Voleten, Haftung Molekülle, an cytoskeletal Proteinen, déi am Mo. (Dorënner 5b) funktionell Adaptatioun vun all Zort vun MC zu der mucosal oder submucosal Ëmwelt spigelen vläicht . mMCs auszedrécken Genen fir mucosa-spezifesch ECM Proteinen wéi Muc1 VerfÜgung (Mucin) an Tff1 VerfÜgung (Trefoil Faktor), während sMCs Genen fir konventionell ECM Proteinen wéi Col4a VerfÜgung (procollagen) auszedrécken an Lama2 VerfÜgung (laminin). Ausserdem soot sMCs Genen fir Haftung Molekülle wéi Alcam VerfÜgung an Vcam1 VerfÜgung, an Genen fir gewéinlech cytoskeletal Proteinen wéi Acta2 VerfÜgung (actin), während mMCs desmosome-Komponent Genen wéi Dsc2 VerfÜgung auszedrécken ( desmocollin) an Dsg2 VerfÜgung (desmoglein), an Genen fir keratin Tëscherapport Filamenter wéi Krt8 VerfÜgung an Krt19 VerfÜgung. Desmosomes ware präsent an de Mo. epithelia zu gemellt [35], an et gouf erausfonnt, datt desmosome-wëll Strukturen zu engem bestëmmten Typ vu MC nogewise ginn [36]. Et ass also méiglech, dass mMCs mat bascht epithelia duerch desmosomal Haftung vun de Mo. zesummekomm. Am Géigesaz, erschéngen sMCs mat de Nopeschgemengen Zellen via Haftung Molekülle wéi VCAM-1, ALCAM a virdrun-cadherin (Vcam1 VerfÜgung, Alcam1 VerfÜgung an Cdh5 VerfÜgung) zesummekomm. Well dës Haftung Molekülle gewise goufen an dynamesch Regulatioun vun der actin cytoskeleton [37, 38], esou Protein-mediated Interaktioune mat submucosal Zellen Équipe gin kann kritesch ginn der funktionell an morphological Eegeschafte vun sMCs ze erhalen. Iwwerhaapt sollt et ze bemierken, dass déi meescht sMCs an Form Variabel ginn, a sinn dacks dozweschent an opgeriicht als Verglach mat mMCs [1]. VerfÜgung Conclusioun VerfÜgung Mir etabléierten isoléiert eng Method vun RNS amplification aus hinzeginn intakt MCS aus gefruerenem Otemschwieregkeeten Sektiounen, déi eis eng Kéier ze kréien déi global Gentherapie Ausdrock Muster vun MCS aus verschidde Stoffer, Organer, an Aarten dorënner Mënschen erméiglecht. Andeem Dir dës Method, hien huet mir fir d'éischt Kéier de Frae Gentherapie Ausdrock Profiler vun submucosal an mucosal MCS vun der Maus Moo. . Eis Conclusiounen Offer Iwerbléck méiglech onidentifizéierte Eegeschafte spezifesch fir all MC Ënnerklass VerfÜgung Method VerfÜgung spontan VerfÜgung Déi folgend Material aus de Quelle kritt huet uginn: HPLC sidd T7- (DT) 24 primer [5 ' -GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC GG (T) 24] vu GE Gesondheetswiesen UK Ltd. (Buckinghamshire, England), RNase-gratis Waasser, dNTP, SusperScript II, Escherichia belaascht VerfÜgung (Kolibakterie VerfÜgung) RNase H, E . belaascht VerfÜgung DNA polymerase ech, Kolibakterie VerfÜgung DNA ligase, T4 DNA polymerase an zoufälleg hexamers aus Invitrogen (San Diego, CA), RNase inhibitor, Glucogène, an MEGAscript T7 Kit vun Ambion (Austin, Suerge). Balb /c Mais sech aus JapanClea (Hamamatsu, Japan) kritt. Dës Etude vum Comité op Déieren Research vu Kyoto University CSL School vun Gitt mir eng Waassermeloun Sciences ofgeseent gouf. VerfÜgung RNS amplification an oligonucleotide microarray VerfÜgung Mouse interleukin-3-ofhängeg BMMCs sech ëmschriwwen bereet virdrun [39].

• E Patient mat gastric Kriibs mat peritoneal carcinomatosis mat intraperitoneal Chimiotherapie behandelt déi méi wéi 5 Joer erëmfonnt Erhalen widderholl laparoscopic Examen: e Fall Rapport
• Immunization mat der immunodominant Helicobacter sinn urease subunit B induces partiell Schutz géint H. sinn Wonn an enger Maus Modell