PLoS ONE: Tonikas ir fazinės lygiųjų raumenų susitraukimas nereglamentuoja PKCα - VKI-17 Kelias į Kiaulių skrandžio Ertmė ir Fundus

Anotacija

reglamento Miozinas šviesos grandinės fosfatazės (MLCP) per baltymų kinazės C ( PKC) ir 17 kDa PKC-sustiprėti inhibitorius miozino lengvosios grandinės fosfatazės (VKI-17) buvo pranešta kaip Ca ^{2 + jautrinimo signalinio kelio į lygiųjų raumenų (SM), ir todėl gali būti įtraukti į tonikas vs fazinės susitraukimai. Šis tyrimas nagrinėjo baltymo ekspresija ir erdvinio-laikinio pasiskirstymo apie PKCα ir VKI-17 sveikoms SM audiniuose. KCl arba carbachol (CCH) stimuliacija tonikas skrandžio dugno SM sukuria ilgalaikį susitraukimą, o Studijose skrandžio Ertmė sukuria trumpalaikį susitraukimą. Be to, tonikas dugnas sukuria didesnę santykinę jėgą nei Studijose antralinėje dalyje su 1 mikromolių phorbol 12, 13-dibutyrate (PDBu) stimuliacijos, kuri pranešė, kad suaktyvintumėte PKCα - VKI-17 keliu. Vakarų dėmė analizė parodė, kad ši kontraktilinis skirtumas buvo ne dėl skirtumo baltymų raiškos PKCα ar VKI-17 tarp šių dviejų audinių. Imunohistocheminius rezultatai rodo, kad PKCα pasiskirstymas išilginės ir žiedinės sluoksnių dugno ir antralinėje dalyje nesiskiria, yra daugiausia lokalizuota netoli membranos SM ląstelių koncentraciją plazmoje. Stimuliavimas arba audinių 1 mikromolių PDBu arba 1 mikromolių CCH nekeičia šį periferinę PKCα paskirstymą. Yra jokių skirtumų tarp šių dviejų audinių VKI-17 paskirstymo, tačiau, skirtingai nei PKCα paskirstymo, VKI-17, atrodo, difuziškai pasiskirsto citoplazmą pagal atsipalaidavęs audinių sąlygomis, bet perjungia pirmiausia periferinių pasiskirstymo plazminės membranos su stimuliacija audiniai su 1 mikromolių PDBu arba 1 mkm CCH. Rezultatai nuo dvigubo ženklinimo rodo, kad nei PKCα nei VKI-17 bendro lokalizuoti tuo adherens sankryžos (vinculin /Talin) prie membranos, tačiau jie bendrai lokalizuoti viena su kita ir su caveoli (caveolin) prie membranos. Šis skirtumas stoka rodo, kad PKCα - VKI-17 kelias neatsako už tonikas vs Studijose susitraukimai pastebėtas skrandžio dugno ir antralinėje dalyje}

Citation: Zhang Y, Hermanson mane, Eddinger TJ (2013) toniką. ir fazinės lygiųjų raumenų susitraukimas nereglamentuoja PKCα - VKI-17 Kelias į Kiaulių skrandžio Ertmė ir dugno. PLoS ONE 8 (9): e74608. Doi: 10,1371 /journal.pone.0074608

redaktorius: Wenhui Hu šventykla universiteto medicinos mokyklos, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Kovo 13, 2013; Priimtas rugpjūčio 4, 2013 m Paskelbta rugsėjo 18, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Zhang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė nacionalinio mokslo fondo (NSF), Biologinės mokslų fakultetas ir aukštosios mokyklos, Marquette universitete. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

mechanizmas (-ai) nustatyti tonikas (ilgalaikis), palyginti su Studijose (laikina) lygiųjų raumenų (cm) susitraukimai lieka neišspręstas. Įvairi inervacija ir cirkuliuojančių signalinės molekulės be unikalaus receptorių ir baltymų (izoformos) išraiškos ir ląstelėje signaliniu keliu komplikuoti problemą. Ne netikėtai, yra keli siūlomi hipotezės paaiškinti tonikas jėgos priežiūra SM įskaitant: slowly- ar ne dviračiu lygiųjų raumenų miozino skersinių tiltelių vadinamų skląsčio tiltai [1], [2], [3], [4]; įdarbinimas ne-raumenų myosin II [5], [6], [7]; formavimas caldesmon arba calponin priklausomų aktino-to-myosin kryžminių nuorodų [8], [9]; formavimas Citoskeletas jėgos-guolis struktūrų [10], [11], [12]; ir reguliavimas myosin LC _{20 fosforilinimo per antrąjį Messenger kelius įtakos Miozinas šviesos grandinės kinazės (MLCK) ir miozino lengvosios grandinės fosfatazės (MLCP) veiklos [13], [14], [15], [16], [17] , [18]. Šis paskutinis kategorija yra įdomūs, nes ataskaitinio diferencinė ekspresija, lokalizacijos ir reguliavimo šių antrojo Messenger baltymų įvairių SM audiniuose. Kintamojo reguliavimas MLCK ir MLCP veiklos galėtų teikti ne tik priemonė Ca ^{2 + jautrinimo, tačiau taip pat galimą mechanizmą tonikas vs Studijose susitraukimo. Nukenksminimą MLCP per PKCα -CPI-17 keliu leistų palaikyti aukštos miozino lengvosios grandinės (MLC 20) fosforilinimo ir tokiu tvariu kontrakcijos jėga. Nesugebėjimas nukenksminimui MLCP sumažėtų MLC 20 fosforilinimas ir jėgą, todėl trumpalaikis susitraukimo. Skrandžio dugnas S. generuoja tonikas (ilgalaikių) susitraukimą, o skrandis Ertmė S. generuoja Studijose (laikina) susitraukimo atsakas į įvairius dirgiklius.}}

Ca ^{2 + jautrinimas, kuris yra susijęs su G- aktyvavimo baltymu sujungto antra Messenger keliai, kad įjautrinti susitraukimo baltymus [Ca 2 + _{i] slopindamas MLCP, gali atsirasti kuris nors iš daugelio būdų. Vienas iš pranešta kelius slopinimo MLCP veikla apima baltymų kinazės C /C-kinazės aktyvuota PP1 inhibitoriais baltymų 17 kDa (PKC /VKI-17) kelio [19], [20]. G-kartu baltymų receptoriaus (GCPR) įjungimas todėl aktyvavimo fosfolipaze C (PLC), hidrolizuojasi fosfatidil 4,5-bifosfato (PIP 2) gaminti inozitolį 1,4,5-trisphosphate (IP 3) ir diacilglicerolio (DAG). DAG yra žinoma, kad aktyvuoti PKC kuris gali sukelti fosforilinimo VKI-17 selektyviai slopina MLCP (peržiūrimas visceralinių SM į [17]). PKC Manoma, reglamentuoja jo įjungimo ir erdvinio pasiskirstymo per ląstelę, pastaroji yra kontroliuojama inkaro baltymus, kurie jungiasi prie ir apriboti PKC vietą su konkrečiais regionais ląstelių [21], [22]. Pavyzdžiui, ataskaitos constitutively aktyvus L-tipo Ca 2 + kanalus ir jų reguliavimas PKC [23], [24] rodo, kad PKC lokalizuojasi netoli lygiųjų raumenų ląstelių membranos. Bevielio ryšio funkcija VKI-17 langelyje gali skirtis priklausomai nuo jo lygio baltymų ekspresijos ir ar jis yra netoli plazmos membranos, kur PKCα yra /aktyvuota, arba susijusiu su kontraktilinis myosin storio gijų kur MLC būtų statoma de -phosphorylate Miozinas lengvoji grandinė 20 (MLC 20).}}

iš PKCα ir VKI-17 ir jų erdvinė-laiko perskirstymo ant audinių aktyvavimo išraiška buvo pasiūlyta Ca ^{2 + jautrinimas lygiųjų raumenų audiniuose (peržiūrai [14], [15], [16], [17]). Taigi tai yra įmanoma, kad skirtumai jų saviraiškos ir ląstelių lokalizavimo /perkėlimas galėtų būti įtrauktos nustatant tonikas vs Studijose susitraukimo atsakymų. Dėl šių dviejų baltymų būti dalis kelio dalyvauja slopinant MLCP veiklą per audinių aktyvavimo, ir taip sukelia tonikas arba fazinės atsakymą, jie turi būti išreikštas atitinkamais lygmenimis ir pastatytas į tinkamą vietą ląstelėje tuo teisingą laiką. Nes PKC yra aktyvuojamas DAG (membrana privalo fosfolipidinio), ji taip pat turi būti ne membranos bent laikinai, kad tai įvyktų. Ir jei VKI-17 ketina slopina MLCP iš dephosphorylating MLC _{20 d storų siūlų, VKI-17 tam tikru momentu turi būti citozolyje, susijusio su storais gijų, esančių ten. Su šie du etapai vyksta dviem erdvėje skirtingų regionų ląstelę, vieną ar abu šiuos baltymus turi translocate į kitą regioną juos bendrauti ir užbaigti kelią.}}

Šios studijos tikslas buvo išbandyti hipotezė, kad PKCα - VKI-17 "Ca ^{2 + jautrinimas kelias dalyvauja nustatant tonikas (ilgalaikių) ir fazinės (laikina) susitraukimo atsakymus į lygiųjų raumenų. Norėdami tai padaryti, mes nustatomas baltymų raišką ir erdvinio-laikinio pasiskirstymo apie PKCα ir VKI-17 Studijose skrandžio antralinėje dalyje ir tonikas skrandžio dugno pagal atsipalaidavęs ir aktyvuota sąlygomis. Rezultatai nepateikdamas jokių reikšmingo skirtumo išraiška vieną iš šių dviejų baltymų, nei jų periferinės paskirstymo tarp šių dviejų audinių yra nesuderinama su hipoteze, kad PKCα- VKI-17 "Ca 2 + jautrinimas būdas yra lemiamas veiksnys tonikas vs Studijose susitraukimo atsakymų pastebėtas šių audinių.}

metodų

Organų ir audinių tvarkymas

Kiaulių audiniai (skrandžiai) buvo gauti iš Hansen mėsos tarnybos (Franksville, WI) ir įdėti į šaltą fiziologinio druskos tirpalo (PSS; (mm): 140.1 NaCl 4,7 KCl, 1,2 Na _{2HPO 4, 2,0 DISKAI (pH 7,4), 0,02 Na 2EDTA, 1.2 MgSO 4, 1.6 CaCl 2, ir 5,6 gliukozės). Skrandžiai buvo išvalytos kraujo, palaidų jungiamojo audinio, ir kai kuriais atvejais, gleivinė, ir užšaldyti iš karto arba saugomi PSS į šaldytuvą 0-2 dienų. Kai organai buvo šviežia sušaldyta kaip galima greičiau po skrodimą (60-90 minučių). Kai kurie organai buvo inkubuojami PSS ir /arba stimuliuojama su 1,0 pM CCH arba PDBu (Sigma), 37 ° C temperatūroje skirtingais laiko kiekis iki užšalimo. Kintamos inkubavimo laiką ir agonistų koncentracija taip pat buvo išbandytas. Dėl imunohistocheminiu visi audiniai buvo saugomi užšaldyti iki suskirstyta ir immunoreacted. Užšaldymo visais atvejais dalyvaujančių pateikimo vienetų audinių ar audinių juostelių izopentanas atšaldomas skystu azotu ir po to -80 ° C temperatūroje, taikant saugojimo. Penkių iki šešių mkm skyriai užšaldytų audinių buvo sumažinti dėl "Leica CM1900 kriostatas, įlaipinami stikliukų ir laikomas užšaldytas (0-1 dienas), kol immunoreacted.}

Immunoreactions ir reagentai

antikūnai, naudojami buvo gauti iš šių šaltinių: PKCα (H-7 ir C-20) ir VKI-17 (H-60) iš Santa Cruz Biotech, Santa Cruz CA; Vinculin ir Talin iš Sigma, Sent Luisas, Misūris; Caveolin 1 iš BD biomokslų, San Chosė, CA; Cy2 ir Cy3 Asilas kovos pelę arba triušio vidurinės s iš Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; Alexa Fluor 594-faloidinas ir DAPI iš Molecular Probes, Eugene, OR. Visi šie antikūnai buvo anksčiau mūsų laboratorijoje dėl imunohistocheminiu ir Imunoblotingo jei jie rodo specifiškumą, tinkamo molekulinės masės juostoje priklausomai nuo atitinkamo nurodyta baltymų [25], [26], [27]. Neigiami kontroliniai mėginiai, kur pirminis antikūnas yra neįtrauktos rodo reaktyvumą šių juostų ir ne IMUNOFLUORESCENCIJOS apie audinių skyriuose.

Sušaldyti audinio skyriai įlaipinami stikliukų buvo atšildyti kambario temperatūroje ir tada tvirtinama 2% paraformaldehido 10 minučių, membranos pralaidumu 0,5% Triton X-100 10 minučių ir blokuojami su 5 mg /ml BSA 1 valandą prieš reaguoja su pirminiais antikūnais nakties (4 ° C), o paskui atitinkamą antrinio antikūno vieną valandą kambario temperatūroje. Po antrinio antikūno, audiniai buvo inkubuojami su DAPI (0,5 mikromolių), faloidinas (10-50 nm) arba DAPI /faloidinas kaip tinka nusidažęs branduolių ir /ar siūlinių aktino. Keli plovyklos buvo naudojami šie pirminių ir antrinių inkubavimų, ir counterstaining. Viršelio akiniai buvo sumontuoti naudojant buferinį 75% glicerolio su 0,2% n-propilo galatas, siekiant sumažinti blukimo. Visi immunoreacting sprendimai buvo PBS-Tween [(g /l: NaCl 8,0, KH _{2PO 4 0.2 Na 2HPO 4 1.15, KCl 0,2,), 1% tween- 20, pH 7,4] su 0,1% BSA. Neigiami kontroliniai mėginiai įtraukta 0,1% BSA be pirminio antikūno ir neparodė imuninė reakcija.}

mikroskopija

Profiliai nepastebėta naudojant "Olympus IX70 mikroskopą su epifluorescenciniu apšvietimas. Skaitmeniniai foto darytos su 16 bitų Prinstono priemonės (Princeton, NJ) CCD kamera, valdoma per PCI lentos per IPLab Windows kompiuteryje (3,6 Ver, Scanalytics;. Fairfax, VA). Foto darytos naudojant arba 100 × (1,3 NP) arba 60 × (1,25 NA) alyvos objektyvą arba 40 × (0,9 NA) oro objektyvą ir saugomi kompiuteryje. Emisijos filtrai, naudojami buvo 405, 490 ir 570 nm bangos ilgiui. Profiliai taip pat buvo peržiūrėti naudojant "Nikon mikroskopas (" Nikon "A1 Confocal užtemimas Ti). Naudojami tikslai buvo 100 × (1,4 NP) aliejus objektyvas 425, 488 ir 561 nm. Panašūs rezultatai buvo pastebėtas IMUNOFLUORESCENCIJOS paskirstymo naudojant šias dvi skirtingas sistemas.

Vaizdo analizė pasiskirstymas PKC /CPI-17 Individualių ląstelių audiniuose

Aplinka fluorescencijos intensyvumas buvo imtasi atskirų ląstelių skersinės audinio skyriai. Skyriai buvo pastebėtas mažas priartinimas (10-20x), kad būtų išvengta sritis akivaizdžių dalykų (audinių lankstymo, užšaldyti žalą, ir tt). Be artefaktas neapimtos teritorijos priartinimas buvo padidintas iki 40-100x ir fotografuota ne šių aukštųjų didinimui. Trys skirtingi plotai per vieną audinių skyriuje buvo pasirinkta fotografuoti. Z-kamino serija buvo paimti atskirai kiekvienoje iš trijų spalvų naudojamų kanalų. buvo imtasi 1 mkm storio Z skyriai ir 15-25 Z skyriai buvo paimti kiekvienos audinių skyriuje (duomenys S1 "& S2 Rodyti Z kamino pavyzdžiai VKI-17 reaktyvumas į antralinėje dalyje su ir be audinio aktyvavimo). Kiekvienas Z kamino serija buvo nagrinėjama kiekvienoje sekcijoje identifikuoti centras z įvaizdį, ir šis įvaizdis buvo konvertuojami į a.bmp failą, kuris buvo importuotas NIS-Elements AR 3.0 (Nikon) ant PC analizuoti duomenis.

profiliai PKCα ir faloidinas fluorescencijos intensyvumas buvo gautas atskirų ląstelių skersinių audinių skyriuose. Linija buvo išvestos per vaizdo srityje centre. Dešimt ląstelės per kurį teka linija buvo atrinkti matavimų. Remiantis mūsų ankstesnius protokolus [25], per pirmuosius penkerius pikselių (~0.7 mikrometrai) iš abiejų ląstelės, kuriose faloidinas intensyvumas smarkiai padidėjo nuo pradinio pusėje buvo apibrėžiamas kaip ląstelės periferijoje. Už citozolio matavimų, linija buvo dedamas bent 2 mkm nuo ląstelių periferijoje. Intensyvumo matavimai buvo atlikti naudojant vietos (IG) regioną maždaug ties langelio centre (už citozolio matavimus), arba išilgai ląstelės membranos (periferinių matavimus). Siekiant nuoseklumo, iš IG dydis yra laikomas konstanta periferinių ir citozolio matavimus. Ląstelės skyriuje su labai mažų diametrų (negali išmatuoti citozolinių IG bent 2 mkm iš periferijos) arba branduolių šio (mato DAPI dažymo kur erdvinių apribojimai ir perinuklearinę organoidus gali sugėdintų pasiskirstymą) buvo pašalinti iš analizės. Dėl PKCα, buvo naudojamas vidutinio intensyvumo PKCα santykis periferijoje per visą PKCα intensyvumo (suma PKCα intensyvumo iš IG periferijoje ir ROI citozolyje). Dešimt ląstelės per lauką ir trys įvairių sričių buvo atliktas matavimo duomenų analizė kiekvienam audinių regione, t.y. trisdešimt ląstelės buvo skaičiuojamas ir vidutinis kiekvieno mėginio (n = 1). Galutinis mėginio dydis buvo n = 5.the pati tvarka buvo taikoma pamatuoti VKI-17 intensyvumą, išskyrus tai, kad tik vienas laukas 10 ląstelių buvo naudojami kiekvieno mėginio (n = 1), su galutinio mėginio dydis n = 3.

Mechaninės Matavimai

prieš naudojimą, audinio juostelės buvo supjaustyti ir prispaustas ant kiekvieno galo, su spaustukais užtikrintos tarp kabliukų ant stacionaraus metalinio strypo ir izometrinių jėgos keitiklio (Harvardo aparatūra, Holliston, MA), į PSS burbuliukais 95% O _{2/5% CO 2 vandens rankove raumenų rūmų (Radnóti Stiklo technologija, Monrovija, Kalifornija) esant 37 ° C temperatūroje. Kiekvienos juostelės ilgis buvo svyravo perskirstymas stacionarus metalinio strypo.}

lygusis raumuo juostos (skrandžio Ertmė ir dugno) buvo pusiausvyroje 1 h ir ištemptas iki pasyvaus įtempimo suderinti Lo naudojant sutrumpintą ilgis-įtempimo kreivė , Sudaryti sutartis audinius, PSS buvo pakeistas su K ^{+ - PSS (109 mM KCl yra pakeistas ISO-osmotiškai už NaCl) [28]. Raumenų juostos buvo aktyvuota kartą su tempimo tarp kiekvieno įjungimo audinio, kol smailės jėga nebėra, žymiai išaugo, palyginti su praėjusiais susitraukimo. Rūmai buvo plaunama tris kartus PSS po kiekvieno audinių aktyvacijos. Bent du Nepakartotinos eilės K + - PSS susitraukimai buvo naudojamas norint gauti standartinę jėgos pėdsakų su 10 minučių poilsio tarp kiekvienos susitraukimo prieš pradedant eksperimentą. Tuomet audiniai buvo aktyvuota 1 mikromolių carbachol ir atsipalaidavęs vėl, kaip buvo atliktas per K + - PSS susitraukimai. Vėlesni susitraukimai viskas įskaičiuota 1 mkm Phentolamine ir propranololio blokuoti α- ir beta - adrenerginių receptorių, atitinkamai. Po galutinę 1 mkm CCH susitraukimo ir plauti, audiniai buvo aktyvuota 1 mikromolių PDBu įrašyti savo mechaninį atsaką.}

analizė pajėgų Duomenų

Įtampos signalus iš jėgos daviklių buvo suskaitmeninta iki PowerLab 400 arba 4 SP aparatūros (ADInstruments, pilies kalnas, Australija) ryškinamos kompiuterio ekrane (Chart v3.6 arba 4.0, ADInstruments), kaip jėga (g) 10 Hz ir saugomi programinės komandos, kad kietajame diske vėlesnių analizės. Duomenys buvo su skaičiuoklės programa Excel 2000 ( "Microsoft", Redmond WA).

Gelio elektroforezė ir Imunoblotingo

baltymo ekspresija buvo analizuojama, kaip aprašyta anksčiau [29]. Audiniai buvo homogenizuojamas 50 mg /ml 0,125 M Tris, 2% natrio dodecilsulfatas (masės /tūrio), 20% glicerolio, 0,1% bromfenolio mėlynasis (masė /tūris) ir 20 mM ditiotreitolo. Baltymai buvo išspręsta mažas susiuvimo natrio dodecilsulfatas geliai [30] ir imunoblotas buvo atliktas kaip buvo aprašyta anksčiau [31]. PKCα antikūnų pripažinta arba vieną grupę ar dažniau yra Doublet ne ~76 kD VKI-17 antikūnas pripažino vieną grupę ne ~17 kD. Šie dydžiai atitiktų numatomą dydį šių baltymų remiantis gelio mobilumą. Siekiant užtikrinti tikslumą Vakarų dėmės, pakrovimo kreivės buvo padaryta abiejų skrandžio dugno ir Ertmė pavyzdžių daugiau nei 5 kartus įvairių apkrovų (4-20 pl) už aktino (coomassie mėlynos dėmės) ir PKCα ir VKI-17 (imunoblotingu) , Rezultatai parodė, yra linijinis ryšys per šio intervalo visiems trims baltymams, iš abiejų audinių (R ^{2 > 0,98 visiems rezultatų, n = 3). Kiekybinę PKCα ir VKI-17 baltymo ekspresijos buvo padaryta Vakarų dėmės naudojant 5-10 iL apkrovas, kad per šį tiesinio intervalo (n = 6).}

Statistika

statistiniai palyginimai buvo atliekami naudojant Minitab (Minitab Inc State College, PA). Vieno mėginio T-testas buvo naudojamas išbandyti PKCα /CPI-17 pasiskirstymą (periferinė su bendra IG turinio 0,5 rodo "vienodą" pasiskirstymą lygiųjų raumenų ląstelių (SMCs)) į antralinėje dalyje ir dugno pagal poilsio būklės. Vienas iš būdų ANOVA buvo atliekama siekiant patikrinti, PKC /VKI-17 paskirstymo skirtumų dėl dviejų audinių, įvairių stimuliuojantis parametrus. Du mėginio t-testai buvo naudojami išbandyti skirtumo reikšmę ekspresijos lygį PKCα ar VKI-17 antralinėje dalyje ir dugno. Dviejų-tailed F kriterijus lygybės dviejų standartinių nuokrypių (TVS) nustatomas žymiai mažesnis SD į caveolin santykis PKCα, palyginti su į vinculin santykis PKCα SD. A P <vertės; 0,05 buvo laikomas didelis visoms statistikos testų. Nėra statistikos tyrimai buvo padaryta dėl jėgos duomenimis ir 1 paveiksle yra tipinės panašių duomenų iš 6 skirtingų gyvūnų. Vakarų dėmė duomenys iš šešių gyvūnų. PKCα paskirstymo duomenys buvo išbandytas trisdešimties ląstelių išmatuotų vienam gyvūnui ir penkių gyvūnų vidurkis. VKI-17 paskirstymo duomenys buvo išbandė 10 ląstelių išmatuotų vienam gyvūnui ir tris gyvūnus vidurkis. Baltymų bendrai lokalizavimo duomenys remiasi "n" ne mažesnis kaip 20 ląstelių iš ne mažiau kaip 3 gyvūnai.

Rezultatai

Kiaulių skrandžio dugnas yra pirmiausia tonikas lygusis raumuo, kad reaguoja į stimuliaciją taip pat ir nuolatinis susitraukimo o Ertmė yra visų pirma Fazės lygusis raumuo, kad reaguoja į stimuliacija su praeinančiu susitraukimo (1 pav.). Audiniuose šie atsakymai tikėtina, yra tiesiogiai stimuliacija lygiųjų raumenų kaip to 1 pM propranololio (beta agonistų blokatoriaus) ir Phentolamine (alfa agonistų blokatoriaus) rezultatas buvo naudojamas siekiant užkirsti kelią aktyvavimą adrenerginių receptorių dėl galimo išleidimo simpatinių neurotransmiterių. Stimuliavimas lygiųjų raumenų su PDBu naudojamas reguliariai sukelti lygiųjų raumenų susitraukimą per PKC aktyvacijos [32], [33], [34]. Vienas mkm PDBU sukelia nedidelį lėtai susitrauks skrandžio dugno juostelėmis (~40% K ^{+ stimuliacijos atsakymo), o Ertmė rodo iš esmės jokio atsakymo (< 5% K + stimuliacija) (1 pav.). Skirtumas tarp nuolatinių ir laikinų atsakymų šių dviejų audinių KPSS ir CCH ir buvimą ar nebuvimą kontrakcijos atsakas į PDBu stimuliacija gali būti dėl to, kad žodžio ir /ar erdvinės laiko paskirstymo tolesniems antrojo pasiuntiniai (PKCα ir VKI-17), kurios siekė būti atsakingi už MLCP slopinimo su PDBu stimuliacijos. Išnagrinėti tai mes išmatavo raiškos lygį ir nustatyti erdvinę-laiko paskirstymą PKCα ir VKI-17 į šiuos audinius.}

2 pav Vakarų dėmė rezultatus VKI-17 ir PKCα išraiškos skrandyje antralinėje dalyje ir dugnas. Audiniai buvo apdoroti kontroliuojant baltymų koncentracijos, ir rezultatai buvo apskaičiuotas remiantis atitinkamo baltymų signalo intensyvumo, ir normalizuoti pagal aktino baltymų raiškos (2 pav.). Abu metodai (tik normalizuoja pateikti duomenys) nurodė, kad nei VKI-17 baltymo ekspresija, nei kad PKCα baltymų yra žymiai skiriasi (p > 0,23 "& P > 0,28 atitinkamai n = 6), lyginant šiuos du SM audinius. Kontrolė buvo atliekama naudojant apkrovos diapazoną patvirtinti tiesiškumas pakrovimo asortimentą ir kad naudojami kiekybinio mėginiai buvo šiame intervale (duomenys nerodomas, pamatyti metodus). Nes ten nėra jokių su šiais dviem baltymais tarp šių dviejų audinių išraiškos skirtumų, mes šalia vyko nustatyti, ar skiriasi jų erdvinio-laikinio pasiskirstymo galėtų paaiškinti savo atsakymuose skirtumą PDBu stimuliacijos.

3 pav Rodyti immuohistochemical rezultatai į PKCα paskirstymui išilginės ir žiedinės sluoksnių dugno ir antralinėje dalyje. Pagal poilsio sąlygas atsipalaiduoti sprendimą, kai nėra jėga kartos į audiniui, PKCα atrodo būti unikaliai platinamas pirmenybė netoli SMCs (3- pav. Žalia spalva, PSS) periferijoje. Stimuliavimas audinių 1 mikromolių CCH (3 ") arba 1 mikromolių PDBu (10 ir 30), nekeičia šio periferinę paskirstymą PKCα. Iš į PKCα platinimo artimiausiu plazminės membranos, palyginti su bendra ląstelių PKCα santykis buvo naudojamas įvertinti galimus pokyčius šio baltymo pasiskirstymo pagal šių skirtingų sąlygų. 4 paveiksle parodytos rezultatus, kaip į PKCα santykio ląstelių periferijos santykyje su bendra PKCα esančių elemento (periferinė /(periferinė + citozolyje), žr metodus). 0,5 santykis rodytų "vienodą" baltymo pasiskirstymą visoje kameroje. PKCα santykis (periferinė /viso) svyravo nuo 0.64-0.68 per išnagrinėjo visas sąlygas. Šios reikšmės yra žymiai didesnis nei 0,5 (p < 0,05), nurodant, kad PKCα yra visų pirma prie ląstelės periferijoje (ji yra ne "vienodai" paskirstyta ląstelėje), ir kad šis paskirstymas nekeičia tarp atpalaiduotos arba stimuliuotų sąlygomis <. Br>

Kadangi PKCα siūloma aktyvinti VKI-17, mes pradėjo nustatyti erdvinę-laiko paskirstymą VKI-17 į šiuos audinius panašiomis sąlygomis. 5 Paveikslėliuose vaizduojami immuohistochemical rezultatus VKI-17 paskirstymui išilginės ir žiedinės sluoksnių dugno ir antralinėje dalyje. Pagal poilsio sąlygas atsipalaiduoti sprendimą, kai nėra jėga kartos, kuriuos audinių, CPI-17, atrodo, difuziškai paskirstytos per visą SMCs (Pav. 5- PSS, S1 pav.). Stimuliavimas audinių su 1 mkm CCH (30 ") (bet ne 1 mkm CCH už 3", duomenų nerodomas) arba 1 mkm PDBu (30 ') rezultatų reikšmingų pokyčių šioje platinimo toks, kad VKI-17 dabar atrodo visų pirma turėtų būti ne ląstelės paribio pasiskirsto panašiai kaip į nustatytas PKCα (5 pav., S2 pav.). Iš VKI-17 paskirstymo šalia plazminės membranos palyginti santykis bendrąjį VKI-17 (periferinė + citozolinių) buvo naudojamas įvertinti galimus pokyčius šio baltymo pasiskirstymo pagal šių skirtingų sąlygų. 4 paveiksle parodytos rezultatus, kaip pavyzdžiui, periferinių-į-, kad bendras CPI-17 santykis. VKI-17 santykis (periferinė /viso) svyravo nuo 0.49-0.67 visų audinių ir sąlygomis išnagrinėtų. VKI-17 periferinių /viso santykis atsipalaidavęs sąlygomis reikšmingai nesiskiria nei 0,5 (tai 0,49-0,5; p > 0,19) rodo, kad VKI-17 yra difuziškai platinamas visoje lygiųjų raumenų ląstelių pagal šią sąlygą. Tai nekeičia po 3 '1 mikromolių CCH stimuliacijos, nes vis dar nėra didelis skirtumas nuo atsipalaidavęs sąlygomis (tai reiškia = 0,53-0,55; p > 0,05) su dugno audinių, išskyrus, kai VKI-17 periferinė /Bendra santykis yra žymiai didesnis (p < 0,05); 3 '(4 pav.). Su 30 'turi būti 1 pM CCH arba 1 pM PDBu stimuliacijos, CPI-17 pasiskirstymas tampa žymiai didesnis nei 0,5 visuose audiniuose ir sluoksniai (priemonėmis = 0.62-0.67, P < 0,01), nurodant, kad CPI-17 dabar yra visų pirma tuo ląstelių periferijoje (ji nebėra "vienodai" pasiskirsto ląstelių), panašus į PKCα pasiskirstymo (4 pav.).

pirmiausia periferinė platinimas PKCα (pagal abi atsipalaidavęs ir skatino sąlygomis) ir VKI-17 (taip 30 'stimuliacijos CCH arba PDBu) yra ne vienodas prie ląstelės periferijoje, bet taškinis paskirstymo (6 pav.). Taip pat yra taškinis pasiskirstymas anatomiškai ir funkciškai skirtingų adherens sankryžose ir caveoli prie SMC plazmos membranos [26]. Siekiant nustatyti, ar iš PKCα paskirstymas ir VKI-17 į membranos atitinka su taškinis modelis adherens sankryžų, mes padarėme dvigubą ženklinimą su dviem adherens sandūros susijusių baltymų, vinculin ir Taline. Pakaitinis modelis pasiskirstymo raudonos ir žalios fluoroforezės ties membranų rodo, kad PKCα ir VKI-17 neturi bendrai lokalizuoti arba su vinculin ar Taline (6 pav.), O tai rodo, kad PKCα ir VKI-17 nesieja su adherens mazgas kompleksas nustatytomis sąlygomis mes išnagrinėjome. Kadangi caveoli pakaitinis su adherens sankryžų periferinių membranos [26], PKCα ir VKI-17 gali būti bendrai lokalizuoti su caveoli. Norėdami nustatyti, ar taškinis pasiskirstymas PKCα ir VKI-17 į membranos atitinka su taškinis modelis iš caveoli, mes taip pat padarė dvigubą ženklinimą PKCα su caveolin. Iš PKCα ir caveolin paskirstymas bendrai lokalizuoti ties abiem atsipalaidavęs ir aktyvuota sąlygomis membranos Kaip galima buvo pastebėti į geltona /oranžinė fluorescencijos išvaizdą, o ne atskira raudona ir žalia fluorescencijos (6 pav.). Dviejų-tailed F kriterijus lygybės dviejų standartinių nuokrypių (TVS) nustatomas žymiai mažesnis SD į caveolin į PKCα santykis, palyginti su į vinculin santykis PKCα SD (n = 20 ląstelių; p < 0,05) , Be to, du kartus ženklinimas PKCα su CPI-17 Po aktyvinimo audinio taip pat rodo, didelę bendrą lokalizacijos (n = 20 ląsteles; p < 0,05) iš šių dviejų baltymų šalia plazmos membranos (7 pav.). Šie duomenys rodo, kad PKCα pirmiausia lokalizuota netoli caveloi ne SMC plazminės membranos visais laikais, ir kad po audinių aktyvavimo, didelę dalį citozoliniame VKI-17 translocates į caveoli tuo plazmos kur ji bendrai localizes su PKCα.

Diskusijos

lygiųjų raumenų audiniai yra reguliariai apibūdinamas kaip yra arba "tonikas" (generuoti lėtai prižiūrimi izometrinių susitraukimo) arba "Studijose" (generuoti greitai praeinantis izometrinių susitraukimo). Pajėgų kūrimo ir /arba audinio sutrumpėjimas SM yra manoma, kad reikalauja padidėjusi miozino lengvosios grandinės fosforilinimas, ATP vartojimą ir kirsti tilto dviračiu. Galimas mechanizmas, atsakingas už šių dviejų tipų susitraukimai yra skirtumas Ca ^{2 + jautrinimas. Ca 2 + alergiją lygiųjų raumenų Manoma didele dalimi turi būti dėl to, kad MLCP lygiagrečiuoju slopinimo su arba po to, kai MLCK aktyvinimo metu audinių aktyvavimo [15], [35]. Vienas iš pagrindinių būdų pasiūlė dalyvauti Ca 2 + jautrinimas yra per G-baltymu sujungtas receptorius (GPCR) /fosfolipaze C (PLC) /diacilglicerolio (DAG) /PKC /VKI-17 slopina MLCP. GPCR s, PLC "ir DAG visos yra ne /į plazminės membranos. Priemonės, kuriomis MLCP vieta yra mažiau tikra, bet ne tam tikru metu po audinių aktyvavimo MLC turi būti susijęs su MLC _{20 d miozino molekulės storio gijų tam, kad dephosphorylate šį baltymų. Kadangi buvo pranešta storio siūlai turi būti paskirstytos per SMC citoplazmoje [36], [37], [38], [39], The MLC taip pat turi būti paskirstytos per visą citoplazmą tam tikru momentu poilsiui [40] metu. Jei MLC yra per citozolyje ir šalia MLC 20 susitraukimo metu ir PKCα ir VKI-17 vaidinti svarbų vaidmenį slopinant MLCP susitraukimo metu, tai bent jau VKI-17 būtų tikimasi esančių citozolyje tam tikru metu per susitraukimo. Šio tyrimo rezultatai rodo, kad PKCα yra pirmenybė lokalizuota netoli plazminės membranos metu atsipalaidavęs ir aktyvuota sąlygomis ir kad VKI-17 taip pat pirmenybė lokalizuota netoli plazminės membranos per aktyvintosios sąlygomis rezultatai. Taigi, šie duomenys rodo, kad skirtumai PKCα- VKI-17 Ca 2 + jautrinimas kelias negali paaiškinti tonikas ir fazinės SM susitraukimus skrandžio dugno ir antralinėje dalyje ir tolesniam darbui yra būtinas, siekiant nustatyti, kaip erdvinės laiko paskirstymą CPI- 17 su audinių aktyvavimo gali reguliuoti MLCP sukelti Ca 2 + jautrinimas SM susitraukimo sveikoms SM audiniuose.}}

Nors PDBu sukelia lėtą susitraukimą į dugno, kuris yra ~40% nuo KPSS sukelto slėgio jėga mažai susitraukimas yra generuojami antralinėje dalyje su PDBu stimuliacijos. Nuo dugno ir Ertmė atstovauti du pagrindinius tipus lygiųjų raumenų, tonikas ir fazinės atitinkamai, atrodo logiška priskirti į galiojančius kartos skirtumą skirtingų savybių Studijose ir tonikas raumenims. Woodsome ir kt [41] pranešė, kad sąvoka lygis VKI-17 tonikas kraujagyslių SM yra didesnis nei, kad fazinės kraujagyslių SM. Tai gali paaiškinti skirtingą gebėjimą toninių raumenų išlaikyti jėgą (didelės koncentracijos VKI-17 slopina MLC leidžia MLC _{20 fosforilinimo likti didelis ir jėga turi būti išlaikoma tonikas SM). Šis tyrimas nagrinėjo PKCα ir VKI-17 baltymo ekspresija ir pasiskirstymą visceralinių kiaulių skrandį. Mūsų nuostabai, nėra didelio skirtumo, baltymų ekspresijos lygį PKCα ar VKI-17 aptikta tarp dugno ir antralinėje dalyje (pav. 2).}

• PLoS ONE: Nikotinas slopina aktyvinimas audinio Resident makrofagų Mouse skrandžio per b2 nikotino acetilcholino receptorių
• PLoS ONE: Chirurginis gydymas pacientams, sergantiems Krukenbergo navikas skrandžio Kilmės šalis: klinikinei baigčiai ir prognostinių faktorių analizė