PLoS ONE: Gedereguleerde Expressie van SRC, LYN en CKB Kinases door DNA-methylatie en de mogelijke rol bij maagkanker Invasiviteit en metastase

Abstract

Kinases zijn downstream-modulators en effectors van verscheidene cellulaire signalering cascades en een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van neoplastische ziekte. In deze studie hebben we gericht op SRC Lyn en CKB eiwit en mRNA expressie, evenals hun promoter methylatie evalueren, maagkanker. Wij vonden verhoogde expressie van SRC en LYN kinase mRNA en eiwit, maar verlaagde CKB kinase, veranderingen die een rol spelen bij de invasiviteit en metastase van tumoren maag hebben. Expressie van de drie onderzochte kinases werd ook geassocieerd met MYC oncogen expressie, een mogelijke biomarker voor maagkanker. De mechanismen die de expressie van deze genen reguleren begrijpen, onderzochten we de DNA promotor-methylering van de drie kinases. We vonden dat verminderde SRC Kopen en LYN
methylatie en verhoogde CKB
methylatie werd geassocieerd met maagkanker. De verminderde SRC Kopen en LYN
methylering was geassocieerd met verhoogde niveaus van mRNA en eiwitexpressie suggereert dat DNA methylatie is betrokken bij het reguleren van de expressie van deze kinasen. Daarentegen verminderde CKB
methylering waargenomen in monsters met verminderde mRNA en eiwitexpressie suggereert CKB expressie bleek slechts gedeeltelijk gereguleerd door DNA methylering. Bovendien vonden we dat veranderingen in het DNA methylatie patroon van de drie onderzochte kinases ook geassocieerd met maagkanker ontstaan, gevorderde maagkanker, dieper tumorinvasie en de aanwezigheid van metastase. Daarom, SRC, LYN en CKB expressie of DNA-methylatie kan nuttig zijn markers voor het voorspellen van de tumor progressie en doelgerichtheid in anti-kanker strategieën

Visum:. Mello AA, Leal MF, Rey JA, Pinto GR, Lamarão LM, montenegro RC, et al. (2015) Gedereguleerde Expressie van SRC, LYN en CKB Kinases door DNA-methylatie en de mogelijke rol bij maagkanker Invasiviteit en metastase. PLoS ONE 10 (10): e0140492. doi: 10.1371 /journal.pone.0140492

Uitgever: Jose G. Trevino, University of Florida, Verenigde Staten

Ontvangen: 27 mei 2015; Aanvaard: 25 september 2015; Gepubliceerd: 13 oktober 2015

Copyright: © 2015 Mello et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. Deze studie werd ondersteund door Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; subsidiesǗ072 /2012-5 en 402.283 /2013-9; fellowship aan MCS en RRB), Fundação de Amparo à Pesquisa do Pará (FAPESPA; verlenen #ICAAF 123/2014 tot RRB) en Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; subsidie ​​È9 /07145-9; fellowship aan MFL) als subsidies en gemeenschap awards. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en de tweede grootste oorzaak van kankersterfte in de wereld [1]. Behandeling van GC in een vergevorderd stadium blijft moeilijk, en de prognose is nog steeds slecht, mede als gevolg van een lokaal recidief, tumor invasie en /of metastase. De totale relatieve 5-jaarsoverleving is op dit moment minder dan 20% [2]. Een beter begrip van de biologie van de progressie van deze neoplasie is cruciaal voor het verminderen van de mortaliteit bij de ontwikkeling van nieuwe patiëntenbeheer en therapie.

fosfotransferases, ook bekend als kinases, downstream modulators en effectors van verschillende cellulaire signaaltransductiecascades en een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van neoplastische ziekte [3]. Tot op heden zijn verscheidene proteïne-kinase interagerende geneesmiddelen geregistreerd voor klinische proeven [4]. We eerder uitgevoerde screening kinase eiwitten tot expressie gebracht in GC behulp invangverbinding massaspectrometrie [5, 6] (S1 File) en 22 kinase eiwitten, waaronder SRC Lyn en CKB identificeren, werden gedetecteerd (Tabel S1). Deze drie kinases werden geselecteerd voor verder onderzoek (S1 figuur).

SRC als eerste proto-oncogen ontdekt, en speelt een centrale rol in de cellulaire signaaltransductiewegen. SRC afwijkende activiteit wordt waargenomen bij verschillende menselijke kankers, waaronder GC [7-9], en het kan belangrijk tijdens tumorontwikkeling en progressie [10, 11] zijn. De mitogene werking van SRC is, tenminste gedeeltelijk, bemiddeld door de inductie van MYC, een celcyclus regulator en transcriptiefactor [12, 13]. Onze fractie eerder beschreven MYC opregulatie in menselijke GC en N-methyl- nitrosoureum-behandelde primaten [14-19]. Omdat de activering van SRC, evenals die van andere kinasen, heeft pleiotrope effecten die afhankelijk zijn van het celtype en de context [20], is het toch belangrijk om de mogelijke relatie tussen kinases en MYC expressie in maagkanker en het moleculaire mechanisme begrijpen betrokken zijn bij de regulering.

LYN is een ander lid van de SRC-familie van kinases, en de LYN
gen bevindt zich op chromosoom 8q13. Onze fractie eerder gemeld aanwezigheid van versterkingen van chromosoom 8 (waarop de MYC
gen is ook gelegen) in GC gevallen van Northern Brazilië [16, 21-23] en in alle gevestigde van neoplasie in GC cellijnen deze populatie [24, 25]. Daarom kan dit chromosoom belangrijke genen betrokken bij maagkanker bevatten. Voor zover wij weten, heeft geen eerdere studie onderzocht de rol van LYN en de regelgeving in GC. Echter LYN overexpressie gerapporteerd bij verschillende kankersoorten [26-32]. Bovendien is de regeling van de LYN
door DNA-methylatie werd aangetoond in zowel colorectale kanker en Ewing-sarcoom [33, 34], en LYN
methylatie is waargenomen bij sommige hematopoietische en niet-hematopoietische cellijnen [35]. DNA methylatie is een moleculaire structuur van DNA die nauw samenhangt met genfunctie en celtype-specifieke genfunctie [36]. Bovendien kan DNA methylatie een robuuste biomarker, want het is aanmerkelijk stabieler dan RNA- of eiwit en dus een veelbelovend doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe methoden voor de diagnose en prognose van kanker [36].

CKB is één van twee cytosolische isovormen van creatinekinase en kunnen aan metabole processen waarbij glycolyse in niet-spiercellen [37]. In tegenstelling tot normale cellen, die vooral energieopwekking via oxidatieve fosforylering meeste kankercellen voorkeur aerobe glycolyse, die bekend staat als de Warburgeffect [38]. Interessant is dat de MYC oncogen lijkt verschillende glucose transporters en glycolytische enzymen te activeren, aldus bij te dragen aan de Warburg effect [39]. Onze vorige proteomics onderzoek is gebleken dat verschillende eiwitten die betrokken zijn bij de productie van energie processen werden gedereguleerd in GC monsters en versterkt de Warburg effect in dit neoplasia [40]. De rol van CKB in GC blijft slecht begrepen: sommige transcriptomische studies meldde de opregulatie van CKB
in GC monsters [41, 42], terwijl een ander toonde CKB
downregulatie [43]. Bovendien, als de LYN
gen CKB
methylatie is eerder beschreven in hematologische en vaste kankercellijnen, waaronder GC cellijnen [44]. De methylering van CKB
lijkt verband te houden met de beperkte mate van expressie; Maar verder onderzoek is nog steeds nodig om de regulering van de CKB
door epigenetische veranderingen te begrijpen.

Daarom moeten we eerst gericht op het mRNA en eiwit expressie van SRC, LYN en CKB in een grote evalueren GC set van monsters. Dan hebben we geëvalueerd of deze genen kan worden gereguleerd door DNA-methylatie in de maag carcinogenese. Daarnaast hebben we onderzoek gedaan naar de mogelijke associatie tussen kinase expressie of methylatie en klinische variabelen, evenals MYC expressie en methylatie.

Materiaal en methoden

weefselmonsters

Kinase meningsuiting en methylatie patronen werden geëvalueerd in 138 paren GC monsters en overeenkomstige niet-neoplastische monsters maagweefsel verkregen van patiënten die gastrectomie ondergingen in Noord Brazilië. Alle patiënten hadden negatieve geschiedenis van blootstelling aan chemotherapie of radiotherapie voor de operatie, en er was geen comorbiditeit andere diagnose kanker. Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van João de Barros Barreto University Hospital (Protocolļ737). Schriftelijke informed consent met goedkeuring van de ethische commissie werd verkregen van alle patiënten voorafgaand aan de collectie specimen.

Een deel van elk ontleed tumor monster werd in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE). Delen van FFPE weefsel werden gekleurd met hematoxyline-eosine voor histologisch onderzoek of gebruikt voor immunohistochemie analyse (IHC). Extra porties elke tumor en gepaarde non-neoplastische weefselmonsters werden snel bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot eiwit en nucleïnezuur zuivering.

Alle monsters werden geclassificeerd volgens de Laurén [45 ], en de tumoren werden opgevoerd volgens de TNM staging criteria [46]. De aanwezigheid van Helicobacter pylori
een klasse I carcinogeen, gastrische monsters werd gedetecteerd door de snelle ureasetest en de virulentie factor cytotoxiciteit geassocieerd gen A (CagA gen) werd gedetecteerd met PCR met gebruik van DNA tegelijkertijd gezuiverde eiwitten en mRNA, zoals eerder uitgevoerd door onze fractie [47]. Epstein-Barr virus (EBV) gedetecteerd door RNA in situ hybridisatie [47].

Voor 49 van deze paren van neoplastische en niet-neoplastische monsters onderzochten we de MYC immunoreactiviteit mRNA expressie en methyleringsstatus gegevens die eerder uitgegeven door de groep [18].

Protein, mRNA en DNA-zuivering

Totaal eiwit, mRNA en DNA werd geïsoleerd uit de maag gelijktijdig weefselmonsters met de AllPrep DNA /RNA /eiwit Kit ( Qiagen, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. De eiwitkorrel werd opgelost in een buffer die 7 M ureum, 2 M thioureum, 4% CHAPS, 50 mM DTT, 1% Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, USA) en 0,5% per fosfatase Inhibitor Cocktail 1 en 2 (Sigma -Aldrich, USA), zoals eerder door onze groep [48]. De eiwitconcentraties werden bepaald door de methode van Bradford (Sigma-Aldrich, USA). De RNA-concentratie en kwaliteit werden bepaald met een spectrofotometer NanoDrop (Kisker, Duitsland) en 1% agarosegelen, respectievelijk. De monsters werden opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik.

Eiwitten immunologische analyse

Tumor weefselcoupes (3 of 4 mm dik) werden van paraffine ontdaan in xyleen en gerehydrateerd in een gegradeerde reeks van ethanol. Na warmte-geïnduceerde epitoop werden de weefselcoupes geïncubeerd met primaire monoklonale antilichamen van muizen tegen SRC (verdunning 1: 400; kloon 28, Life Technologies, USA), LYN (verdunning 1: 400; kloon C13F9, Life Technologies, USA) of CKB (verdunning 1: 250; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA). Een universele peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam kit (LSAB System, DakoCytomation, USA) werd gebruikt voor detectie. We gebruikten 3,30-diamino-benzidine /H _{2O 2 (DakoCytomation, Denemarken) als chromogeen en hematoxyline als tegenkleuring. Een eiwit immuunreactiviteit-positief monster werd gedefinieerd als een met 10% of meer neoplastische cellen die positief zijn voor het eiwit waren.}

eiwitexpressie analyse

Western blotanalyse werd uitgevoerd zoals eerder door ons beschreven [49]. Verminderde eiwit (25 ug) van elk monster werd gescheiden door 12,5% SDS-PAGE homogene en elektro-geblot op een PVDF-membraan (Hybond-P, GE Healthcare, USA). Het PVDF membraan werd geblokkeerd met fosfaat gebufferde zoutoplossing die 0,1% Tween 20 en 5% magere melk en overnacht geïncubeerd bij 4 ° C met de overeenkomstige primaire antilichamen: anti-SRC (verdunning 1: 1000, kloon 28, Life Technologies, USA), anti-LYN (verdunning 1: 1000, kloon C13F9, Life Technologies, USA), anti-CKB (verdunning 1: 400; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA) en anti-ACTB (verdunning 1: 250; Ac -15, Life Technologies, USA). Na uitgebreid wassen werd een peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam toegevoegd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Immunoreactieve banden werden gevisualiseerd met behulp van de western blotting Luminol reagens, en de beelden werden verkregen met behulp van een ImageQuant 350 digitaal beeld systeem (GE Healthcare, Zweden). ACTB werd gebruikt als een lading referentiecontrole.

mRNA expressie analyse

Eerst RNA werd reverse getranscribeerd met behulp van de hoge capaciteit cDNA Archive kit volgens het protocol van de fabrikant (Life Technologies, USA) . Complementair DNA werd vervolgens geamplificeerd door real-time reverse transcriptie kwantitatieve PCR (RT-qPCR) middels TaqMan probes verkoop Assays-on-demand Producten voor genexpressie (Life Technologies, USA) en een 7500 Fast Real-Time PCR instrument (Life Technologies , VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). De GAPDH
gen werd geselecteerd als een interne controle voor RNA-ingang en reverse-transcriptie efficiency. Alle RT-qPCRs werden in drievoud uitgevoerd voor zowel het doelwit genen ( SRC Twitter: Hs01082246_m1; LYN Twitter: Hs00176719_m1; CKB
: Hs00176484_m1) en de interne controle ( GAPDH Twitter:. NM_002046.3)

De relatieve kwantificatie van genexpressie werd berekend volgens Livak en Schmittgen [50]. Het overeenkomstige controle monster werd aangewezen als een calibrator uit elke tumor.

DNA-methylatie analyse

De methylatie patroon en de frequentie van kinase genen werden geëvalueerd door methylatie-specifieke PCR (MSP) [51]. De EZ-DNA methylering Lightning ™ Kit (Zymo Research, USA) werd gebruikt om de gDNA wijzigen door bisulfiet behandeling omzetten ongemethyleerde cytosinen in uracillen en beëindiging gemethyleerde cytosinen ongewijzigd. Specifieke primers voor het gen promoters zijn beschreven in Tabel 1 werden

PCR reacties onder gebruikmaking 0,1 umol /l dNTPs, 2 umol /L MgCl _{2, 0,5 pmol primers, 1,25 U Taq DNA polymerase uitgevoerd, en 100 ng bisulfiet-gemodificeerd DNA. Na aanvankelijke denaturatie gedurende 5 minuten bij 94 ° C werden 40 cycli bij 94 ° C gedurende 45 s, de annealing temperatuur (Tabel 1) gedurende 45 s en 72 ° C gedurende 30 s uitgevoerd, gevolgd door een laatste verlenging van 5 min bij 72 ° C. De PCR-producten werden direct aangebracht op 3% agarose gel en geëlektroforeerd. De gel werd gekleurd met SYBR ^{® Safe DNA gel Stain (Life Technologies, USA) en direct zichtbaar onder UV-belichting. Als een positieve controle voor MSP reacties, een gDNA monster was volledig gemethyleerde CpG methylase gebruikt (SSSI, New England Biolabs, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Voorts primers voor het detecteren van de wild-type sequentie werden gebruikt om de volledige omzetting van DNA verkregen in de bisulfiet reactie volgen}}

De monsters werden als volgt gestratificeerd. 1) een monster werd gedefinieerd als hypomethylated wanneer een positieve amplificatie produkt werd alleen in de PCR met specifieke primers voor gemethyleerde sequenties gedetecteerd; 2) een monster werd gedefinieerd als gehypermethyleerd als positieve versterking alleen in de PCR werd gedetecteerd met specifieke primers voor gemethyleerde sequenties; 3) een monster werd gedefinieerd als gedeeltelijk gemethyleerde bij positieve amplificatie gedetecteerd in de PCR met de twee primersets.

De specifieke primers en MSP resultaten werden bevestigd met een bisulfiet sequencing PCR (BSP) benadering [52] . BSP werd ook gebruikt om het percentage methylatie evalueren. De primers en anneling temperaturen BSP worden beschreven in tabel 1. Na amplificatie, de fragmenten werden gezuiverd met het NucleoSpin Gel en PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Duitsland) geligeerd in pGEM-T Easy-vector (Promega, Duitsland) en gekloond in competente E
. coli
JM109 cellen. Na incubatietijd werden witte kolonies geselecteerd voor PCR met M13 voorwaartse (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ') en M13 reverse (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') primers [53]. Na aanvankelijke denaturatie gedurende 3 minuten bij 94 ° C, de PCR-amplificatie bestond uit 35 cycli bij 94 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 90 s werden herhaald, gevolgd door een laatste verlenging 5 minuten bij 72 ° C. De PCR-producten werden gevisualiseerd in agarosegel. Zes klonen werden gekozen voor zuivering en sequentie in een automatische sequencer ABI310 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Alle sequenties werden uitgelijnd met BioEdit v7.0.5 [54], en de methylatie analyses werden uitgevoerd met de BIQ Analyzer software [55]. Het percentage methylatie voor elk monster werd berekend door het aantal gemethyleerde CpGs te delen door het totale aantal CpGs sequentie (CpGs in alle zes klonen).

Statistische analyses

De gegevens worden getoond als de frequentie, de mediaan en interkwartielafstand (IQR). De Shapiro-Wilk test werd gebruikt om de verdeling van de leeftijd, mRNA en eiwitexpressie percentage methylatie data evalueren en de passende nieuwe test voor statistische vergelijkingen bepalen. De Mann-Whitney test werd gebruikt om mogelijke verbanden tussen kinase mRNA of eiwitexpressie en categorische variabelen, zoals immunoreactiviteit, methylatiepatroon en klinische en pathologische kenmerken te onderzoeken. De Mann-Whitney test werd gebruikt om mogelijke associaties tussen het percentage methylatie en immunoreactiviteit en klinische en pathologische kenmerken te onderzoeken. Wilcoxon test werd gebruikt om het percentage methylatie tussen paren neoplastische en niet-neoplastische monsters te vergelijken. Een associatie tussen categorische variabelen werd geanalyseerd met behulp van de Chi-kwadraat (χ ^{2) te testen. Een Spearman correlatie test werd toegepast om de mogelijke correlatie tussen mRNA en eiwitexpressie en promoter methylatie evalueren. Een p-waarde van minder dan 0,05 werd als significant beschouwd. Bonferroni aanpassing van de p-waarde werd toegepast bij meervoudige vergelijkingen werden uitgevoerd met de alfaniveau gedeeld door het aantal vergelijkingen.}

Resultaten

Kinase expressie maagtumoren

Non-atypische maag cellen niet aanwezig op SRC of LYN immunoreactiviteit (Fig 1A en 1C). Echter werd SRC immunoreactiviteit waargenomen in dysplastische cellen. Celmembraan cytoplasmatische immunoreactiviteit voor SRC en LYN werd gedetecteerd in neoplastische cellen (figuur 1B en 1D) en LYN presenteerde ook nucleïnezuur immunoreactiviteit. CKB immunoreactiviteit gedetecteerd in het cytoplasma of in de celmembraan in niet-neoplastische cellen de maag (figuur 1E). Daarentegen GC cellen niet aanwezig CKB immunoreactiviteit (Figuur 1F).

SRC Lyn en CKB immunoreactiviteit werd gedetecteerd in 72 (52,2%), 66 (47,8%) en 0 (0%) van de tumor samples. SRC en LYN immunoreactiviteit werden geassocieerd met een hogere mRNA en eiwit niveaus in GC monsters (p < 0,001 voor alle vergelijkingen, Mann-Whitney-test toont; 2A, 2C, 2E en 2G). De eiwit- en mRNA-niveaus van SRC verhoogd ten minste 1,5-maal (ten minste 50% toename in expressie) bij 67 (48,6%) en 80 (58%) respectievelijk GC monsters ten opzichte van elkaar passende niet-neoplastische maag monsters (figuur 2B, 2D en 2K). Bovendien waren de eiwit- en mRNA-niveaus van LYN in 36 (26,1%) en 72 (52,2%) GC monsters respectievelijk (2f, 2H en 2K) met ten minste 1,5-voudig. Omgekeerd downregulatie van CKB mRNA en eiwit (ten minste 50% afname van expressie) werd gedetecteerd in 104 (75,4%) en 49 (35,5%) GC monsters (Fig 2I, 2J en 2K). Een sterke en directe correlatie werd waargenomen tussen mRNA en eiwitexpressie voor SRC (p < 0,001, ρ = 0,856, Spearman correlatie test), LYN (p < 0,001, ρ = 0,762) en CKB (p < 0,001, ρ = . 0,819)

de immunoreactiviteit van SRC werd geassocieerd met de immunoreactiviteit van LYN (p < 0,001, χ ^{2-test), met 52 (37,7%) van de GC monsters presenteren immunoreactiviteit voor beide eiwitten. Daarnaast werd een directe correlatie waargenomen tussen SRC en LYN eiwit (p < 0,001, ρ = 0,556) en mRNA (p < 0,001, ρ = 0,779) expressie. De niveaus van CKB eiwit en mRNA expressie werden omgekeerd gecorreleerd met SRC (p < 0,001, ρ = -0,734; p < 0,001, ρ = -0,806, respectievelijk) en LYN (p < 0,001, ρ = -0,643; p <. 0.001, ρ = -0,703, respectievelijk)}

In tabel 2 zijn de resultaten voor SRC, LYN en CKB meningsuiting en de klinisch-pathologische kenmerken. De tumoren van patiënten met late-onset GC die een significant hogere SRC en LYN eiwit (IHC en Western blotting) en mRNA (door RT-qPCR) expressie, alsmede minder CKB eiwit expressie door Western blotting, vergeleken met een vroeg begin CG monsters (p < 0,05 voor alle vergelijkingen; Tabel 2). Verhoogde eiwit en mRNA expressie van SRC en LYN verkleinde CKB expressie werden geassocieerd met een vergevorderd stadium, dieper tumorinvasie en de aanwezigheid van lymfeklieren en metastasen (p < 0,05 voor alle vergelijkingen; Tabel 2)
<. p> Een geleidelijke aanzienlijke toename SRC eiwit (door Western blotting) en mRNA expressie werd waargenomen die overeenkomt met de tumor stadium (p < 0,008, voor de meeste vergelijkingen, Mann-Whitney-test, gevolgd door Bonferroni-correctie toont; 3A en 3B) . Daarentegen werd een geleidelijke significante afname CKB eiwit en mRNA expressie waargenomen die overeenkomt met de tumor stadium (p < 0,008, voor de meeste vergelijkingen, figuur 3G en 3H). Met betrekking tot de LYN expressie, hebben we niet een significant verschil tussen de fases observeren I en II of tussen fasen III en IV. Echter, stadium I en II waren significant verschillend van stadia III en IV (p < 0,008, voor deze vergelijkingen toont; 3D en 3E).

Kinase gen methylatie patronen in de maag monsters

Table 3 toont het methyleringspatroon van de bestudeerde eiwitkinasen in neoplastische en niet-neoplastische maag monsters van MSP. Ongeveer 60% en 30% van de GC-monsters gepresenteerd positieve versterking met alleen de niet-gemethyleerd primer set (hypomethylated monsters) voor de SRC Kopen en LYN
genen, respectievelijk (Fig 4A en 4B). Hypomethylatie van deze genen werd niet waargenomen in niet-neoplastische monster. Daarom is de frequentie van SRC Kopen en LYN
hypomethylatie GC was significant hoger dan bij niet-neoplastische maag monsters (p < 0,001 voor alle vergelijkingen; χ ^{2 proef gevolgd door Bonferroni correcties).}

de BSP analyse bevestigde de MSP-analyse. Door BSP, 82 (59,4%) van neoplastische monsters en 0 (0%) van de niet-neoplastische monsters gepresenteerd een gekloneerde sequentie zonder CpG methylering in SRC
promoter. Bovendien, 4 (2,89%) en 1 (0,72%) van neoplastische en niet-neoplastische monsters gepresenteerd een gekloneerde sequentie zonder CpG methylering in LYN
promoter, respectievelijk. Door BSP, het percentage van de SRC
[0,135 (0,31) versus
0,563 (0,23); p < 0.001] en LYN
[0,238 (0,40) versus
0,7063 (0,26); p < 0.001] methylatie was lager in neoplastische monsters dan bij niet-neoplastische monsters (Fig 5A en 5B).

De SRC Kopen en LYN
methylatie patronen van de neoplastische en niet- -neoplastic monsters terwijl in verband gebracht (p < 0,001, voor zowel de analyses; χ ^{2 test). We zagen dat 70/81 (86,4%) van de tumoren met hypomethylated SRC
gepresenteerd gedeeltelijke methylatie van dit gen in de overeenkomende niet-neoplastische monster. Daarnaast vonden we dat 37/41 (90,24%) van tumoren met hypomethylated LYN
gepresenteerd gedeeltelijke methylatie van dit gen in de overeenkomende niet-neoplastische monster. SRC Kopen en LYN
gedeeltelijke methylatie in niet-neoplastische monsters werd vaker waargenomen bij patiënten presenteren tumormonsters met hypomethylatie van dit gen in vergelijking met tumoren met gedeeltelijke methylatie (p < 0,001, voor zowel analyses) of hypermethylatie (p < 0,001 voor beide analyses). Verder gedeeltelijk gemethyleerde LYN
in niet-neoplastische monsters werd ook vaker waargenomen bij personen presenteren tumormonsters met gedeeltelijke methylatie van dit gen in vergelijking met tumoren met hypermethylering (p = 0,004). Door BSP, zagen we ook dat het percentage van de SRC
(p < 0,001, ρ = 0,6902; figuur 5D) en LYN
(p < 0,001, ρ = 0,739; Fig 5E ) methylering van neoplastische en niet-neoplastische monsters werden gecorreleerd.}

CKB
gedeeltelijke en hypomethylatie werd zowel in neoplastische en niet-neoplastische monsters waargenomen. Echter, 48 (39%) van GC monsters gepresenteerd CKB
hypermethylering (Figuur 4C), die niet werd gedetecteerd in de niet-neoplastische monsters. Bovendien is de frequentie van CKB
-hypermethylated monsters was significant hoger in neoplastische vergelijking met niet-neoplastische maag monsters (p < 0,001) en CKB
gedeeltelijke methylatie was ook significant vaker in GC dan bij niet-neoplastische monsters (p < 0,001). Door BSP, het percentage van de CKB
methylatie was hoger in neoplastische monsters dan bij niet-neoplastische monsters [0,511 (0,42) versus
0,133 (0,12); p < 0,001; Figuur 5C]. Gekloneerde sequenties zonder CpG methylering gedetecteerd in 4 (2,89%) en 0 (0%) van neoplastische en niet-neoplastische monsters, respectievelijk.

De CKB
methyleringspatroon van de neoplastische en niet -neoplastic monsters bleek geassocieerd te worden (p = 0,014, door χ ^{2 test). Een 2x2-analyse met behulp van de χ 2-test is gebleken dat paren waarin de tumor samples gepresenteerd gehypermethyleerd CKB
en de bijbehorende non-neoplastische monsters presenteerde hypomethylatie van dit gen kwamen vaker dan paren van tumoren met hypermethylering en geëvenaard non-neoplastische monsters met gedeeltelijke methylatie (p = 0,0381), maar deze bevinding geen statistische significantie te bereiken als de Bonferroni correctie werd toegepast (adjusted α = 0,05 /3 = 0,0167). Echter, door BSP namen wij waar dat het percentage CKB
methylering van neoplastische en niet-neoplastische monsters werden omgekeerd gecorreleerd (p < 0,001, ρ = -0,375; Figuur 5F).}

Een directe correlatie werd waargenomen tussen de SRC Kopen en LYN
methylatie patronen in de non-neoplastische monsters (p < 0,001, ρ = 0,627). Daarnaast werd er een omgekeerde correlatie aangetoond tussen de SRC Kopen en CKB
(p < 0,001, ρ = -0,467) en LYN Kopen en CKB
(p < 0,001, ρ = -0,359) methylatie. Echter, in GC monsters werd een direct verband waargenomen tussen de methylatie percentage van de drie onderzochte kinases: SRC Kopen en LYN
(p < 0,001, ρ = 0,840); SRC Kopen en CKB
(p < 0,001, ρ = 0,684); LYN Kopen en CKB
(p < 0,001, ρ = 0,663).

Methylering regulering van kinases

Om de epigenetische regulatie van de bestudeerde helderen genen, evalueerden we de mogelijke associatie tussen de promoter methylering en eiwitten immunoreactiviteit en mRNA en eiwit expressie (door western blotting)

we hebben vastgesteld dat zowel de mRNA en eiwit expressie van SRC (p. < 0,001, ρ = -0,834; p < 0,001, ρ = -0,718; respectievelijk figuur 6A en 6B) en LYN (p < 0,001, ρ = -0,792; p < 0,001, ρ = -0,654; respectievelijk figuur 6D en 6E) was omgekeerd gecorreleerd met het percentage promoter methylatie. Bovendien, tumoren met SRC [0,062 (0,08) versus
0,375 (0,33); p < 0,001; Mann-Whitney-test; Figuur 6C] en LYN [0,127 (0,11) versus
0,500 (0,39); p < 0,001; Figuur 6F] immunologische gepresenteerd lager percentage methylatie dan tumor ontbreekt dit eiwit immunologische

Met betrekking tot CKB regelgeving, werd een direct verband gevonden tussen het percentage van methylatie en het CKB mRNA en eiwit expressie (p. ≪ 0,001, ρ = 0,684; p < 0,001, ρ = 0,686; respectievelijk figuur 6G en 6H). Interessant is dat verhoogde CKB eiwit en mRNA expressie werd waargenomen in tumoren met een hypomethylated CKB
promoter vergeleken met tumoren met een gedeeltelijk gemethyleerde promoter (p = 0,015, p = 0,008, respectievelijk Mann-Whitney-test, gevolgd door Bonferroni correcties; S1 figuur). Echter, tumoren met een gehypermethyleerd CKB
promotor presenteerde ook verhoogd eiwit en mRNA expressie in vergelijking met tumoren met een gedeeltelijk gemethyleerde promotor (p < 0,001 voor beide vergelijkingen).

Methylering van kinase promotors en clinicopathologische variabelen

In de niet-neoplastische maagslijmvlies, het percentage van de SRC
(p = 0,010, ρ = -0,218) en LYN
(p = 0,003, ρ = -0,248) methylatie werd (zwak) omgekeerd gecorreleerd met de leeftijd van de patiënten in de spreekkamer, hoewel er geen andere vereniging werd waargenomen tussen het percentage van methylatie en geslacht, H
. pylori Kopen en EBV infectie in de non-neoplastische monsters (p > 0,05, Mann-Whitney test).

Tabel 4 toont het verband tussen het percentage methylatie in GC monsters en klinisch-pathologische kenmerken . In neoplastische monsters, het percentage van de SRC
(p = 0,002, ρ = -0,267), LYN
(p = 0,014, ρ = -0,208) en CKB
(p = 0,024, ρ = -0,192) methylering (zwak) omgekeerd gecorreleerd met de leeftijd van de patiënten in de spreekkamer. Bovendien is het percentage van de SRC
(p = 0,002), LYN
(p = 0,015) en de CKB
(p = 0,024) methylering was lager in late-onset dan in early-onset GC samples. Daarnaast hebben we geconstateerd dat SRC methylatie was lager in niet-cardia GC in relatie tot Cardia GC (p = 0,028).

Verminderde percentage van de SRC
, LYN Kopen en CKB
methylatie geassocieerd met een vergevorderd stadium, dieper tumorinvasie en de aanwezigheid van lymfeklieren en metastasen (p < 0,05 voor alle vergelijkingen; Tabel 4). De vergelijking van SRC Kopen en LYN
methylatie patroon van MSP en klinisch-pathologische kenmerken gepresenteerd vergelijkbare resultaten (S2 tabel). Echter, gedeeltelijke methylatie van CKB
door MSP werd ook vaker gevonden dan hypermethylatie in T3 /T4-tumoren (p = 0,008; S2 Table). CKB
gedeeltelijke methylatie was ook vaker dan hypermethylering (p < 0,001) en hypomethylatie (p = 0,009; S2 Table). In tumoren van mensen met metastasen op afstand ten opzichte van tumoren van individuen zonder metastasen op afstand

Een geleidelijke afname van het percentage SRC Kopen en LYN
methylering waargenomen die overeenkomt met de tumor stadium (p < 0,008, voor de meeste vergelijkingen, Mann-Whitney toets gevolgd door Bonferroni correctie toont; 3C en 3F). Wat CKB
methylering, 12 van 14 (85,7%) van de monsters van GC in de fase I gepresenteerd 73,3% van methylatie. Het percentage CKB
methylering was hoger in fase I dan in stadium II, III en IV (p < 0,008, voor de meeste van deze vergelijkingen, figuur 3I). Omgekeerd is het percentage CKB
methylatie werd significant verminderd bij het stadium IV ten opzichte van de andere fasen (p < 0,008 voor deze vergelijkingen, figuur 3I).

kinases en MYC relaties

We onderzochten MYC immunoreactiviteit mRNA expressie en methyleringsstatus gegevens voor een reeks van 49 van de bestudeerde paren neoplastische en niet-neoplastische monsters.

• PLoS ONE: klinische betekenis van MiR-137 Expression bij patiënten met maagkanker na radicale Gastrectomy
• PLoS ONE: Exclusieve Vereniging van p53 mutatie met Super-High Methylering van tumorsuppressorgenen in de p53-route in een unieke MaagKanker Phenotype