PLoS ONE: Vascular CXCR4 Expression - een roman Antiangiogene Target bij maagkanker

De abstracte

Achtergrond

G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn voornaamste kandidaten voor nieuwe preventie en behandeling van kanker strategieën. We hebben gezocht naar differentieel tot expressie GPCR's in knooppunt positieve maagcarcinomen.

Methodologie /voornaamste bevindingen

Verschillende expressie van GPCR's in drie knooppunt positieve versus drie knooppunt negatieve intestinale soort maagcarcinoma werd geanalyseerd door gen-array technologie. De kandidaat-genen CXCL12 en zijn receptor CXCR4 werden gevalideerd door real-time reverse transcriptie polymerase kettingreactie in een onafhankelijke set van 37 maag carcinomen. Vertaling bestudeerd door immunohistochemie in 347 maagcarcinomen behulp van weefsel microarrays als in 61 overeenkomende lymfeknoop metastasen. Eiwit expressie werd gecorreleerd met klinisch-pathologische kenmerken van de patiënt en overleving. 52 GPCRs en GPCR-gerelateerde genen waren up- of down-gereguleerd in knooppunt positieve maagkanker, met inbegrip van CXCL12. Differentiële expressie van CXCL12 werd bevestigd door RT-PCR en gecorreleerd met lokale tumorgroei. CXCL12 immunopositivity werd negatief geassocieerd met metastasen op afstand en tumor rang. Slechts 17% van maag- carcinomen vertoonde CXCR4 immunopositive tumorcellen, die werd geassocieerd met hogere lokale tumor omvang. 29% van de maag carcinomen vertoonde CXCR4 positieve tumor microvaten. Vasculaire CXCR4 expressie was significant geassocieerd met een hogere lokale tumor omvang alsmede hogere UICC-fasen. Wanneer die zowel, CXCL12 in tumorcellen en CXCR4 in tumor microvaatjes, deze tumoren werden ook zeer significant geassocieerd met hogere T- en UICC-fasen. Drie metastasen toonde vasculaire CXCR4 expressie terwijl tumorcellen CXCR4 geheel ontbrak in alle gevallen. De expressie van CXCL12 en CXCR4 had geen invloed op de overleving van patiënten.

Conclusies /Belang

Onze resultaten staven het belang van GPCR's over de biologie van de maag carcinomen en het bewijs leveren dat de CXCL12-CXCR4-route misschien een nieuw veelbelovend antiangiogene doelwit voor de behandeling van maag- carcinomen zijn

Visum:. Ingold B, Simon E, Ungethüm U, Kuban RJ, Müller BM, Lupp a, et al. (2010) Vascular CXCR4 Expression - een roman Antiangiogene Target bij maagkanker? PLoS ONE 5 (4): e10087. doi: 10.1371 /journal.pone.0010087

Editor: Irene Oi Lin Ng, de Universiteit van Hong Kong, Hong Kong

Ontvangen: 22 september 2009; Aanvaard: 16 maart 2010; Gepubliceerd: 8 april 2010

Copyright: © 2010 Ingold et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Berliner Krebshilfe (Berlijn Canceraid). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is een van de meest voorkomende vormen van kanker in de wereld, de rangschikking van de vierde plaats in het algemeen frequentie en goed voor meer dan 650.000 doden per jaar [1]. De mortaliteit van maagkanker wordt alleen excelleerde door longkanker. Vroege maagkanker veroorzaakt vaak geen specifieke symptomen. Het ontbreken van vroege symptomen vertraagt ​​de diagnose. Bijgevolg, 80-90% van de westerse patiënten met maagkanker aanwezig met gevorderde tumoren bij lokale of metastasen reeds [1] opgetreden. De lymfeklierstatus name de verhouding van metastase-positieve /metastase-negatieve lymfklieren, is de sterkste prognostische factor maagkanker [2]. De 5-jaarsoverleving van patiënten met 1-6 lymfekliermetastasen is 44% en eindigend met slechts 11% bij patiënten met meer dan 15 positieve lymfeklieren. Gedeeltelijke of totale gastrectomie, in combinatie met radiotherapie en /of chemotherapie zoals aangegeven, belooft volledige genezing alleen bij patiënten met een vroeg stadium van de ziekte. In metastatische ziekte momenteel gebruikte radiotherapeutische en chemotherapeutische regimes slechte werkzaamheid en therapieresistente ziekteprogressie leidt tot de dood binnen enkele maanden [3]. Tot op heden bestaat er geen specifieke predictieve merker zoals HER2 in borstcarcinoom, EGFR in niet kleincellige longcarcinoom of K-RAS colorectaal carcinoom, die een meer geïndividualiseerde therapeutische strategie maakt. Daarom zijn nieuwe moleculaire gerichte therapeutische benaderingen nodig.

G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs) verreweg de grootste familie van celoppervlak moleculen, die signalen via relais GTP-bindend eiwit (G-proteïne ) geïnitieerde second messenger cascades in de cel [4]. GPCRs worden gereguleerd door vele agonisten, maar alle delen een karakteristieke kern bestaat uit zeven transmembranaire α-helices, die verbonden zijn door middel van drie intra- en drie extracellulaire lussen. Deze receptoren controle belangrijke fysiologische functies, waaronder neurotransmissie, hormonen en enzymen vrijkomen van endocriene en exocriene klieren, immuunreacties, samentrekken van de spieren en de regulering van de bloeddruk tot een paar [4].

kwaadaardige cellen vaak kapen de normale fysiologische noemen functies van GPCRs te overleven, prolifereren autonoom en omzeilen van het immuunsysteem. Verder GPCR's spelen een centrale rol in de tumor-geïnduceerde angiogenese en uitzaaiing van kanker. Veel vaste tumoren afhankelijk GPCRs een angiogene reactie uit te lokken, hetzij door inwerking op endotheliale of stromale componenten rechtstreeks of door regulatie van de vrijgave of activiteit van andere angiogene mediatoren zoals vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) of basische fibroblast groeifactor (bFGF) van stromale en immuuncellen [5]. Kankercellen manipuleren GPCR's aan endotheelcellen te trekken en leiden hen naar de tumor massa binnen te dringen, waardoor nieuwe schepen aan voedingsstoffen en zuurstof vormen. Veel kankers metastaseren naar specifieke organen, wat vaak wordt veroorzaakt door afwijkende expressie van GPCR in kankercellen - vooral chemokinereceptoren - gelijktijdig met de afgifte van chemokinen uit de secundaire organen [6]

medicijnafgifte, tumor imaging. en biomarkers voorspellen maligniteit zijn toepassingen van GPCR's te benadrukken: Radio-gelabelde peptiden die binden aan GPCRs misschien brede toepassingsmogelijkheden voor kankerdiagnose en therapie [7]. Liganden die GPCRs binden zijn ook geconjugeerd aan cytotoxische middelen specifiek te richten kwaadaardige cellen die deze receptoren tot overexpressie brengen, dus bijwerkingen verminderen [8]. Bovendien zou GPCR's zijn waardevolle biomarkers voor de diagnose van kanker zoals blijkt uit studies bij prostaatkanker [9].

Daarom zijn we gericht op (i) een beoordeling van differentieel tot expressie GPCRs in nodale negatieve versus nodale positieve intestinale soort maagkanker door GeneChip-array techniek. (Ii) Transcriptie van kandidaatgenen werd bevestigd met real-time reverse transcriptie polymerase ketenreactie (real-time RT-PCR). We evalueerden de vertaling en histoanatomical verdeling van de chemokine CXCL12 en de bijbehorende chemokine receptor CXCR4 in een grote reeks van 347 maagcarcinoom monsters immunohistochemisch met de tissue microarray-technologie en in 61 overeenkomende lymfkliermetastasering conventionele objectglaasjes (iii). We gecorreleerd de translationele expressie patronen met een ruime set van klinisch-pathologische kenmerken van de patiënt, met inbegrip van de patiënt te overleven (iv).

Resultaten

differentiële genexpressie in knooppunt negatief en knooppunt positieve maagkanker weefsel

Ten eerste hebben we de differentiële expressie van mRNA in een reeks van type 6 intestinale maagkanker patiënten (3 met en zonder 3 lymfeknoop metastasen) met de GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array van Affymetrix die 47.000 transcripten en varianten detecteert evenals 38.500 goed gekarakteriseerde menselijke genen. mRNA werd geëxtraheerd en getranscribeerd slechts uit weefsel verkregen uit de primaire tumoren. Een totaal van 115 transcripten bleken up- te zijn en 219 worden down-gereguleerd in knooppunt positieve maagkanker in vergelijking met knooppunt negatieve maagkanker (tabel S1). Vervolgens hebben we gezocht naar differentieel tot expressie GPCRs. We identificeerden 52 GPCRs en GPCR-gerelateerde genen, die op- of neerwaarts gereguleerd met een voudige verandering factor >waren;. 1.5 (tabel S2)

In silico
analyse

We hebben toen zochten de Entrez
databank van de " National Center for Biotechnology Information (NCBI)
" voor inzendingen van de GPCR's en GPCR-liganden en hun mogelijke rol in de tumor biologie . De betekenis van de angiotensine II type 1 receptor bij maagkanker is eerder door onze eigen groep [10] geverifieerd. Verschillende studies hebben aangetoond dat de expressie van de Duffy bloedgroep chemokine receptor (DARC) omgekeerd gecorreleerd met de prevalentie en prognose van prostaatkanker [11] - [13]. In het diermodel van borstkanker de expressie van EDG2 gecorreleerd met de incidentie van longmetastasen [14]. FPRs mediëren het effect annexine 1 op celmotiliteit en invasie, die belangrijk zijn voor het metastatische potentieel van tumorcellen [15] zijn. Lgr5 werd onlangs aangetoond dat een stamcel marker van cellen van de dunne darm en dikke darm en stamcellen specifiek verlies van Apc resulteert in progressief groeiende neoplasieën [16]. Tezamen zijn deze gegevens bewijzen dat onze benadering geïdentificeerd GPCRs en GPCR-liganden die betrokken kan zijn bij maagkanker biologie. Met betrekking tot chemokine-receptoren en chemokines, de uitdrukking van de chemokines CCL2 en CXCL12 werden verhoogd in nodale positieve maagkanker in vergelijking met knooppunten negatieve gevallen (aanvullende tabel S2). Omdat de CXCL12-CXCR4 as speelt een prominente rol in tumorgenese, het bevorderen van angiogenese en migratie van tumorcellen metastasen [17] - [19], hebben we gekozen voor CXCL12 en zijn receptor CXCR4 voor verdere analyses

transcriptie van. CXCL12 en CXCR4 bij maagkanker

De differentiële expressie van CXCL12- en CXCR4-mRNA werd gevalideerd door real-time RT-PCR in een onafhankelijke set van 37 intestinale soort maagkanker monsters. We vergeleken non-neoplastische mucosa de primaire tumor en primaire tumoren van knooppunt negatief primaire tumoren van knobbelpositief kankers.

CXCL12 expressie was significant verhoogd in maagcarcinoom in vergelijking met niet-neoplastische mucosa (p = 0,033 ). Bevestiging van de reeks data, was ook CXCL12 uitdrukking up-gereguleerd in nodale positieve maagcarcinoom in vergelijking met nodale negatieve gevallen. (; Figuur 1a p = 0,132) Echter, dit verschil niet statistisch significant. Betreffende lokale tumorgroei, was er geen significant verschil in CXCL12 expressie in pT1 /T2 stadium tumor versus pT3 /T4 tumoren. Maar interessant, CXCL12 expressie vertoonden een significante associatie in pT1 /pT2a versus pT2b /T3 /T4 (p = 0,049; figuur 1b)

Er was geen verschil CXCR4 meningsuiting in maagcarcinoom versus niet-neoplastisch weefsel. (p = 0,229), noch in nodale negatieve versus nodale positieve maagcarcinoom (p = 0,22; figuur 1c). Het vergelijken van CXCR4 expressie met de lokale tumor mate CXCR4-mRNA-niveaus verhoogd met de lokale tumorgroei. (P = 0,079; figuur 1d)

Vertaling van CXCL12 in maagcarcinoom, correlatie met klinisch-pathologische parameters en overleving analyses

De vertaling en histoanatomical distributie van CXCL12 werd vervolgens onderzocht door immunohistochemie in 347 maagcarcinoom monsters. In 291 gevallen, CXCL12 immunoreactiviteit was belastbaar. Tumorcellen uitgedrukt CXCL12 in 244 van de 291 (84%) monsters. Een sterke cytoplasmatische en membraneuze immuunreactie waargenomen in 143 (49%) gevallen en een zwakke kleuring in 101 (35%). 47 tumoren (16%) geen CXCL12-immunoreactiviteit. Alle tumormonsters vertoonden een duidelijke CXCL12 positiviteit van de vasculaire endotheelcellen, die diende als een inwendige positieve controle (figuur 2a-c). De statistische analyses toonden een significante correlatie tussen de expressie van CXCL12 in tumorcellen en metastasen (p = 0,043) en tumorgraad (p = 0,0064). Alle andere clinicopathologische parameters toonde geen associatie met CXCL12 expressie in tumorcellen (tabel 1). Bij het delen van de cohort in twee groepen, d.w.z. intestinale type en soort diffuus maagcarcinoom, werd geen correlatie gevonden tussen CXCL12 expressie en eventuele clinicopathologische parameter van beide groepen (gegevens niet getoond). De CXCL12 expressie in tumorcellen had geen invloed op de overleving van patiënten (hele groep: p = 0,830; intestinaal soort carcinoom: p = 0,766; diffuus soort carcinoom: p = 0,817).

Vertaling van CXCR4 in maagcarcinoom, correlatie met klinisch-pathologische parameters en overleving analyses

De vertaling van CXCR4 werd ook bestudeerd door immunohistochemie. Immunoreactiviteit in tumorcellen was belastbaar in 293 tumormonsters, waarvan slechts 6 (2%) vertoonden een eenduidig ​​membraankleuring (categorie 2+ Figuur 2d). Het merendeel van de CXCR4 positieve tumor specimens toonde slechts een zwakke cytoplasmatische CXCR4 immunoreactiviteit (categorie 1 +, 44 gevallen, 15%; figuur 2e). CXCR4 nucleaire immunoreactiviteit werd niet waargenomen in elk geval en elk celtype. Een totaal van 83% (243 van 293) van de gastrische carcinomen waren immunonegative voor CXCR4, de meeste van hen tonen gelijktijdig CXCR4 positieve leukocyten als een inwendige positieve controle (figuur 2f). Interessant, zoals eerder waargenomen in colorectale carcinomen, 86 of 293 gastrische carcinomen (29%) toonden CXCR4 positieve bloedvaten in de tumor stroma met een sterke CXCR4 immunoreactiviteit van endotheliale cellen (figuur 3a). De vasculaire aard van deze delicate structuren werd bevestigd door een CD34 immunokleuring (figuur 3b).

Bij het correleren CXCR4 expressie in tumorcellen met diverse klinische en parameters, werd CXCR4 expressie significant geassocieerd met hogere lokale tumor omvang (T-statuut; p = 0,030). Echter geen verdere associaties van tumorale expressie CXCR4 en andere variabelen clinicopathologische gevonden (tabel 2). Bij het analyseren van de subgroep van intestinale soort maagcarcinoma werden geen associaties gevonden met enige klinisch-parameter (gegevens niet getoond).

Vervolgens bestudeerden we het verband tussen CXCR4 expressie in endotheelcellen (vasculaire CXCR4 expressie vCXCR4) tumor microvaten en diverse clinicopathologische parameters. Interessant is dat de expressie van CXCR4 in microvaten gecorreleerd zeer sterk van lokale tumorgroei (T-categorie; p = 0,0001) en met de UICC-tumor stadium (p = 0,0059). Zelfs in de subgroepen van intestinale type en diffuus soort maagcarcinoom, werd vCXCR4 expressie significant geassocieerd met lokale tumor mate (intestinaal Type: p = 0,004; diffuse Type: p = 0,030) en UICC-tumorstadium (intestinaal Type: p = 0,020) . Verder vCXCR4 expressie was significant geassocieerd met leeftijd van de patiënt (p = 0,0148) in de gehele groep (tabel 3).

Survival analyse bleek dat CXCR4 expressie in tumorcellen van maagcarcinoom en in microvaatjes tumor had geen invloed . op overleving

Gelijktijdige CXCL12 /vCXCR4 expressie in maagcarcinoom

Aangezien CXCL12-CXCR4 as aangetoond is betrokken bij tumorprogressie [17] - [19], onderzochten we het verband van de gelijktijdige expressie van CXCL12 en vCXCR4 met klinische en pathologische parameters. Inderdaad, werden CXCL12-vCXCR4 positieve tumoren geassocieerd met een hogere lokale tumor mate (p = 0,0014) en hogere UICC stadia (p = 0,017). Maar het had geen effect op de overleving van patiënten, zelfs in de subgroepen van darm- en diffuse het type maagcarcinoom.

Expression patroon van CXCL12 en CXCR4 in bijpassende lymfkliermetastasen

De CXCL12-CXCR4 as is gerapporteerd betrokken te zijn bij metastatische processen in verschillende tumor entiteiten. Onderzocht we CXCL12 en CXCR4 immunoreactiviteit in een subset van 61 overeenkomende lymfeknoop metastasen. De CXCL12 expressiepatroon was beschikbaar voor 46 metastasen. Over het geheel genomen 4 lymfekliermetastasen waren CXCL12 negatief als hun overeenkomstige primaire tumor. 40 lymfekliermetastasen vertoonden een duidelijke CXCL12 positiviteit op basis van de primaire tumor. De intensiteit van kleuring was zeer heterogeen tonen sterk positief tumorcellen grenzend aan flauw lood tumorcel clusters. Echter, twee metastasen toonde immunoreactiviteit CXCL12 hoewel geen CXCL12 expressie in de primaire tumor aangetroffen.

CXCR4 immunoreactiviteit werd in 54 lymfeknoop metastasen onderzocht. Interessant is dat geen van hen toonde enige CXCR4 uitdrukking. Zelfs die tumoren (n = 6), die een zwakke CXCR4 positiviteit in de primaire tumor, ontbrak CXCR4 expressie in de overeenkomstige lymfeknoop metastasen. Echter, alle metastasen toonde duidelijk CXCR4 positieve lymfocyten, die diende als interne positieve controle. Interessant is dat in drie gevallen intratumorale CXCR4 positieve haarvaten waren detecteerbaar.

Discussie

G-eiwit gekoppelde receptoren vormen de grootste familie van transmembraan receptoren. Vijf procent van alle menselijke genen coderen voor meer dan 800 verschillende GPCRs en ongeveer 80 verschillende liganden geïdentificeerd tot nu toe [20]. GPCRs zijn de meest voorkomende farmacologische doelen in de geneeskunde, d.w.z. bijna 30% van alle geneesmiddelen gericht tegen GPCR. Het bewijs groeit dat GPCRs ook veelbelovende targets voor de behandeling van kanker kan zijn. In deze studie gericht we GPCRs die differentieel uitgedrukt in knooppunt positieve maagkanker en dus kan worden beschouwd als toekomstige doelstellingen voor de maag de behandeling van kanker te vinden. We hebben 52 GPCRs en GPCR-gerelateerde genen die up- of down-gereguleerd in knooppunt positieve primaire maagkanker weefsel ten opzichte van het knooppunt negatieve kanker. Verscheidene van de GPCR's werden vroeger aangetoond worden betrokken bij tumorbiologie zoals AT1R, EDG2, DARC en FPR1 [10], [11], [14], [15]. Meest interessant, onze lijst ook Lgr5 [16], die onlangs werd aangetoond dat een stamcel marker in de dunne darm en dikke darm. Voorts zijn er specifieke verlies van Apc in Lgr5-positieve cellen resulteert in geleidelijk groeiende neoplasieën. Aldus in silico
validatie van onze gegevens ondersteunden de hypothese dat GPCRs betrokken zijn bij de tumor biologie van maagkanker.

Ons soortgelijke betaling studies met een groep van onafhankelijke patiënten toonde dat de GPCR- CXCL12 ligand tot expressie in tumorcellen van de meeste maagcarcinomen. Verder wordt CXCL12 expressie negatief geassocieerd met metastasen op afstand en tumor rang. Integendeel, slechts 17% van maag- carcinomen vertoonde CXCR4 immunopositive tumorcellen, die werd geassocieerd met hogere lokale tumor omvang. Interessant, ongeveer een derde van de gastrische carcinomen vertoonde CXCR4 positieve tumor microvaatjes. Vasculaire CXCR4 expressie was significant geassocieerd met een hogere lokale tumor omvang alsmede hogere UICC-fasen. Wanneer die zowel, CXCL12 in tumorcellen en CXCR4 in tumor microvaatjes, deze tumoren ook waren significant geassocieerd met hogere T- en UICC-fasen ondersteuning van de rol van de CXCL12-CXCR4 as neo- angiogenese van maagkanker.

Onder de GPCR, het chemokine systeem aanzienlijk bijdraagt ​​aan tumorprogressie door modulatie van de lokale ontstekingsreactie, tumorcelproliferatie, migratie en overleving en neoangiogenesis [4]. De chemokinereceptor CXCR4 aanvankelijk bleek de homing van lymfocyten bij inflammatie reguleren en is een co-receptor voor het menselijke immunodeficiëntievirus (HIV) [21]. Fysiologisch wordt de CXCL12-CXCR4 as die deze migratie van embryonale cellen van het centrale zenuwstelsel, het beenmerg en hart [22], [23]. Het speelt een cruciale rol in metastatische processen zoals getoond borst [24], [25], ovariale [26] en prostaatkanker [27] en CXCL12 wordt sterk tot expressie gebracht in organen die veelvuldige plaatsen van metastasen zoals long, lever en lymfe nodes [28]. In maagcarcinoom, gegevens over de CXCL12-CXCR4 route zijn schaars [29]. Er zijn aanwijzingen dat CXCR4 uitdrukken maagcarcinomen eerder ontwikkelen peritoneale uitbreiding van de tumor en maligne ascites bevat hoge concentraties van CXCL12 [30].

Vergeleken onze genmatrix gegevens die verkregen door RT-PCR en immunohistochemie, het was interessant om op te merken dat de differentiële expressie van CXCL12 in knooppunt positieve maagcarcinoom werd bevestigd op de transcriptie, maar niet op het translationele niveau. Hier, de immunohistochemische detectie van CXCL12 in tumorcellen correleerde alleen met metastasen op afstand en tumor rang maar niet met knooppunten verspreid. Echter, CXCL12 bleek niet alleen in tumorcellen, maar ook endotheel- en stromale cellen [31], en de algehele expressie in het gehele weefsel compartiment moeilijker te beoordelen door immunohistochemie. Integendeel, onze transcriptionele studies gebruikt weefselhomogenaten waarbij alle CXCL12 expressie brengende cellen van tumorweefsel integreren. Niettemin moet er rekening mee dat gentranscriptie niet altijd correleert met mRNA translatie en dat de tumor biologische effect van CXCL12 kan ook afhangen van de aanwezigheid en de verdeling van histoanatomical CXCR4 gehouden worden. Ter ondersteuning van deze bewering, waren we in staat om dat gelijktijdige expressie van CXCL12 in tumorcellen en CXCR4 in tumor microvaten gecorreleerd met de lokale tumorgroei en UICC-tumor stadium te laten zien.

Er werd gemeld dat tumorale CXCR4 positiviteit sterk correleert de ontwikkeling van peritoneale metastasen [30]. Bovendien werd een sterke CXCR4 expressie significant geassocieerd met lymfkliermetastasen, hogere UICC podia en een verminderde 5-jaarsoverleving [32]. Onze resultaten lijken te verschillen van deze eerdere studies. Bij de beoordeling van CXCR4 immunoreactiviteit in tumorcellen, werd een lage expressie tarief waargenomen. Slechts 17% van de tumor toonden een overwegend zwakke immunoreactiviteit CXCR4. Verder zijn alle 61 matching lymfkliermetastasen ontbrak CXCR4 expressie. Dit kleurpatroon kan verklaren waarom bijvoorbeeld intestinaal Type maagcarcinomen, CXCR4 expressie alleen was significant geassocieerd met de lokale tumorgroei (T-categorie), maar niet met andere klinische en pathologische factoren zoals eerder beschreven. We gebruikten een grondig kenmerk CXCR4 antilichaam met een hogere specificiteit dan de handel verkrijgbare antilichamen zoals getoond door Fisher en collega's [33]. Dit verschil in specificiteit zou kunnen dienen voor verschillende kleurpatronen. Zo werd een nucleaire CXCR4 expressie die werd gerapporteerd als zijnde geassocieerd met lymfeknoop metastasen van colorectale kanker, niet gezien in onze reeks [34]. Verder hebben we nooit gedetecteerd CXCR4 positiviteit in stromale cellen zoals beschreven in een studie van Saigusa en collega's [35]. Ter verduidelijking, als de CXCR4-CXCL12 route uiteindelijk bijdraagt ​​tot generatie metastasen in maagcarcinoom, vooral metastasen zijn verdere studies nodig.

Ongeveer een derde van de onderzochte maagcarcinomen toonde CXCR4 positieve tumor- omgeving microvaatjes . Tumorcellen hebben voldoende toevoer van zuurstof en voedingsstoffen naar overleving handhaven. Zelfs met genetische afwijkingen die de groei en overleving van individuele cellen dysregulate, kunnen tumoren vergroten dan 1-2 mm ^{3 zonder vascularisatie en hypoxia-geïnduceerde celdood optreedt. Het is aangetoond dat CXCR4 door endotheelcellen en stimulering van CXCR4 wordt uitgedrukt door CXCL12 een pro-angiogene effect [36]. Verder CXCR4 is een hypoxie induceerbare gen, gereguleerd door de hypoxia-geïnduceerde factor 1α (HIF1α). Wanneer zuurstof schaars als in snel groeiende tumoren, HIF1α verhoogt de expressie CXCR4 [37]. De verhoogde expressie van CXCR4 in endotheelcellen waargenomen in onze collectieve tumor kan deel uitmaken van een geïntegreerd hypoxische respons van de groeiende tumor die zorgt voor de vorming van nieuwe bloedvaten. In onze studiegroep, vasculaire CXCR4 expressie significant gecorreleerd met de omvang van de lokale tumorgroei. In 8% van T1 /pT2a tumoren (4 of 52) en in 34% van T2b /T3 /pT4 tumoren (81 van 239) waren positief microvaatjes CXCR4 gedetecteerd. T2b /T3 /T4-stadium maagcarcinomen meer kans haven een zuurstofarme micro dan T1 /T2a-stadium tumoren en daardoor misschien CXCR4 genexpressie en angiogenese induceren. Detectie van CXCR4 positieve bloedvaten in grote lymfkliermetastasen (> 9 mm in diameter) bevestigd deze waarnemingen. Verder hebben we eerder aangetoond vergelijkbare resultaten in colorectaal carcinoom [38]. Bovendien, zoals getoond in glioblastoma multiforme [39], tumormonsters openbaren beide CXCL12 positieve tumorcellen en CXCR4 positieve microvaten werden zeer significant geassocieerd met hoge lokale tumor omvang en hoge UICC fasen verdere ondersteuning van de betekenis van een functionele CXCL12-CXCR4 as maagkanker biologie}

Samengevat, laten we zien dat GPCRs differentiële expressie in maagkanker weefsel en kan bijdragen aan de tumor biologie. tumoren die zowel, CXCL12 in tumorcellen en CXCR4 in tumor omringen microvaatjes, vertonen een zeer significante associatie met lokale tumorgroei en UICC fasen. Deze resultaten, samen met onze eerdere gegevens op colorectaal carcinoom, staven de rol van CXCL12-CXCR4 as tumor-neoangiogenese in gastro-intestinale kankers. De CXCL12-CXCR4 pathway kan roman antiangiogene veelbelovend doelwit voor de behandeling van maag-carcinomen.

Materialen en Werkwijzen

Tumormonsters

weefselmonsters van maagkanker chirurgisch verkregen op het Charité Universitair Ziekenhuis Berlijn (1995-2008). Vers ingevroren weefsel van 6 gevallen van intestinale soort maagcarcinoom werd gebruikt voor GeneChip analyse (nodale negatief: 3 patiënten; nodale positief: 3 patiënten; female-male-ratio: 1:02). Een onafhankelijke reeks gepaarde kankercellen en tumor-aangrenzende normale weefsels van 37 intestinale soort maag carcinomen werden onderzocht door real-time RT-PCR (nodale negatief: 12 patiënten; nodale positief: 25 patiënten; female-male-ratio: ~1:1 voor gedetailleerde patiëntkenmerken zie tabel S3). Voor immunohistochemische analyses patiënt cohort van 347 opeenvolgende patiënten met maagkanker werd onderzocht, omvattende 194 intestinale type en 122 diffuse carcinomen soort volgens de Laurén classificatie. 31 monsters toonden andere histologische subtypes (dat wil zeggen mucinous, buisvormige, ongedifferentieerde). Kort samengevat, de cohort van 220 mannen en 127 vrouwen. De gemiddelde leeftijd van de patiënten op het moment van diagnose 64 jaar. Overlevingsdata verkrijgen waren 196 van deze patiënten. Follow-up van gegevens voor de andere patiënten ontbrak, omdat deze patiënten waren niet woonachtig in de buurt van het ziekenhuis en gingen verloren voor de follow-up. Van de 196 patiënten, 124 overleden tijdens de follow-up. De mediane follow-up voor patiënten die nog in leven op het eindpunt van de analyse was 33 maanden. Van 61 patiënten, weefsel van matching lymfekliermetastasen beschikbaar was (27 intestinale type 26 diffuse type 8 andere histologische subtypes). Alleen patiënten met een histologisch bevestigde maagkanker en voldoende weefsel beschikbaar waren inbegrepen. Patiënten met neoadjuvantly behandeld maagcarcinoom of andere bekende maligniteiten werden uitgesloten van de studie. Dit project werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie (ref. Nummer EA1 /06/2004).

GeneChip analyse

Totaal RNA werd geïsoleerd met fenol-chloroform met behulp van de Mirvana ™ miRNA Isolatie Kit ( Ambion, Austin, USA). gedurende 30 minuten bij 37 ° C; verontreinigend DNA werd verwijderd door DNase behandeling (Ambion, Austin, USA Turbo DNAfree kit). We gebruikten de GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) volgens het protocol van de fabrikant om mRNA expressie analyse. Affymetrix GeneChip® Operating Software (GCOS 1.4) automatiseert de controle van GeneChip® Fluidics Stations en GeneChip® Scanner 3000.

Bioinformatics

Ruwe data werden geanalyseerd met de Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS 1.4) . De detectie p-waarde van een transcript is bepalend voor de detectie oproep, die aangeeft of het transcript betrouwbaar wordt gedetecteerd (p < 0,05, aanwezig) of niet gedetecteerd (afwezig). Om de vergelijking tussen chips de gegevens werden aangepast aan een wereldwijde intensiteit van 500. De Data Mining Tool 3.0 (Affymetrix) en GeneSpring softwarepakket 7,2 (Silicon Genetica, Redwood City, CA) in staat werden gebruikt om de gemiddelde resultaten van verschillende monsters en het uitvoeren van statistische analyse te vergelijken tussen maagkanker met (N1) en zonder (N0) lymfekliermetastasen. De gegevens van zes arrays werden genormaliseerd om rekening te houden variatie in hybridisatie probe paren en andere hybridisatie artefacten. De normalisatie bestaat uit de volgende drie stappen: eerst, data transformatie (set metingen minder dan 300,0-300,0); tweede, per chip (normaliseren elke chip op de 50e percentiel van de genomen van die chip meetwaarden); en ten derde per gen (normaliseren elk gen met de mediaan van de metingen voor dat gen). Het voudige verandering werd berekend voor elk gen als het rekenkundig gemiddelde van de genormaliseerde expressiewaarden van N1, gedeeld door het rekenkundig gemiddelde van de genormaliseerde expressiewaarden van N0. Ruwe data van microarray experimenten werden geüpload naar de Gene Expression Omnibus Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=pzmjlcoscakugfc&acc=GSE17187).

Real-time reverse transcriptase polymerasekettingreactie

Voor cDNA synthese 2 ug totaal RNA werd reverse getranscribeerd met behulp van de Omniscript RT Kit (Qiagen). De genspecifieke primers werden ontworpen door de BioTeZ Berlin-Buch GmbH (Berlijn, Duitsland). Primer sequenties waren als volgt: CXCR4 5 'CAG GCA CAG GTA AAG TGA CG, 3' CAG GGT TCC TTC ATG GAG TC; CXCL12 5 'CGA TTC TTC GAA AGC CAT GT, 3'CAC TTG TCT GTT GTT GTT CTT CAG; beta2-microglobuline 5 'ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA, 3' ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG. Real-time reverse transcriptase-polymerase kettingreactie (real-time RT-PCR) gebruikte de QuantiTect ™ SYBR® Green PCR Kit (Qiagen) en het LightCycler System (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland) uitgevoerd. De vergelijkende C _{t-waarden werden genormaliseerd tot die van het huishoud-gen beta2-microglobuline. Geen template controles (geen cDNA in PCR) werden uitgevoerd voor elk gen om niet-specifieke of genomische amplificatie en primer dimerisatie te sporen.}

Histologie

Voor histologische analyses, weefselmonsters werden gefixeerd in 10% geneutraliseerd formaline en ingebed in paraffine. Ontdaan van paraffine secties werden gekleurd met hematoxyline en eosine. Maagcarcinoom werd ingedeeld volgens de WHO-classificatie [1]. De pTNM fase werd bepaald volgens de UICC richtlijnen.

Tissue microarray constructie

formaline gefixeerde weefselmonsters en in paraffine ingebedde weefsels werden gebruikt om microarrays te genereren zoals eerder beschreven [40], [41 ]. In het kort, 3-6 morfologisch representatieve regio's van de blokken van de paraffine 'donor' gekozen.

• PLoS ONE: Gene Expression-Signatures kan onderscheiden maagkanker kwaliteiten en Stages
• PLoS Genetics: MiR-218 Remt Invasie en uitzaaiing van maagkanker door Gericht op de Robo1 Receptor