GP73 is down-gereguleerd bij maagkanker en geassocieerd met tumor differentiatie

GP73 is down-gereguleerd bij maagkanker en geassocieerd met tumor differentiatie
Abstracte achtergrond
Golgi eiwit 73 (GP73) is een type II Golgi transmembraaneiwit. Het tot overexpressie gebracht in verschillende kankers, waaronder hepatocellulaire carcinomen, bile duct carcinomen, longkanker en prostaatkanker. Er zijn echter enkele gevallen van GP73 bij maagkanker. Dit onderzoek zich ten doel de expressie van GP73 en de relatie met klinische pathologische tekens bij maagkanker.
Methods
GP73 mRNA werd bepaald door kwantitatieve real-time RT-PCR in 41 paren van overeenkomstige maag tumorachtige weefsels en naburige niet-tumor slijmvliezen. Western blotting werd uitgevoerd om het GP73 eiwitniveau gedetecteerd. GP73 eiwit expressie werd geanalyseerd door immunohistochemie in 52 klinisch gekenmerkt maagkanker patiënten en 10 niet-tumor maagslijmvlies controles weefsel.
Resultaten
De mRNA en eiwit niveau van GP73 waren significant down-gereguleerd in de maag tumor weefsel in vergelijking met het non-tumor slijmvliezen. In niet-tumor mucosa, kan sterk diffuse cytoplasmatische kleuring zichtbaar in cellen die zich aan het oppervlak van glandulaire en foveolar compartiment; terwijl in tumor weefsels, de kleuring was veel zwakker of afwezig is, en vooral in een semi-granulaire dot-achtige kleuringspatroon. Het expressieniveau van GP73 eiwit geassocieerd met geslacht patiënten en tumordifferentiatie.
Conclusies
GP73 is gewoonlijk uitgedrukt in niet-tumorachtige maagslijmvlies en down-gereguleerd bij maagkanker. Haar expressie bij maagkanker werd gecorreleerd met tumor differentiatie.
Sleutelwoorden
GP73 Maagkanker Tumor differentiatie Achtergrond
GP73, ook wel bekend als GOLM1 en GOLPH2, is een type II Golgi transmembraaneiwit. Structureel GP73 bevat een korte N-terminale cytoplasmatisch domein, een transmembraan domein en een groter luminaal C-terminale domein dat bestaat uit een coiled-coil domein en een zuur staart. Het luminale C-terminale domein is de hoofdfunctie domein van GP73 [1-3]. Muizen met ernstige afknotting van het GP73 C-terminus vertoonden verminderde overleving en ernstige epitheliale afwijkingen van de nieren en de lever [4]. De opgerolde-coil domein kon communiceren met zowel de voorloper en volwassen sCLU, wat aangeeft dat GP73 kunnen helpen bij de post-translationele modificatie, transport en uitscheiding van sCLU [5]. Een proproteinconvertase herkenningsplaats R 52VRR 55 is gelegen binnen de C-terminal ectodomein; PC-gemedieerde klieving van GP73 transformeert de intracellulaire, Golgi-gelokaliseerde GP73 een oplosbaar secretorisch eiwit [6]. De functie van GP73 is nog onduidelijk.
GP73 werd eerst geïdentificeerd van een cDNA-bibliotheek verkregen uit de lever van een patiënt met volwassenen giant cell hepatitis. Het wordt beschouwd als een epitheelcel-specifiek eiwit, die zeer in het colon, maag, prostaat en luchtpijp wordt uitgedrukt in normale, gezonde personen [1]. Leverziekte, zoals virusinfectie en cirrose, kon reguleren de expressie van GP73 in hepatocyten [1, 7, 8]. Recente studies toonden aan dat GP73 werd tot overexpressie gebracht in verschillende kankers zoals hepatocellulair carcinoma [9-11], bile duct carcinoma's [11], longadenocarcinomen [12], prostate kanker [13, 14] en seminomen [15]. De expressie van GP73 in nierkanker is veel uitgebreider. Het werd gerapporteerd als neerwaarts gereguleerd in de meeste clear cell renal cell kanker (RCC), maar hoogst gebracht in papillaire renale carcinoma en chromofobe [16]. Serum GP73 is ook gevonden verhoogd in hepatocellulaire carcinomen, carcinomen galgang en longadenocarcinomen. Het toonde zelfs een voordeel ten opzichte van α-foetoproteïne (AFP) voor het diagnosticeren van vroege hepatocellulaire carcinomen [17, 18]. Ook mRNA expressie van GP73 urine overtrof serum PSA bij het detecteren van prostaatkanker [13].
Maagkanker is een van de meest voorkomende vormen van kanker en de tweede voornaamste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd. Het heeft een bijzonder hoge frequenties in China [19]. Tot nu toe, de etiologische factoren en pathogenese van maagkanker niet volledig begrepen. In deze studie willen we de expressie van GP73 en de relatie met klinische pathologische tekens bij maagkanker door het meten van de mRNA en eiwit expressie niveau van de GP73 in de maag tumor en de aangrenzende niet-tumor mucosale weefsels te onderzoeken.
Methods
materialen en patiënten
Eenenveertig paren van overeenkomstige maag tumor en aangrenzende niet- tumoreuze slijmvliezen (> 5 cm van de rand van de tumor) werden verkregen van patiënten met primaire maagkanker bij de Zhejiang Provincial People's Hospital, China januari 2011 tot december 2012. De eigenschappen van 41 GCsare getoond in Tabel 1. Na chirurgische verwijdering, weefsels werden onmiddellijk in vloeibare stikstof ingevroren en bewaard bij -80 ° C tot use.Table 1 Samenvatting van clinicopathologic kenmerken van maagkankerpatienten
Clinical parameters
N (%)
Gender
Mannen in 27 (65,9)
Vrouwen
14 (34,1)
Maat
23 (56.1 ) Restaurant < 20
18 (43,9)
≧ 20
histologische differentiatie
Well
3 (7.3)
Matig
17 (41,5)
Slecht
21 (51,2)
Lymfatische metastase verhuur No
11 (26,8)
Ja
30 (73,2)
Distant metastase verhuur No
34 (82,9)
Ja
7 (17,1)
TNM stadium
I
8 (19,5)
II
17 (41,5)
III
10 (24,4)
IV
6 (14,6)
Tweeënvijftig paraffine exemplaren van maagkanker (GC) weefsel (43 mannen, 9 vrouwen) werden overgenomen van Zhejiang Provincial People's Hospital, verzameld van 2010 tot 2011. Alle gevallen van de maag kanker werden geclassificeerd volgens de WHO classificatie en georganiseerd door middel van het pTNM systeem [20]. De gevallen bestond uit 22 patientsaged < 60 jaar, 30 patiënten in de leeftijd ≥60years; 20 patiënten met de tumorgrootte < 5 cm, 32 patiënten met de tumorgrootte ≥5cm; 22 patiënten met matig gedifferentieerde kanker, 30 patiënten met een slecht gedifferentieerde kanker; 14 patiënten met een T1 of T2 muur invasie, 38 patiënten met T3 of T4 wand invasie; 39 patiënten met een lymfeklier metastase en 13 patiënten zonder lymfklier metastase; 10 patiënten met metastasen en 42 patiënten zonder metastasen. Het aantal patiënten ondergebracht TNM waren als volgt: 18 waren TNM stadium I of II; 34 bij TNM stadium III of IV. De patiënten waren tussen 32 en 84 jaar, en er was geen radiotherapie of chemotherapie voor de operatie. Monsters werden vastgesteld door formaline en ingebed in paraffine. Tennormal weefselmonsters van de maag van patiënten zonder maligne tumoren werden verkregen door endoscopie als controlegroep.
Alle patiënten ontvangen geïnformeerde toestemming voor het gebruik van hun weefsels voor de operatie. Het gebruik van alle monsters werd goedgekeurd door de ethische commissie van de provincie Zhejiang People's Hospital.
Kwantitatieve real-time PCR
qRT-PCR werd uitgevoerd om het mRNA niveau van de GP73 te bepalen. In het kort werd totaal RNA geëxtraheerd uit 40 paren van overeenkomstige maag tumor en aangrenzend niet-tumorachtig mucosale weefselmonsters, via Trizol (Invitrogen, Camarillo, USA) volgens de instructies van de fabrikant. cDNA-synthese werd uitgevoerd met de PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, DaLian, China) onderzocht volgens 1 pg totaal RNA als de template en oligodT primer onder 65 ° C, 5 minuten, 42 ° C, 60 minuten en 70 ° C, 10 minuten van de reverse transcriptie. De resulterende cDNA werd versterkt door qPCR behulp van specifieke primers met SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, China). GAPDH werd gebruikt als een interne controle. Primers GP73 waren 5'-GCAAAGCAACATCTTCCCTA-3 '(sense) en 5'-CCACAACAAACTTGCCCTC-3' (antisense). Primers GAPDH waren 5'- TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 '(sense) en 5'CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3' (antisense). PCR-parameters waren als volgt: 95 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 10 s, 60 ° C gedurende 20 s en 72 ° C gedurende 20s. Aan het einde van de PCR cycli werd smeltcurve analyse uitgevoerd. De relatieve expressie van GP73 tot GAPDH werd berekend met behulp van 2 -ΔCT methode.
Western blotting
Western blotting werd uitgevoerd om GP73 eiwit niveau te onderzoeken in 5 van de 41 paren van de maag tumorweefsel en de aangrenzende niet-tumor slijmvlies. Eiwit werd geïsoleerd uit weefsel monsters na de RNA-extractie. En ongeveer 30 ug eiwit werd gescheiden op 10% polyacrylamide gel voor twee uur. Na overschrijving naar een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut, USA), werden de monsters getest met primaire antilichamen tegen GP73 (1: 2000, Sigma, St. Louis, MO, USA) en β-actine ( 1: 5000, Sigma, USA) bij 4 ° Covernight. Na incubatie met secundair antilichaam (1: 5000, CapitalBio, Peking, China) voor 2 uur, werden de membranen behandeld met elektrochemiluminescentie (ECL) reagens (Generay, Shanghai, China) en blootgesteld aan autoradiographicfilms
Immunohistochemische kleuring Immunohistochemische
. kleuring werd uitgevoerd door de standaardmethode. Kort, 52 gevallen van in paraffine ingebedde weefsels en maagtumoren 10 gevallen van naburige niet-tumorachtig slijmvlies controles werden gesneden in 5 urn dik en op microscoopglaasjes aangebracht en gedroogd in een 60 ° C oven gedurende 2 uur. Daarna werden de secties de-paraffinized in xyleen, gerehydrateerd met een gradiënt van ethanol concentraties correct in 10 mM citraatbuffer gedurende 15 minuten antigen halen, geblokkeerd met 3% waterstofperoxide gedurende 10 minuten om endogene peroxidase activiteit te remmen en geïncubeerd met 10 % geit non-immune serum gedurende 20 minuten achtergrond niet-specifieke kleuring te verminderen. Daarna werden de secties geïncubeerd met het konijnen anti-GP73 polyklonaal antilichaam (Abcam, Cambridge, UK) (1: 100 verdunning) bij 4 ° C gedurende de nacht, vervolgens geïncubeerd met biotine gemerkt tweede antilichaam (Invitrogen, USA) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, gevolgd door incubatie met HRP-geconjugeerd streptavidine (Invitrogen, USA) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Vervolgens werd kleurontwikkeling uitgevoerd met een DAB Substrate Kit (Dako, Carlsbad, USA). Tenslotte werden de secties tegengekleurd met hematoxyline, gedehydrateerd, geklaard en gemonteerd.
Evaluatie van de immunohistochemicalstainings Ondernemingen De immunohistochemicalstainings van GP73 werden gescoord door twee pathologen onafhankelijk basis van de intensiteit en het aantal positief gekleurde cellen. Kleurintensiteit werd geëvalueerd met een vier-tiered beoordelingssysteem: 0 = negatief, 1 = zwak, 2 = matig en 3 = sterk. Het percentage positieve cellen werd als volgt gewaardeerd: 0 voor geen mobiele gekleurd, 1 voor 1% tot 25% van de cellen gekleurd, 2 voor 26 tot 50% van de cellen gekleurd, 3 voor 51-75% van de cellen gekleurd en 4 meer dan 75% van cellen gekleurd. Scores van intensiteit en het percentage positieve cellen werden vermenigvuldigd. Scores ≤3 werd gebruikt om tumoren met lage GP73 expressie en scoort ≥4 met een hoge GP73 expressie te definiëren.
Statistische analyse
Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van SPSS-software 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). De gepaarde T-toets werd gebruikt om de verschillen in GP73 mRNA expressie tussen tumor- en non-tumor weefsels geanalyseerd. Chi-kwadraat test werd toegepast om de statistische significantie van de associaties tussen GP73 expressie en clinicopathologische parameters te beoordelen. P Restaurant < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant
Resultaten
GP73 expressie in de maag tumor en niet-tumorweefsel
GP73 mRNA expressie significant in de maag tumor weefsel was gedaald ten opzichte van het aangrenzende niet-tumor. weefsels (33/41, 80,5%). De expressieniveaus van GP73 opzichte van GAPDH waren veel lager in de maag tumorachtige weefsels (0,259 ± 0,308) dan in niet-tumor slijmvliezen (0,584 ± 0,523; P
< 0,01; figuur 1). Consistent met RT-qPCR, GP73 eiwitgehalte in de maag tumormonsters was significant lager dan die van niet-tumor samples, die werd getest door Western blotting (Figuur 2). Figuur 1 GP73 mRNA expressie in de maag tumorachtige weefsels en naburige niet-tumor slijmvliezen.
Figuur 2 GP73 eiwitgehalte in de maag tumor samples en naburige niet-tumor mucosale monsters. A) GP73 eiwitgehalte in de maag tumor samples en naburige niet-tumor mucosale monsters. B) GP73 mRNA-niveau in dezelfde maag tumor samples en naburige niet-tumor mucosale monsters. C) maagkanker; N:. Normale)
Correlatie tussen GP73 eiwit expressie en clinicopathologic parameters
IHC bleek dat GP73 zeer werd uitgedrukt in naburige niet-tumor mucosale weefsel, maar verminderd of zelfs afwezig is in de maag tumor weefsels. In niet-tumor mucosa, zou sterk diffuse cytoplasmatische kleuring zichtbaar in cellen die zich aan het oppervlak van glandulaire en foveolar compartiment (Figuur 3A). In tumorweefsels werd GP73 expressie voornamelijk in een afzonderlijke semi-granulaire dot-achtige kleuringspatroon (Figuur 3B, C). Slechts een paar maag tumor weefsels werden gevonden met sterke expressie van GP73 (Figuur 3D). Figuur 3 GP73 eiwitexpressie gastrische tumorachtige weefsels en naburige niet-tumor slijmvliezen. A) Sterke expressie van GP73 in niet-tumor weefsel. B) Zwakke expressie van GP73 in de maag tumor weefsels. C) Matige expressie van GP73 in de maag tumor weefsels. D) Sterke expressie van GP73 in de maag tumor weefsels. a, b, c, d: 100 x oorspronkelijke vergroting. A, B, C, D:. Vergroting 200 x Ondernemingen De correlatie tussen expressie van GP73 eiwit en klinische variabelen in Tabel 2. De GP73 expressieniveau werd significant gerelateerd aan het geslacht van de patiënten (P =
0,027) en differentiatie (P
= 0,049). De expressie van GP73 in slecht gedifferentieerde maagtumoren was veel lager dan in matig gedifferentieerde maagtumoren. Een totaal van 21 van de 30 slecht gedifferentieerde maagtumor gevallen toonde laag GP73 expressie, terwijl in matig gedifferentieerde maagtumor gevallen slechts 9/22 was. Ook de expressie van GP73 bij mannelijke patiënten werd down-gereguleerd vaker dan bij vrouwelijke patiënten. Er was geen significante correlatie tussen GP73 expressie en andere clinicopathologic parameters.Table 2 Verhouding van GP73 expressie met pathologische parameters van de tumor
klinische parameters
GOLPH2
P-waarde


Lage
hoge
Totaal aantal
30
22
Gender
0,027
Man
28
15
Female 2
7
Leeftijd (jaar)
0,456 Restaurant < 60
12
10

• Marginale troebele band en lichtblauw kam, tekenen waargenomen in vergrootglas narrow-band imaging endoscopie, zijn een indicatie van de maag darmen metaplasia
• Meerdere primaire kwaadaardige tumoren met aantasting primaire sporadische colorectale kanker in Japan: de incidentie van maagkanker met colorectale kanker patiënten kunnen hoger dan eerder recognize…