PLoS ONE: Heat Shock Protein 60 Overuttrykte er assosiert med progresjon og prognose i Gastric Cancer

Abstract

Bakgrunn

Heat shock protein 60 (hsp60) er en chaperonin med essensielle funksjoner for cellefysiologi og overlevelse, og dens uttrykk korrelerer med prognose på en rekke kreftformer. Målet med denne studien er å bestemme forholdet mellom hsp60 status med clinicopathological parametre og prognose i magekreft.

Metoder

Nivåene av hsp60 og matrise metallopeptidase 9 (MMP-9) antigen var evaluert av immunhistokjemi i 223 magekarsinom prøver. Sammenhengen mellom hsp60 og MMP-9, clinicopathological parametre, og prognosen for magekreft ble undersøkt.

Resultater

Nivået hsp60 protein var signifikant assosiert med dybde invasjon, lymfeknutemetastase og scene av sykdom (alle P
< 0,05). Både univariate og multivariate analyser viste at hsp60 var en uavhengig prognostisk faktor for både total overlevelse (OS) og tilbakefall overlevelse (RFS) (begge P
< 0,05). Videre ble hsp60 overekspresjon forbundet med dårlig prognose hos pasienter med avansert magekreft i ulike risikogrupper. Videre hsp60 var signifikant korrelert med MMP-9 blant 223 mage kreft vev ( P
< 0,001). Pasienter som hadde hsp60 overekspresjon, der tumorcellene viste høy invasivitet, hadde dårlig OS og kortere RFS.

Konklusjon

hsp60 spiller en viktig rolle på tumor aggressivitet og prognose, og kan fungere som en lovende mål for prognostisk prediksjon

Citation. Li Xs, Xu Q, Fu Xy, Luo Ws (2014) Heat Shock Protein 60 Overuttrykte er assosiert med progresjon og prognose i magekreft. PLoS ONE ni (9): e107507. doi: 10,1371 /journal.pone.0107507

Redaktør: Francesco Cappello, Universitetet i Palermo, Italia

mottatt: 28 juni 2014; Godkjent: 12 august 2014; Publisert: 10.09.2014

Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er inkludert i papir

Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall verden over på grunn av sin frekvens, dårlig prognose og begrensede behandlingsmuligheter [1]. Fullstendig reseksjon av tumoren og tilstøtende lymfeknuter er den bare effektiv kurativ behandling [2]. Dessverre, etter en komplett reseksjon, fortsatt lav 5-års overlevelse [3]. Flere studier har vist at forskjellige genetiske og epigenetiske endringer er involvert i løpet av karsinogenese og progresjon av magekreft [4] - [6]. Men den molekylære mekanismen involvert i utviklingen av magekreft er fortsatt uklart.

Heat shock proteiner (HSP) er et sett av evolusjonært konserverte proteiner. HSP er blitt klassifisert i en rekke underfamilier basert på deres molekylvekt [7] eller systematiske gen symboler [8]. Sagt på pattedyr, er fire store familier av HSP kjennes: HSP90 (HSP90α, HSP90β, GRP94), HSP70 (HSP70, HSC70, mHSP70, GRP78), hsp60 og små HSP (HSP27, aB-krystallin, HSP22). Opphopning av misfolded protein i stressede celler, utløser uttrykk for HSP, som hindrer protein aggregering og letter refolding eller eliminering av misfoldede proteiner i sine kapasiteter som anstand [9]. Nylig er det blitt rapportert at HSP er signifikant assosiert med kreft [10].

hsp60 (også kalt Cpn60) er hovedsakelig inneholdt i den mitokondrielle matriks, selv om det har også blitt oppdaget at ekstra-mitokondrie sider [11 ]. Hsp60 bistår folding av mitokondrielle proteiner og muliggjør proteolytisk nedbrytning av misfolded eller denaturerte proteiner i en ATP-avhengig måte [12]. Nylig er dens rolle og applikasjoner i menneskelig utvikling og forvaltning kreft for tiden aktivt undersøkt og resultatene er svært oppmuntrende [13]. Hsp60 synes å ha potensiale innen diagnose, prognose, og forhindring og behandling av forskjellige humane kreftformer, inkludert øsofageal karsinomer [14], bronkial karsinogenese [15], kolorektal kreft [16] og glioblastom [17]. Men rollen hsp60 på prognosen for pasienter med magekreft er fortsatt uklart.

I denne studien, vurderte vi nivået hsp60 i mage kreft vev ved immunhistokjemi. Korrelasjoner av hsp60 status med clinicopathological parametere og overlevelse av magekreftpasienter ble deretter analysert. I tillegg har det blitt rapportert at MMP-9 spiller en viktig rolle i magekreft tilbakefall og prognose [18]. Derfor har vi også undersøkt forholdet mellom hsp60 og MMP-9 protein i magekreft.

Pasienter og metoder

Pasienter og Prøvene

Studiet ble godkjent av Institutional Review Board and human Etisk komité Affiliated Hospital of Guilin Medical University. Skriftlig samtykke for bruk av prøver for forskningsformål ble innhentet fra alle pasienter før operasjonen.

magekarsinom vev ble hentet fra gastrektomi eksemplarer av 223 pasienter fra avdelingen for generell kirurgi, den Affiliated Hospital of Guilin Medical University ( Guilin, Kina). Alle operasjoner ble utført mellom januar 2005 og desember 2008. Kriteriene for denne studien var som følger: (1) en patologisk undersøkelse bekrefter tilstedeværelsen av magekreft og erfarne radikal kirurgi, (2) komplette grunnleggende kliniske data, (3 ) fravær av en hvilken som helst forutgående behandling for kreft, og (4) ingen alvorlige komplikasjoner eller annen malign sykdom. Det var 144 menn og 79 kvinner (median alder, 58.0 år, range, 22-82 år). Relevante kliniske patologiske funksjoner (Tabell 1) ble alle hentet fra pasientenes filer. Tumorstadium ble klassifisert i henhold til syvende Union International Cancer Control (UICC) TNM staging system [19].

Immunohistochemistry farging

Det er totalt 223 magekarsinom prøvene ble brukt i immunhistokjemi (IHC ) analyse. I henhold til protokollen [20] for IHC på parafininnstøpte vevssnitt ble det parafininnstøpte blokker snittet på omtrent 4 um tykkelse. Objektglass ble oppvarmet ved 60 ° C i 2 timer, deparaffinized med xylen og rehydrert ved bruk av en alkohol-gradient (100% alkohol, 95% alkohol, 80% alkohol, og 70% alkohol). Vevet Glassene ble deretter behandlet med 3% hydrogenperoksid i metanol i 30 min for å slukke endogen peroksidase-aktivitet, og antigenene ble hentet i 0,01 M natrium-citrat-buffer (pH 6,0) ved bruk av en mikrobølgeovn. Etter 30 minutter pre-inkubasjon i 10% normalt geiteserum for å forhindre ikke-spesifikk farging, ble prøvene inkubert over natten ved å bruke et primært antistoff, enten anti-hsp60 (Abcam, # ab31115, Storbritannia, fortynning 1:200) eller anti-MMP-9 ( Abcam, # ab38898, Storbritannia, fortynning 1:200), i en fuktig beholder ved 4 ° C. Vevet lysbilder ble behandlet med en ikke-biotin pepperrot-peroksidase deteksjonssystem i henhold til produsentens instruksjoner (Gene Tech). IHC Resultatene ble evaluert av to uavhengige etterforskere blindet til pasientenes identitet og klinisk status. I avvikende tilfeller, en patolog anmeldt sakene, og en enighet ble nådd

hsp60 og MMP-9 flekker intensiteter ble vurdert på en skala fra 0-3 etter hvor stor prosentandel av positive tumor (0, <.; 5% positive celler, 1, 5-10%, 2, 11-50%, eller 3, > 50%). Nivået er meget lav for 0, lav for en, moderat for to og høy for 3 (fig. 1). Nivåene av hsp60 og MMP-9 ble klassifisert som negative for score ≤1 og positivt for score ≥2.

Oppfølgings

Oppfølgingen varighet ble definert som intervallet mellom dato for operasjon og dødsdato eller siste oppfølging. Studien ble sensurert 30. september 2013. Median oppfølgingstid var 27,0 måneder (range, 4-82 måneder) i 223 pasienter. Alle pasientene ble fulgt opp hver 1-3 måneder i det første året og hver 3-6 måneder etterpå. Tilbakefall ble bekreftet av tumor markører nivåer, inkludert CEA, AFP, CA199, CA125 og CA724, B-type ultralydundersøkelse hvert 3. møll, og computertomografi (CT) eller magnetisk resonans imaging (MRI) hver 6 måneder etter gastrektomi. De viktigste dødsårsakene var magekreft tilbakefall. Total overlevelse (OS) ble beregnet fra datoen for operasjonen til dødsdato eller siste oppfølging. Tilbakefall overlevelse (RFS) ble definert som fra dato for operasjonen frem til dato for tilbakefall eller fra perioden reseksjon til datoen for den siste observasjonen tatt.

Statistisk analyse

All statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS (versjon 16.0, Chicago, IL, USA). Gjensidig avhengighet mellom hsp60 og kliniske data ble beregnet ved hjelp av chi-kvadrat test, og vises i krysstabeller. Korrelasjon av hsp60 med MMP-9 ble beregnet ved Pearson χ2 test. Overlevelseskurver ble plottet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og analysert ved hjelp av log-rank test. Alle rapporterte P
verdiene var tosidig og P
. ≪ 0,05 ble ansett som statistisk signifikant

Resultater

Foreningen av hsp60 med clinicopathological variabler

for å belyse den biologiske betydningen av hsp60 i magekreft, undersøkte vi immunhistokjemiske nivået av hsp60 i mage kreft vev (fig. 1). Hsp60 farging hovedsakelig lokalisert i cytoplasma av tumorceller. Den positive frekvensen av hsp60 var 58,3% (130/223) i magekreftprøver.

Ifølge resultatene av immunhistokjemi, vi korrelert hsp60 status på 223 magekreft prøver med åtte andre anerkjente clinicopathologic parametere (Tabell 1 ). Våre analyser viste at nivået av hsp60 i magekreft ble signifikant korrelert med dybden av invasjon ( P
= 0,043), lymfeknutemetastase ( P
= 0,018) og stadium av sykdommen ( P
= 0,048), men var ikke assosiert med kjønn, alder, tumorstørrelse, tumor nettstedet og grad av differensiering ( P
> 0,05) (tabell 1). Spesielt korrelasjonen av hsp60 status med fremtredende serøse invasjon og lymfeknutemetastase positivitet foreslo en potensiell rolle hsp60 i økt invasjon og metastasering av magekreft.

Effekt av svulst hsp60 protein nivå på prognose

for ytterligere å fastslå effekten av hsp60 på OS og RFS, vi først utført univariat analyse av tradisjonelle clinicopathologic variabler for prognose. Resultatene av univariate analysen er vist i tabell 2. Overuttrykte hsp60 ( P
= 0,001), større tumorstørrelse ( P
< 0,001), tumor hotellet ( P
= 0,014), fremtredende serøse invasjon ( P
< 0,001) og lymfeknutemetastase ( P
< 0,001) var signifikant assosiert med dårlig OS frekvensen av mage kreftpasienter . I tillegg Kaplan-Meier analyse viste at hsp60 overekspresjon ( P
= 0,002), større tumorstørrelse ( P
< 0,001), tumor hotellet ( P
= 0,008), fremtredende serøse invasjon ( P
< 0,001) og lymfeknutemetastase ( P
< 0,001) var negative prognostiske faktorer for RFS i mage kreftpasienter (tabell 2). Videre, for å evaluere den uavhengige virkning av hsp60 overekspresjon på OS og RFS, en multivariat Cox regresjonsmodell justert for tumorstørrelse, tumorlokalisering, dybden av invasjon, lymfeknutemetastase og hsp60 ble utført. Våre resultater viste at hsp60 status var en dårlig uavhengig prognostisk faktor for OS i mage kreftpasienter (hazard ratio, 1,594; 95% CI, 1,114 til 2,280). I tillegg positive hsp60 uttrykk pasientene var nesten 1,5 ganger mer sannsynlig at lider av tilbakefall enn de med negative hsp60 uttrykk (hasardratio, 1.460, 95% KI, 1,024 til 2,081). Tumorstørrelse, dybden av invasjon og lymfeknutemetastase hadde alle uavhengig prognostisk verdi i den multivariate analysen (tabell 3).

overlevelsesanalyse viste at OS og RFS var signifikant forskjellig hos 223 pasienter i henhold til nivået av hsp60 ( P
= 0,001, P
= 0,002) (fig. 2A). Den postoperative median OS og RFS var 26,0 måneder og 20,0 måneder, henholdsvis. Den postoperative median OS ganger i hsp60-positive (n = 130) og hsp60-negative (n = 93) magekreftpasienter gruppen var 17,5 måneder og 36,0 måneder, og median av RFS tider var 14,0 måneder og 33,0 måneder. I tillegg OS og RFS priser på 5 år var 30,2% og 29,3% for hsp60-positive pasienter sammenlignet med 48,9% og 43,5% for hsp60-negative pasienter, henholdsvis ( P
= 0,001 og P
= 0,002;. Tabell 2)

for å ytterligere evaluere den prognostiske verdien av hsp60 i ulike undergrupper, ble pasientene stratifisert i henhold til tumorstørrelse (figur 2B, C), dybde av invasjon (fig.. 2D, E) og lymfeknutemetastaser (fig. 2F, G). Nivået på hsp60 beholdt sin prognostisk verdi i å forutsi kortere OS og RFS i undergruppene for tumorstørrelse. For undergruppene av T3 /T4 og N1-3 pasienter, ble signifikante korrelasjoner funnet mellom hsp60 status og OS ( P
= 0,003 og P
= 0,002, henholdsvis) og RFS ( P
= 0,008 og P
= 0,003, henholdsvis). Hsp60 hadde ingen prognostisk verdi av OS eller RFS for pasienter med T1 /T2 og N0 (alle P
> 0,05). Derfor ser det ut til at hsp60 kan tjene som en kraftig prognostisk faktor for pasienter med avansert magekreft i ulike risikogrupper.

hsp60 overekspresjon spår dårlig prognose uavhengig av tumor invasivitet

For å bedre forstå den kliniske betydningen av hsp60 på aggressivitet i magekreft, undersøkte vi forholdet av hsp60 med dybdeinvasjon og lymfeknutemetastase i magekreft. De positive tallene for hsp60 var 63,7% og 63,3% i mer fremtredende serøse invasjon gruppe (T3 /T4) og hyppigere spredning til lymfeknuter gruppe (N1-3), mens det var bare 50,0% og 46,2% i T1 /T2 og N0 ( P
= 0,043 og P
< 0,018, henholdsvis) (tabell 1). I tillegg ble nivået av hsp60 signifikant korrelert med MMP-9 i 223 gastrisk karsinom prøver. Av 93 pasienter med lavt nivå av hsp60, 65 pasienter (69,9%) hadde lavt nivå av MMP-9, mens 77 av 130 pasienter (59,2%) med høy grad av hsp60 hadde også høyt nivå av MMP-9 ( P
. <. 0,001) (fig 3)

Vi ytterligere utforsket påvirkning av svulst invasivitet på den prognostiske verdien av hsp60 i magekreft ved hjelp av MMP-9 som en indikator for invasiv potensialet av individuelle tumorceller. Alle pasientene ble delt i enten en lav sprednings undergruppe (lav MMP-9; n = 118), eller en høy invasivitet undergruppe (høy MMP-9; n = 105) i henhold til nivået av MMP-9 indeks. Kaplan-Meier overlevelseskurver ble så plottet å undersøke sammenhengen mellom hsp60 status og overlevelse (Fig. 4). I høy tumor invasivitet undergruppe, ble hsp60 overekspresjon forbundet med kortere OS ( P
= 0,013) og RFS ( P
= 0,032) sammenlignet med OS og RFS hos pasienter med lavt nivå av hsp60, mens det var ingen prognostisk verdi av OS eller RFS i lav invasivegruppen.

Diskusjoner

i denne studien, ble nivået av hsp60 undersøkt i 223 magekarsinom vev ved immunhistokjemi. Vi fant at hsp60 status var signifikant assosiert med dybde invasjon og lymfeknutemetastase. I tillegg, Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse viste at overlevelsestider (OS og RFS) av magekreft hos pasienter med hsp60 overekspresjon var betydelig kortere enn de med lavt nivå av hsp60. Videre multivariat Cox modellen analyse indikerte at hsp60 status var en selvstendig faktor for både prognose indekser (OS og RFS) i magekreft. Dette funn tyder på at hsp60 spiller en viktig rolle i tumor prognose, og det kan være en potensiell prognostisk faktor av magekreft. Resultatene var i overensstemmelse med tidligere rapporterte resultater. I flere undersøkelser har det vist seg at det unormale ekspresjon av hsp60 i kreftceller er assosiert med tumorprogresjon. Tanaka et al. [21] rapporterte at positivitet frekvensen av H. pylori hsp60 var signifikant høyere hos pasienter med diffuse-type magekreft enn i H. pylori-positive pasienter uten magekreft, som foreslo at H. pylori hsp60 kan være assosiert med mage karsinogenese, spesielt i tilfelle av diffus kreft. Faried et al. [14] sammenlignet korrelasjonen av hsp60 status med clinicopathological parametre og prognose i spiserørs plateepitelkarsinom og foreslo at hsp60 korrelert med pasientens prognose i menneskelig øsofageal plateepitelkarsinom. I tillegg Cappello et al. [22] evaluert tilstedeværelse og uttrykk for hsp60 og HSP10 i avførings karsinomer med lymfeknutemetastase og funnet ut at hsp60 og HSP10 overekspresjon ble funksjonelt relatert til tumorprogresjon i tarmen karsinom. Imidlertid Cappello et al. [23] sammenlignet hsp60 og HSP10 uttrykk i lungekreft med at av kronisk obstruktiv lungesykdom ved immunhistokjemi og fant de motstridende resultater som tap av hsp60 og HSP10 immunopositivity er knyttet til utvikling og progresjon av bronkial kreft hos røykere med kronisk obstruktiv lungesykdom sykdom.

klinisk stadium er den viktigste faktor som påvirker prognose av magekreftpasienter. Flere systemer er tilgjengelige for å klassifisere magekreft. Blant dem er det Union International Cancer Control (UICC) TNM staging system en av de mest utbredte. Selv om TNM systemet har gradert pasienter på sin prognose ifølge clinicopathological variabler, det har nådd sin grense i å gi viktig informasjon som kan påvirke behandlingsstrategi. Det er vanskelig for gastrointestinale kirurger å forutsi nøyaktig hvilke individer vil oppleve tilbakefall blant avanserte pasienter som har gjennomgått kurativ behandling. For å overvinne begrensningene ved disse tradisjonelle systemene, har mange molekylære markører blitt undersøkt og vist å ha potensial logisk betydning. Men til dags dato, biomarkører som kan stratifisere magekreftpasienter med kurativ eksisjon i TNM stadium III /IV fremdeles er i det vesentlige begrenset. I vår stratifisert analyse fant vi at hsp60 status hadde klart prognostisk verdi for OS og RFS i T3 /T4 og lymfeknutemetastase (N1-3) pasienter. Disse data antyder at hsp60 kan fungere som et forutsigende verktøy for å identifisere pasienter med avansert magekreft har høy risiko for tilbakefall.

Det har vært kjent at nedbrytningen av ekstracellulær matriks (ECM) ble et signal for begynnelsen av invasjon og metastase, og MMP er viktige molekyler involvert i ECM degradering under invasjon og metastasering [24]. Chu et al. [18] rapporterte at kreft MMP-9 ble signifikant korrelert med dybden av invasjon og lymfeknutemetastase og MMP-9-positive magekreftpasienter hadde dårligere resultater enn de med MMP-9-negative tumorer. Zhao et al. [25] fant at MMP-9-mål-RNA interferens var i stand til å undertrykke MMP-9-ekspresjon og hemme cellevekst og invasjon av SGC7901 magekreft in vitro og in vivo. I tillegg, Lin et al. [26] rapporterte at de varmesjokkprotein 60 av H. pylori forbedret migrering av magekreftceller og fremmes rør formasjon, og dessuten kan det akselerere kreftutvikling på den måte å uttrykke de pro-inflammatoriske cytokiner. Det har blitt rapportert at hsp60 er foreslått som mål for tumorterapi [27]. Våre resultater viste at nivået av hsp60 og MMP-9 ble korrelert med hverandre, noe som indikerer høyere invasive og metastasering aktivitet i hsp60-positive cancerceller. I tillegg ble hsp60 sterkt uttrykt i dybden av invasjon, særlig i T3 og T4 karsinomer. Såvidt lymfeknute status var bekymret, pasienter med lymfeknutemetastase tendens til å vise forhøyet hsp60 uttrykk. Videre pasienter som hadde hsp60 overekspresjon, der tumorcellene viste høy invasivitet, hadde dårlig OS og kortere RFS. Kollektivt, hsp60 i magekreft fremme tumor aggressivitet antyder at hsp60 kan være et mulig mål i cancerterapi.

I sammendrag, demonstrerte vi at hsp60 kan spille en viktig rolle i tumorinvasjon, metastase og prognose, og kunne fungere som et lovende mål for prognostisk prediksjon i magekreft. Fastsettelse av hsp60 kan bidra til å identifisere høyrisikomagekreftpasienter og dermed hjelpe til valg av passende behandling. Videre undersøkelser er nødvendig for å avklare hvilken rolle hsp60 i utviklingen av magekreft.

Takk

Vi erkjenner takknemlig kliniske data fra patologi avdeling (Affiliated Hospital of Guilin Medical University).

• PLoS ONE: Foreningen mellom DNA kopiantall Avvik på kromosom 5q22 og Gastric Cancer
• PLoS ONE: Analyse av lymfeknutemetastase Sammenheng med Prognose hos pasienter med T2 Gastric Cancer