Host celle invasjon og muntlig infeksjon med Trypanosoma cruzi stammer av genetiske grupper TCI og TcIV fra chagasic pasienter

Host celle invasjon og muntlig infeksjon med Trypanosoma cruzi
stammer av genetiske grupper TCI og TcIV fra chagasic pasienter
Abstract
Bakgrunn
Utbrudd av akutt Chagas sykdom ved oral smitte er rapportert ofte over de siste ti årene , med høyere forekomst i Nord-og Sør-Amerika, hvor Trypanosoma cruzi
avstamning TCI dominerer, å være ansvarlig for den viktigste årsaken til gjenoppvåknende sykdom hos mennesker, og en liten prosentandel er identifisert som TcIV. Mekanismer av oral smitte og vertscelle invasjon av disse parasittene er dårlig forstått. For å ta det spørsmålet, analyserte vi T. cruzi
stammer isolert fra chagasic pasienter i Venezuela, Guatemala og Brasil.
Metoder
Trypanosoma cruzi
metacyclic trypomastigotes oralt inokulert i mus. Musen mage oppsamlet fire dager senere, så vel som i magesekken og hjertet samlet 30 dager etter infeksjon, ble bearbeidet for histologisk analyse. Analyser for å etterligne parasitt migrasjon gjennom slimet mage lag ble utført ved å telle parasitter som krysset mage mucin-belagt Transwell filtre. For celle invasjon analyser, ble menneskelige epitelceller HeLa celler inkubert med metacyclic former og antall intern parasitter ble regnet.
Resultater
All TCI og TcIV T. cruzi
stammer ble dårlig infeksiøs oralt. Parasitter var enten ikke målbare eller ble oppdaget i små tall i musen magen fire dager etter oral administrasjon. Replikerende parasitter ble funnet i magesekken og /eller i hjertet 30 dager etter infeksjon. I forhold til TCI avstamning, migrering kapasiteten til TcIV parasitter gjennom mage mucin-belagte filter var høyere, men lavere enn det som oppvises av TcVI metacyclic skjemaer som tidligere vist seg å være meget infective ved den orale rute. Ekspresjon av pepsin-resistente gp90, overflatemolekylet som nedregulerer celle invasjon, var høyere i TCI enn i TcIV parasitter og følgelig invasjonen kapasiteten til TcIV metacyclic former var høyere. Gp90 molekyler spontant utgitt av TCI metacyclic former hemmet parasitten inntreden i vertsceller. TCI parasitter utstilt lav intracellulær replikering rate.
Konklusjoner
Våre funn tyder på at dårlig kapasitet på TCI avstamning, og i mindre grad av TcIV parasitter, i invadere gastrisk epitel etter oral smitte av mus kan være forbundet med ineffektiviteten av metacyclic former, særlig av TCI parasitter, til å migrere gjennom den gastriske slimet lag, for å invadere mål epitelceller og for å gjenskape intracellulært.
nøkkelord
Trypanosoma cruzi
TCI og TcIV slektsnavn metacyclic trypomastigotes oral infeksjon vertscelle invasjon Bakgrunn
utfallet av infeksjon med Trypanosoma cruzi
, agent for Chagas sykdom, kan variere sterkt: 20-30% av kronisk infiserte pasienter utvikler alvorlig myokarditt, endringer i fordøyelseskanalen (megaesophagus og /eller megacolon) oppstår sjeldnere, mens de fleste forblir asymptomatiske for livet. Den genetiske bakgrunn og den immunologiske status av verten, så vel som heterogeniteten av parasitten befolkningen kan bidra til dette mangfoldet [1] og eventuelt smitteveien og den smittende dose. Ifølge intraspesifikk nomenklatur etablert i 2009, er T. cruzi
stammer klassifisert i seks diskrete skrive enheter (DOE'er), TCI-TcVI [2]. I land Nord i Sør-Amerika og i Amazonas-regionen, hvor megaesophagus og megakolon er sjeldne og chagasic kardiomyopati er vanlig, er TCI den dominerende agent av Chagas sykdom, i motsetning til TCII, som har vært isolert fra de fleste pasientene i brasiliansk sentrale øst-regionen hvor T. cruzi
infeksjon er vanligvis forbundet med mega syndromer [1, 3]. TCI har blitt pekt ut som den viktigste årsaken til gjenoppvåknende sykdom hos mennesker i det nordlige Sør-Amerika, basert på genotyping for fin-skala oppløsning av den geografiske fordelingen, ved hjelp av et stort panel av polymorfe mikro markører [4]. I de senere år har utbrudd av akutte Chagas sykdom ved oral infeksjon er rapportert i Venezuela [5, 6], Colombia [7, 8] og i den brasilianske Amazon [9, 10], hvor TCI er utbredt og en liten prosentandel har vært identifisert som TcIV.
Metacyclic trypomastigotes er innblandet i de ovennevnte omtales tilfeller av oral T. cruzi
infeksjon. Basert på tilstedeværelsen av amastigote reir innenfor deler av gastrisk mucosa, men ingen bevis for T. cruzi
invasjon i orofarynks og øsofagus av dyr utfordret oralt med insekt-avledede metacyclic former, ble invasjonen av gastrisk mukosal epitelium foreslått å være en unik inngangsport for systemisk T. cruzi
infeksjon [11]. Eksperimenter med TCII og TcVI stammer fra chagasic pasienter har vist at de metacyclic stadium-spesifikke overflatemolekyler gp82 og gp90, som virker som promotor og inhibitor av target celle invasjon, henholdsvis [12, 13], spille sentral rolle i oral infeksjon [14, 15]. Gp82, som selektivt binder seg til gastrisk mucin [16] er sterkt konservert mellom genetisk divergerende T. cruzi
slektsnavn [17] og er resistent mot fordøyelse av pepsin ved sur pH, mens gp90-isoformer med differensial følsomhet for peptisk fordøyelse kan uttrykkes i forskjellige stammer, slik at høyt eller lavt infektivitet ved den orale rute er forbundet med ekspresjon av pepsin-følsomme eller pepsin-resistente gp90 isoform [14, 15]. Enten et slikt mangfold i gp90 uttrykk og muntlig smittsomhet er også funnet i TCI og TcIV DOE'er gjenstår å bli undersøkt. Det er ingen informasjon om eksperimentell oral smitte av disse parasittene, tilgjengelige data viser til mus injisert med blod trypomastigotes eller metacyclic skjemaer ved intraperitonealt [18] som er en unaturlig modus for infeksjon. Her analyserte vi metacyclic trypomastigotes av TCI og TcIV stammer isolert fra chagasic pasienter i forskjellige geografiske regioner, med hensyn til gp82 og gp90 uttrykk, evnen til å migrere gjennom mage mucin lag og for å invadere gastrisk mukosal epitelium ved oral administrering i mus. For å klargjøre mekanismene for parasitt invasjon, in vitro
celle invasjon analyser ble utført ved å bruke humane epitelceller. Som overflateantigenene spontant felle fra vevskultur-avledet trypomastigotes [19] er blitt rapportert å spille en rolle i T. cruzi-infeksjon
[20], undersøkte vi hvorvidt overflatemolekyler ble frigjort ved metacyclic former og påvirket vertscelle-invasjon.
Metoder
Parasitter og vertscelle invasjon analysen
Trypanosoma cruzi
stammer fra Trypanosomatid Culture Collection (TCC), Institutt for parasittologi, Universidade de São Paulo, ble vennlig levert av Dr. Marta MG Teixeira. De ble isolert fra chagasic pasienter i ulike geografiske regioner: TCC: 28 (Amazon, Brasil), TCC: 515 (Venezuela), TCC: 588 (Guatemala), TCC: 1522 (Paraíba, Brasil), TCC: 1434 (Amapá, Brasil ). Stammer 28, 515, 588 og 1522 var TCI og påkjenning 1434, isolert fra et individ infisert ved oral administrering, var TcIV. Som en kontroll, ble CL stamme (TcVI) som brukes i flere eksperimenter. Parasitter ble opprettholdt syklisk hos mus og i leveren infusjon tryptose medium. For å stimulere differensiering, ble parasitter dyrket i en passasje i TC100 (Vitrocell, Brasil) eller Grace medium (Invitrogen) og metacyclic formene ble renset ved passasje gjennom DEAE-cellulosekolonne som beskrevet [21]. HeLa-celler, humane carcinom-avledede epitelceller, ble dyrket ved 37 ° C i Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM), supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS), streptomycin (100 ug /ml) og penicillin (100 U /ml) i en fuktet 5% CO 2 atmosfære. Celle invasjon analyser ble utført som beskrevet andre steder [22], ved poding rensede metacyclic trypomastigotes på hver brønn av 24-brønners plater inneholdende 13 mm-diameter runde dekkglass belagt med 1,4 x 10 5 HeLa-celler, enten i DMEM med 10 % FCS (D10) eller i PBS ++ (PBS som inneholder per liter: 140 mg CaCl 2, 400 mg KCl, 100 mg MgCl 2.6H 2o, 100 mg magnesiumsulfat 4.7H 2o, 350 mg NaHCO 3). Etter 1 time inkubering med parasitter, ble de like dekkglass fiksert i Bouin oppløsning, farget med Giemsa, og sekvensielt dehydrert i aceton, en gradert serie av aceton: xylol (9: 1, 7: 3, 3: 7) og xylol. Antallet intracellulære parasitter ble talt i totalt 250 celler.
Oral infeksjon
Fem til seks uker gammelt BALB /c mus, avlet i dyre anlegget på Universidade Federal de São Paulo, ble brukt. Alle prosedyrer og eksperimenter dannet med regulering av den institusjonelle Etisk komité for dyreforsøk, og studien ble godkjent av komiteen (Protocol No 0234/12). Mus ble infisert med T. cruzi
metacyclic formene via oral vei (5 x 10 7 parasitter i 0,1 ml PBS pr dyr), ved hjelp av en ml sprøyte med gavage kanyle som ble innført i dyret munn. For påvisning av parasitter i mucosal gastriske epitel, ble magen av mus inokulert oralt med metacyclic former oppsamlet 4 dager etter infeksjon, fiksert med 10% nøytralt formaldehyd i 24 timer. Etter behandling av gradvis dehydrering i en gradert serie av etanol løsning, etterfulgt av xylen nedsenking og innstøping i parafin, serie 5 mikrometer vevssnitt ble kuttet og farget med hematoxylin og eosin. I et annet sett av eksperimenter ble metacyclic former gitt oralt i mus (1 x 10 6 parasitter i 0,1 ml PBS pr dyr) og med start på dag 10 post-inokulering, parasittemi ble overvåket to ganger i uken ved å undersøke 5 pl blodprøver oppsamlet fra hale, ved fasekontrastmikroskop. Ved 30 dagers post-infeksjon ble mage, hjerte og lever samlet og behandlet for histologiske preparater, som ovenfor beskrevet.
Assay av parasitt migrering gjennom mage mucin lag
Polykarbonat Transwell-filtre (3 um porer, 6,5 mm diameter , Costar) ble belagt med 50 ul av et preparat inneholdende 10 mg /ml gastrisk mucin i vann. Metacyclic former, suspendert i 600 ul PBS, ble tilsatt til bunnen av 24-brønners plater (1 x 10 7 parasitter /brønn), ble mucin-belagte Transwell filtre plassert på parasitt-inneholdende brønner og 100 ul PBS var tilsatt til filterkammeret. Etter 30 min og /eller 1 timers inkubasjon ved 37 ° C, ble 10 ul prøver samlet opp fra filterkammeret for parasitt-telling.
Strømningscytometri og indirekte immunfluorescens assays
Levende metacyclic trypomastigotes (1 x 10 7 ) ble inkubert på is i 1 time med monoklonalt antistoff 3 F6 eller 1G7, rettet henholdsvis til metacyclic stadium-spesifikke overflatemolekyl gp82 eller gp90. Deretter ble de parasitter fiksert med 4% para-formaldehyd i 20 min. Etter vaskinger i PBS ble inkubert med parasitter Alexa Fluor 488-konjugert anti-IgG i 1 time ved romtemperatur og antallet fluorescerende parasitter ble beregnet med en BD AccuriTM C6 Flowcytometer. Kontroll parasitter ble inkubert med sekundært antistoff bare. For å visualisere HeLa-celle lysosomer, Dekkglass med adherente celler ble inkubert i 1 time ved 37 ° C i D10 eller i PBS ++, eller ble inkubert med parasitter i D10 i 1 time. Etter fiksering med 4% p-formaldehyd i PBS i 30 minutter, ble cellene behandlet med 50 mM NH 4Cl i PBS i 30 minutter og vasket i PBS. Cellene ble deretter inkubert i 1 time ved romtemperatur med muse-anti-human LAMP2 fortynnet 1: 8 (v /v) i en PBS-løsning inneholdende 0,15% gelatin, 0,1% natriumazid og 1% saponin (PGN-Saponin). Etter vaskinger i PBS, ble objektglassene inkubert i 1 time med Alexa Fluor 568-konjugert anti-mus IgG (Invitrogen), fortynnet 1: 300 i PGN-Saponin inneholdende 500 ng /ml phalloidin-FITC og 10 ug /m DAPI (4- ', 6'-1-diamino-2-fenylindol-dihydroklorid), etterfulgt av vaskinger i PBS og etterfølgende montering av dekkglass på forlenge gull (Invitrogen). Confocal bilder ble kjøpt i en Leica TCS SP8 laser-scanning mikroskop (Leica, Tyskland) ved hjelp av en olje nedsenking Plan-Apochromat 63X objektiv (numerisk apertur 1.4). Serien med bilder hentet fra confocal z-stabler ble behandlet og analysert ved hjelp av Leica LAS AF (Leica, 2012, Tyskland) og Imaris (bitplan) programvare.
Utarbeidelse av parasitten kondisjonert medium
Metacyclic former (10 8) ble inkubert ved 37 ° C i 1 time i 100 pl komplett medium D10, næringsmangel PBS ++ eller PBS. Etter sentrifugering, ble pelleten kastet og supernatanten (kondisjonerte medium) ble oppsamlet. For bruk i celle invasjon analyser kondisjonert medium ble fortynnet 1: 100 i D10 eller PBS ++ og Western blot 10 pl ble lastet
Produksjon og rensing av rekombinant gp82 protein
rekombinant protein inneholder. full lengde T. cruzi
gp82 sekvens (GenBank TM data base, sjonsnummer L14824) i ramme med glutation S-transferase (GST), ble produsert i E. coli
DH5-α og renset som detalj andre steder [23].
Statistisk analyse
Student t
test, som implementert i GraphPad programvare (versjon 6.01), ble ansatt.
Resultater
Oral infeksjon av mus med T. cruzi
metacyclic former
evne TCI parasitter for å infisere mus ved oral administrering ble undersøkt i et sett av forsøk. Førti-mus ble delt i 8 grupper på fem dyr. I ett sett av forsøk, med sikte på å kontrollere invasjonen av gastrisk epitelium ved metacyclic trypomastigotes, ble 4 grupper anvendt, og hver gruppe av fem mus mottok en annen parasitt-stamme (5 x 10 7 parasitter pr dyr). Fire dager etter oral administrering, ble magen av mus samlet inn og behandlet for histologiske preparater. Et høyt antall parasitter ble anvendt i dette tilfelle, fordi i tidligere studier med Tci stamme G, fra vill overføringssyklus, har vi funnet at selv med en høy inokulum svært få amastigote reir, som tilsvarer intracellulary replikerende amastigotes, kunne påvises ved 4 dag etter oral smitte. Til tross for den store podestoff, kunne vi ikke påvise amastigote reir ved mikroskopisk analyse av histologiske deler av magesekken (tabell 1). Et annet sett av eksperimenter ble utført for å finne ut om det var noen forskjell i vev tropisme mellom T. cruzi
stammer. For dette formål ble de gjenværende 4 grupper anvendt, og hver gruppe av fem mus mottok en annen parasitt-stamme (1 x 10 6 parasitter pr dyr), og forløpet av infeksjonen ble fulgt i 30 dager. Med start på dag 10, ble parasittemi-nivået to ganger i uken, og ved dag 30 i magesekken, ble hjerte og lever samlet for histologisk analyse. I dette tilfellet inokulumet var mindre fordi vi begrunnet at, etter flere runder med celle invasjon og intracellulær replikasjon, ville amastigote reir være detekterbar. Parasittemi var detekterbar i løpet av observasjonsperioden, men infeksjon ble bekreftet i alle grupper ved påvisning av amastigote rede i maven og /eller i hjertet hos mus (Tabell 1), men ikke i leveren. Av notatet var at i magen hos mus infisert med stamme 1522, som stammer fra en kronisk chagasic pasient med sluttstadiet hjertesvikt [24], parasitter ble funnet i hjertet, men ikke i magen, mens den motsatte påført til infeksjon av stamme 28 (tabell 1). Amastigote reir var tilstede ved et høyt antall i magen hos enkelte mus infisert med stammen 28 eller 588 (tabell 1) antagelig et resultat av flere runder med invasjon og intracellulær replikasjon i det gastriske epitel. Det faktum at parasittene ikke ble påvist i mus magen på 4 dagen etter oral administrasjon, men bare på et senere tidspunkt, etter intracellulære replikering sykluser, foreslo enten en ineffektiv migrasjon av metacyclic former gjennom slimlaget, ineffektiv invasjon av målet epitelceller og /eller intracellulær parasitt multiplikasjon. I tillegg til TCI stammer, undersøkte vi en TcIV belastning, 1434, hentet fra en muntlig smittet pasient. Amastigote reir, i et lite antall, ble påvist i tre mus på fjerde dag etter infeksjon i histologiske snitt i magesekken, men parasitter ble ikke funnet i magesekken eller i hjertet 30 dager etter infeksjon (tabell 1). Parasitemia var negativ i løpet av 30 dagers infeksjon. Positiv hemoculture bekreftet smitte av alle stammer. Histologiske preparater ble også kontrollert for nærværet av inflammatoriske prosesser. Uavhengig av parasitt-stammen, inflammatoriske foci var knapt synlig i magen på dag 4 eller 30 post-infeksjon, eller midt på dagen 30.Table en oral infeksjon av mus med metacyclic former av T. cruzi
strainsa
T. cruzi
belastning product: (opprinnelse)
Mouse
Amastigote reir (antall vevssnitt)
mage (dag 4)

magen (dag 30)
Heart (dag 30)
28 product: (Brasil Amazon)
1 0 (20)
0 (20)
0 (20)
2
0 (20)
60 (20)
0 (21)
3
0 (20)
285 (20)
0 (20)
4
0 (20)
11 (18)
0 (23)
5
0 (20)
NDB
0 (20)
515 plakater (Venezuela)
1 0 (21)
0 (24)
0 (20)
2
0 (19)
0 (13)
0 (25)
3
0 (20)
0 (21)
0 (23)
4
0 (20)
45 (11)
0 (21)
5
0 (20)
5 (21)
0 (24)
588 product: (Guatemala)
1
0 (09)
31 (19)
10 (21)
2
0 (12)
17 (18)
0 (20)
3
0 (09)
6 (20)
3 (15)
4
0 (12)
87 (19)
0 (19)
5
0 (16)
990 (20)
0 (16)
1522
(Brasil Nordøst)
1 0 (16)
0 (17)
0 (20)
2
0 (19)
0 (15)
4 (20)
3
0 (20)
0 (17)
0 (20)
4
0 (21)
0 (20)
6 (20)
5
0 (21)
0 (16)
4 (18)
1434
(Brasil Amazon)
1 5 (40)
0 (18)
0 (20)
2
3 (40)
0 (24)
0 (20)
3
0 (36)
0 (20)
0 (20)
4
0 (35)
0 (20)
0 (21)
5
5 (40)
0 (20)
0 (21)
aMetacyclic former av de angitte parasitt stammer ble gitt oralt til mus. I ett eksperiment, mus mottok 5 x 107 parasitter og 4 dager senere ble magen samlet inn for histologiske preparater. I et annet eksperiment, fikk mus 1 x 106 parasitter og 30 dager senere, ble magen og hjertet samlet for histologiske preparater
b ND ikke
bestemt
Migrering av T. cruzi
metacyclic former gjennom gastrisk mucin lag
en analyse for å etterligne parasitten translokasjon gjennom slimlaget i magen ble utført ved anvendelse av trans~~POS=TRUNC filtre belagt med gastrisk mucin, som er den viktigste makromolekylære komponent av slim. Tidligere studier hadde vist at TcVI metacyclic former, som effektivt invadere gastrisk epitelium når den administreres oralt til mus, traversere gastrisk mucin-belagte transwell filter så effektivt som det åpne filteret, og denne egenskap er assosiert med ekspresjonen av pepsin-resistent G82 molekyl som selektivt binder seg til mage mucin [16, 25]. Gastrisk mucin-belagte Transwell filtre ble plassert på toppen av brønner inneholdende metacyclic former. Etter 30 og 60 minutters inkubering ved 37 ° C ble antallet av parasitter som nådd den øvre kammer telles. TCI parasitter vises redusert evne til å migrere gjennom den gastriske mucin lag, sammenlignet med stamme CL (TcVI) som tjente som kontroll (Fig. 1a), som bekrefter at mage mucin fungerte som en barriere for migrering. Metacyclic former TcIV belastning 1434 krysset mage mucin-belagt filtre mer effektivt enn TCI parasitter, men likevel til lavere priser enn CL belastning (Fig. 1a). Vi undersøkte uttrykk for gp82 og sin motstand mot pepsin i TCI og TcIV stammer. Metacyclic formene ble behandlet i 1 time med 2 mg /ml pepsin i citrat-løsning ved pH 3,5, en tilstand som sterkt nedbrutt BSA (Fig 1 b.), Og vaskemiddeloppløselige ekstrakter ble analysert ved hjelp av Western blot, sammen med ubehandlede parasitter, ved anvendelse av monoklonalt antistoff (mAb) 3 F6 rettet mot gp82. Før reaksjon med mAb 3 F6, ble lik belastning av parasitten prøvene sjekket av Ponceau-S farging (tilleggsfiler 1: Figur S1 A). Uttrykk av gp82, som ble bevart intakt etter pepsin behandling, var lik i alle stammer, tilsynelatende på noe høyere nivåer i belastning 1434 enn i TCI stammer (Fig. 1b). Ettersom dette kan forklare den høyere spredningsevne av stamme 1434, sammenlignet vi gp82 ekspresjon av denne stamme som for CL-stamme som effektivt gjennomløpt gastrisk mucin-belagte filter (Fig. 1a). Gp82 uttrykk var sammenlignbare i 1434 og CL stammer (tilleggsfiler 1: Figur S1B øvre panel). Tilstedeværelsen av gp82-molekyler på overflaten av parasitten ble bekreftet ved strømningscytometri-analyse (Fig. 1c). For ytterligere å undersøke om belastningen 1434 uttrykte høyere gp82 nivåer enn TCI stammer, ble Western blot analyse gjentatt ved bruk av belastning 515 som en representant for TCI avstamning. MT prøver av de to stammene, tilberedt på samme dag og elektroforese i samme SDS-PAGE gel, viste lignende profil (tilleggsfiler 1: Figur S1C). Fra alle disse data og ytterligere FACS-analyse av de to stammene, som viser litt høyere gp82 nivåer i stamme 1434 (Tilleggs fil 1: Fig S1D), er det ikke mulig å konkludere med at den relative effektivitet av stamme 1434 metacyclic former i migrere gjennom den gastriske mucin lag er på grunn av den differensielle ekspresjonen av gp82. Som T. cruzi
er kjent for å spontant frigi overflatemolekyler [19, 20, 26], parasitt-skur molekyler kan også være ansvarlig for de observerte effektene. Vi sjekket om gp82 ble utgytt i mediet under en h inkubasjon i PBS, tilstand brukes i mage mucin migrasjon analysen. Western blot-analyse av supernatanten etter parasitten fjerning, oppnådd som beskrevet i metodedelen, viste at stammer 515 og 1434 skur betydelige mengder gp82, i motsetning til CL-stamme, som ble utgitt gp82 på knapt påvisbare nivåer, mens gp90 ble skur på et høyt nivå av stammen 515, og ved meget lave nivåer av stammene 1434 og CL (fig. 1 D). Dersom molekylene differensielt utgitt av stammene 515, 1434 og CL faktisk interferere med parasitten migrasjon gjennom mucin gastrisk pelsen, som ville forklare den høye og lave effektiviteten av stammer CL og 515, henholdsvis, så vel som det mellomliggende egenskaper som oppvises av belastning 1434 (fig. 1a). Et eksperiment for å demonstrere innvirkningen av frigjort gp90 på stammen 515 migrering ble utført ved å anbringe gastrisk mucin-belagt Transwell filtre på toppen av brønner inneholdende metacyclic former alene, eller blandet med anti-gp90 mAb 5E7 som ikke gjenkjenner levende parasitter eller blandet med ikke-relaterte mAb 2C2 rettet til T. cruzi
amastigote molekyl [27]. Etter 30 og 60 minutters inkubasjon, ble prøver fra filterkammeret tatt for parasitt telling. Parasitter blandet med anti-gp90-mAb 5E7, men ikke de som er blandet med irrelevant mAb 2C2, løpes gastrisk mucin belegg ved høyere tall enn kontroll parasitter (fig. 1e), noe som indikerer at skur gp90 interfererer med parasitten migrasjon gjennom ukjent mekanisme som ikke involverer binding, forutsatt at gp90 ikke binder seg til gastrisk mucin [28]. Forstyrrelser av gp82, som ikke kunne påvises fordi anti-gp82 mAb 3 F6 binder seg til å leve parasitter, ville være forståelig fordi det binder seg til mage mucin. Vi undersøkte også om gp90 og gp82 ble ulikt utgitt i nøytral og sur pH. Kondisjonert medium oppnådd fra metacyclic former av stammen 515 inkubert i PBS, pH 7,2, eller i citratbuffer, pH 3,5, ble analysert ved hjelp av Western blot. Offentliggjøring av gp82 var lik på begge pH, mens gp90 Shedding var lavere ved sur pH (tilleggsfiler 1: Figur S1B nedre panel). Fig. 1 Migrering av gp82-uttrykke T. cruzi
metacyclic former gjennom mage mucin laget. en Transwell filtre belagt med mage mucin ble plassert på brønner som inneholder de angitte parasitt stammer. Prøver ble samlet opp fra filterkammeret på 30 min og 60 min for parasitt telling. Verdier er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. I forhold til CL-stamme, en betydelig lavere migrering av TCI stammer (** P
< 0,0005) og TcIV stamme 1434 (* P
< 0,005) ble observert ved 60 min. b Metacyclic former, ubehandlet (-) eller behandlet (+) med 2 mg /ml pepsin ved pH 3,5, ble analysert ved Western blot ved anvendelse av mAb F6 3 rettet mot gp82. Som kontroll av pepsin aktivitet, er BSA farget med Coomassie-blått vist. c Levende parasittene ble inkubert på is i 1 time, i fravær eller i nærvær av mAb 3 F6. Etter fiksering ble parasittene inkubert med Alexa Fluor 488-konjugert anti-IgG og antallet fluorescerende parasitter ble estimert. d Parasitter ble inkubert i 1 time i PBS. Etter sentrifugering for å fjerne parasitter, ble den betingede PBS analysert ved Western blotting ved hjelp av mAb 3 F6 og mAb 5E7, rettet mot gp82 og gp90 hhv. e Transwell filtre belagt med mage mucin ble plassert på brønner som inneholder metacyclic former for belastning 515 alene, eller i nærvær av anti-gp90 mAb 5E7 som ikke gjenkjenner levende parasitter eller urelatert mAb 2C2. Etter 30 og 60 minutters inkubasjon, ble prøver fra filterkammeret tatt for parasitt telling. Verdiene er middelverdi ± variasjon av dubletter
vertscelle invasjon av T. cruzi
metacyclic former
Redusert kapasitet av metacyclic former i invaderende gastrisk epitelium ved oral administrering til mus som er blitt assosiert med ekspresjon av pepsin-resistente gp90 ved høye nivåer, og korrelerer med dårlig infektivitet mot dyrkede humane epitelceller [14, 15]. Vi undersøkte evnen til TCI og TcIV metacyclic skjemaer å angi vertsceller. Parasitter ble inkubert med HeLa-celler i 1 time i fullnærings DMEM og antall intracellulære parasitter ble tellet. Lav invasjon kapasiteten var et felles trekk ved alle stammer, TcIV belastning 1434 belastningen stiller høyere effektivitet enn TCI stammer (Fig. 2a). Western blot-analyse, ved anvendelse av monoklonalt antistoff rettet mot gp90, viste at alle parasitter uttrykt pepsin-resistente gp90 (fig. 2b). Tilstedeværelsen av gp90 på parasitt overflaten ble kontrollert ved flowcytometri analyse i stammer 515 og 1434. I gjentatte analyser ved hjelp av ulike parasittprøver, gp90 ble funnet på mye lavere nivåer i belastning 1434 (fig 2c, Gjeste fil 1:. Figur S1E). Vi forventet en høyere celle invasjon kapasitet belastning 1434 fordi den observerte profilen til gp90 er lik som CL belastning metacyclic former (tilleggsfiler 1: Figur S1B øvre panel), som ikke er anerkjent av anti-gp90 monoklonale antistoffer (mAbs), gp90 å være synlig i vaskemiddel ekstrakt av Western blot. Fig. 2 Host celle invasjon av gp90-uttrykker T. cruzi
metacyclic former. a HeLa-cellene ble inkubert i 1 time med de indikerte parasitt-stammer i fullnærings DMEM. Etter fiksering og Giemsa-farging ble antallet av intracellulære parasitter tellet i totalt 250 celler. Verdier er gjennomsnitt ± SD av fire uavhengige forsøk utført i duplikat. I forhold til CL belastning, en betydelig lavere invasjon av stammer 28, 588 og 1522 (*** P
< 0,0005), stamme 515 (** P
< 0,001) og belastning 1434 (* P
< 0,005) ble oppdaget av Student t
test. b Metacyclic former, ubehandlet (-) eller behandlet (+) med 2 mg /ml pepsin ved pH 3,5, ble analysert ved Western blot ved anvendelse av anti-gp90-mAb 1G7. Som kontroll av pepsin aktivitet, er BSA farget med Coomassie-blått vist. c Levende parasittene ble inkubert på is i 1 time, i fravær eller i nærvær av mAb 1G7. Etter fiksering ble parasittene inkubert med Alexa Fluor 488-konjugert anti-IgG og antallet fluorescerende parasitter ble estimert
Virkning av overflatemolekyler utgitt av T. cruzi
metacyclic former i vertscellen invasjon
Vi har fastslått hvorvidt gp82 og gp90 ble felt inn i mediet i løpet av 1 time inkubering i komplett D10, det vil si, under forutsetning anvendes i cellen invasjon analysen. Western blot-analyse av det kondisjonerte medium, fremstilt som beskrevet i metodedelen, avslørte at gp90 ble felle ved de høyeste nivåene av stammen 515, og ved de laveste nivåer ved belastning CL, mens gp82 frigivelse av stammene 515 og 1434 var tydelig visualisert men var knapt synlig i CL-stamme supernatant (fig. 3a). Deretter testet vi muligheten for at invasiv kapasitet metacyclic skjemaer ble påvirket av gp90 sluppet inn i mediet. CL belastnings metacyclic formene ble inkubert i 1 time med HeLa-celler i D10 medium alene eller i D10 pluss 1% av kondisjonert medium av 515-stamme, preinkubert med eller uten anti-gp90 mAb 1G7 eller med irrelevant mAb 2C2. CL stamme ble brukt på grunn av dens høyere celle invasjon kapasitet og manglende omsetning med mAb 1G7. Som vist på fig. 3b, kondisjonert medium betydelig redusert parasitten invasjon, dens hemmende aktivitet ble stort sett nøytralisert av anti-gp90 mAb 1G7, men ikke av urelaterte mAb 2C2. Antagelig den gp82 stede i kondisjonert medium også bidratt til den observerte hemmende effekt, men dette var vanskelig å påvise fordi anti-gp82 mAb som ikke gjenkjenner levende parasitter er ikke tilgjengelig. I HeLa celler inkubert i D10 i 30 min med metacyclic former for belastning 515 eller 1434, det var noen spredning av lysosomer (Fig. 3c) som måtte følge av interaksjon med gp82 sluppet til medium. Det rekombinante gp82-protein har vist seg å indusere lysosomet spredning til cellen periferien [29], og hendelse som kulminerer i exocytose og bidrar til parasitophorous vakuolen formasjon som kreves for T. cruzi
invasjon [30-32]. Fig. 3 Effekt av gp90 utgitt av T. cruzi
metacyclic former i vertscellen invasjon. Fig. Som vist på fig. Fig.

• Systematisk gjennomgang og meta-analyse av laparoskopisk og åpen gastrektomi for avansert mage cancer
• Serum CD26 nivåer hos pasienter med magekreft: en roman diagnostisk markør